OBC/SF復合軟骨支架的制備及性能

馬 倩， 王 可， 王曙東,,， 朱立成， 馬丕波， 朱玲玲(. 鹽城工業職業技術學院 紡織服裝學院，江蘇 鹽城 4005；. 武漢紡織大學 湖北省紡織新材料及其應用重點實驗室，武漢 4000；.江南大學 生態紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 4)

研究與技術

OBC/SF復合軟骨支架的制備及性能

馬 倩1， 王 可1， 王曙東1,2,3， 朱立成2， 馬丕波3， 朱玲玲1
(1. 鹽城工業職業技術學院 紡織服裝學院，江蘇 鹽城 224005；2. 武漢紡織大學 湖北省紡織新材料及其應用重點實驗室，武漢 430200；3.江南大學 生態紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

采用TEMPO/NaBr/NaClO體系對細菌纖維素(BC)進行氧化改性，然后以氧化細菌纖維素(OBC)、絲蛋白(SF)作為基礎材料，負載骨形態發生蛋白(BMP-2)，經電凝膠技術制備負載BMP-2的OBC/SF復合水凝膠。通過掃描電鏡(SEM)、孔隙率、力學性能、體外降解率測試對所制備的復合水凝膠進行表征，將軟骨細胞種植于負載BMP-2的OBC/SF復合水凝膠支架上進行體外聯合培養，觀察軟骨細胞在支架中的增殖情況。結果表明：該OBC/SF復合水凝膠是一種具有細膩、疏松的雙網絡孔隙結構，良好的降解性能、優異的力學性能，適合細胞增殖的骨組織工程支架材料；BMP-2的加入有誘導軟骨細胞分化，維持軟骨細胞特點的作用。

BMP-2；細菌纖維素；氧化；絲蛋白；水凝膠；電凝膠技術

隨著人類社會的老齡化及高能、高速創傷的不斷增多，軟骨組織缺損和軟骨組織退行性病變的問題日益突出[1]。近年來，采用組織工程學的方法，將軟骨細胞或生長因子種植于具有良好生物相容性、高機械強度的可降解生物支架材料上進行體外聯合培養形成軟骨模塊，然后植入軟骨缺損處來修復軟骨損傷的技術為軟骨缺損的修復提供了新途徑[2]。軟骨組織工程支架作為軟骨細胞外基質的替代物，是軟骨組織工程的基礎，理想的細胞支架有利于植入細胞在其上的黏附、增殖及促進基質分泌，完成軟骨復合體的再生。選擇合適的材料以盡可能綠色環保的工藝正確制備結構、性能符合要求的支架材料，對于實現細胞支架的作用和功能具有重要意義[3]。

目前，天然生物材料如膠原蛋白、絲蛋白(silk fibroin, SF)、彈力蛋白、細菌纖維素(bacterial cellulose, BC)等，由于來源廣泛、綠色環保，生物相容性好，細胞黏附性好，能促進軟骨細胞生長、代謝，使軟骨細胞分化、增殖形成新軟骨，從而成為軟骨組織工程的研究熱點[4-10]。但是，SF水凝膠的力學性能較差，易脆[11]；BC是由超細纖維網絡層層堆疊而成，這種獨特的結構使得BC的力學性能呈各向異性，即垂直于纖維層的方向(沿厚度方向)壓縮模量較低，纖維素中的水分在受力時容易擠出，溶脹性能不易恢復，而且BC過于致密的結構及光滑的表面也會影響細胞在其上的黏附、增殖[12]。目前有研究報道，以SF與BC作為原料，將兩者的功能性相結合可制備性能優異的生物工程支架。賴琛等[13]采用N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺作為交聯劑，將經羧基化改性的BC和SF交聯復合可形成復合材料用于人工小口徑血管，但化學交聯劑的加入勢必會影響BC和SF復合材料的生物相容性能。因此，以綠色、環保的方式制備出生物相容性好、可降解、微觀結構孔徑材料組分可調控的高強度生物工程支架顯得尤為重要。

本研究首先采用TEMPO/NaBr/NaClO氧化體系選擇性地將BC中C6位的羥基氧化成羧基，然后以氧化細菌纖維素(oxidized bacterial cellulose, OBC)、SF作為基礎材料，負載骨形態發生蛋白-2(bone morphogenic protein, BMP-2)，經電凝膠技術以制備得到負載BMP-2的OBC/SF復合水凝膠，探討其作為構建組織工程軟骨支架的可行性。

1 試 驗

1.1 材料、藥品和儀器

蠶繭(江蘇富安繭絲綢有限公司)，木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus ATCC53582)(American Type Culture Collection)，培養基所需酵母浸膏、胰蛋白胨與瓊脂粉(中國醫藥集團上海化學試劑有限公司)，培養基所需其他試劑，如TEMPO、NaClO(有效氯≥10%)、NaBr、Na2CO3、CaCl2、NaOH、無水乙醇、體積分數為75%的酒精、HCL等均為分析純(上海國藥集團)，Ham F12培養液(Thermo Fisher 公司)，BMP-2細胞生長因子、胰蛋白酶、Π型膠原酶、PBS粉劑(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，截留分子量為3.5 kDa的透析袋(上海源葉生物科技有限公司)；3月齡新西蘭兔12只(蘇州大學實驗動物中心)。

MIR-H263-PC型CO2恒溫培養箱(日本SNYNO公司)，FD-1A-50冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)，HD5000萬能材料試驗機(南通宏大實驗儀器有限公司)，S-4700型掃描電鏡(FESEM)(日本Hitachi公司)。

1.2 方 法

1.2.1 BC膜的制備及處理

以木葡糖酸醋桿菌為菌種，配制液態種子培養基、木葡糖酸醋桿菌斜面培養基、發酵培養基，所有培養基均在121 ℃滅菌20 min。取種子培養基及活化過的菌種斜面，用接種環挑取兩環菌種接入液體培養基中，整個過程無菌操作。將培養基搖勻后，放入溫控搖瓶柜中，在30 ℃，轉速為160 r/min下培養24 h。取培養完成的種子液以一定的接種量接入發酵培養基中,30 ℃恒溫靜置培養10 d，在培養基和空氣的交界面生成凝膠狀BC膜。將凝膠狀BC膜取出，用去離子水沖洗后，浸入0.5 mol/L的NaOH水溶液中，在80 ℃溫度下處理2 h，再浸入去離子水中處理，以除去殘存的菌體和培養基，得到厚度為2 cm的透明凝膠狀BC膜，121 ℃滅菌20 min后室溫保存。

1.2.2 OBC的制備

將0.005 g TEMPO和0.05 g NaBr溶于100 mL水中，加入質量為0.187 g的BC，靜置半小時后，用0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH值至10.5。將1 mL(26 mmol/g)pH值調節至10.5的NaClO溶液加入上述溶液開始反應，反應過程中控制反應溶液pH值穩定在10.5左右，室溫下反應至溶液pH值不再下降后加入5 mL乙醇終止反應。取出制備的OBC反復用蒸餾水浸泡清洗以去除殘存的化學試劑，之后放入冰箱4 ℃冷藏。

1.2.3 BMP-2/SF溶液的制備

將計量蠶繭用0.05% Na2CO3溶液以1︰50的浴比在100 ℃下煮沸30 min，重復三次，放在室溫通風處晾干，即得絲素。將脫膠后的絲素纖維以1︰10的浴比分批加入摩爾比為1︰2︰8的CaCl2-C2H5OH-H2O三元溶液中，置于(76±2) ℃的水浴鍋內恒溫攪拌，直至完全溶解，過濾、透析得到質量分數為3%的SF溶液。在SF溶液中加入5 mL含BMP-2(400 ng/mL)的F12完全培養液，混合均勻，形成SF的質量分數為90%的BMP-2/SF溶液。

1.2.4 SF水凝膠的制備

將所制備的質量分數為3%的SF溶液裝入圓柱形模具中，置于37 ℃的恒溫水浴鍋中直至凝膠。

1.2.5 負載BMP-2的OBC/SF復合水凝膠的制備

將制備的OBC置于BMP-2/SF溶液中，在制備的OBC中插入正電極銅棒，在BMP-2/SF溶液插入負電極銅棒，施加15 V的直流電壓，經電凝膠技術制備得到負載BMP-2的OBC/SF復合水凝膠。正常狀態下，絲素蛋白水溶液中無規卷曲結構所占比例較高，施加電場使得絲素蛋白水溶液中電源正極附近的pH值小于蛋白質的等電點，導致無規卷曲結構轉變為β-折疊結構，并逐漸交聯形成SF水凝膠[14]。負載BMP-2的OBC/SF復合水凝膠的制備方法如圖1所示。

圖1 OBC/SF復合水凝膠的制備方法示意Fig.1 Illustration of the preparation of the OBC/SF composite hydrogel

1.2.6 軟骨細胞的培養、處理

首先進行兔關節軟骨細胞的分離、培養、傳代，在37 ℃，5% CO2恒溫箱中培養；然后對各組樣品進行滅菌處理，將各組樣品經高壓蒸汽滅菌后置于24孔培養板孔中；最后收集傳代3代以內的軟骨細胞，用F12培養液制成1×106/mL的細胞懸液，種植到各組水凝膠樣品上，置于37 ℃，5% CO2恒溫箱內進行體外復合培養。

1.3 性能表征

1.3.1 孔隙率測定

理想的生物支架材料應具備三維多孔結構及合適的孔隙率。這樣，在保證支架具備足夠力學強度的前提下，既可為細胞的生長提供足夠的空間，也可為細胞生長所需營養成分的滲入提供條件。一般孔隙率達到90%左右的生物工程支架可滿足要求。參照文獻[15]的方法測定各組支架的孔隙率。濕重測量：將各組樣品置于真空凍干機中干燥72 h，凍干后的樣品置于裝有蒸餾水的燒杯中浸泡48 h吸水，取出樣品吸干表面的水分進行稱重。浮重測量：取裝有1 000 mL蒸餾水的燒杯，將邊緣帶鐵絲掛鉤的平板放在分析天平的托盤上，使掛鉤浸入蒸餾水中，將邊緣打孔的各組樣品掛在平板的掛鉤上進行稱重。孔隙率計算公式如下：

(1)

1.3.2 壓縮與拉伸性能測試

利用HD5000萬能材料試驗機對各組水凝膠樣本進行壓縮與拉伸性能測試，試驗均在室溫下進行，試驗時應變速率均設置為10%/min。進行壓縮試驗時，樣品的形狀是圓柱形(直徑為10 mm，厚度為5 mm)，將試樣放入上下平行的兩塊金屬壓板間進行測試。進行拉伸試驗時，樣品的形狀為啞鈴型(銷的寬度為2 mm，厚度為2 mm，長度為10 mm；鈴的寬度為10 mm，厚度為2 mm，長度為7 mm)，將試樣兩端分別固定于上下夾頭進行測試。壓縮、拉伸試驗的失效點為應力-應變曲線的最大值點，壓縮、拉伸模量為應力-應變曲線直線部分的斜率。

1.3.3 軟骨細胞增殖檢測

細胞支架復合物培養7 d，每日各組中取4孔標本，剪切成小塊，取軟骨細胞支架復合體用0.25%胰蛋白酶消化，臺盼藍染色，進行活細胞計數，取平均值作圖，繪制細胞生長曲線。

1.3.4 體外降解性測定

參照文獻[16]的方法，采用失重率來評估各組支架的體外降解性。將凍干的各組樣品切成10 mm×10 mm×10 mm的立方體塊，稱重為W1，然后將其浸沒在盛有50 mL、pH7.4 PBS緩沖液的錐形瓶中，放入37 ℃恒溫箱中培育，每天更換緩沖液。分別在0、3、7、14、21、28、35、42、49 d時，用濾紙進行過濾，將濾渣用去離子水清洗后凍干稱重，計為W2。支架材料的失重率計算公式如下：

(2)

2 結果與分析

2.1 FE-SEM結果

圖2為BC、OBC、SF與OBC/SF支架的FE-SEM照。由圖2可以看出，SF支架呈現較為平整、光滑的片狀結構，孔徑較大，孔與孔之間呈斷裂狀態；BC則體現出由纖維交錯而成的精細納米網絡結構，結構致密，孔徑較小、較為均勻，孔之間連通性較好；OBC保持了BC的纖維網絡結構，但表面形態更為疏松、多孔，纖維單根狀態更為清楚；而將OBC與SF復合后，明顯改善了SF支架與BC支架的缺點，支架整體呈現細膩、疏松的雙網絡孔隙結構，孔徑適宜而均勻，孔之間連通性好。

圖2 BC、OBC、SF與OBC/SF支架的FE-SEM照Fig.2 FE-SEM images of BC, OBC, SF and OBC/SF scaffolds

2.2 孔隙率測定結果

各組樣品孔隙率的測定結果如圖3所示。由圖3可以看出，BC支架的孔隙率為89%，OBC支架的孔隙率為91%，SF支架的孔隙率為95%，OBC/SF支架的孔隙率為96%，因此，各組支架的孔隙率都較高。氧化改性過程沒有明顯提高BC支架的孔隙率，這間接反映出TEMPO/NaBr/NaClO體系沒有影響BC原有的三維多孔結構。而OBC與SF復合后，同BC、OBC支架相比，OBC/SF支架孔隙率顯著增大。

圖3 BC、OBC、SF與OBC/SF支架的孔隙率Fig.3 Porosity of BC, OBC, SF and OBC/SF scaffolds

2.3 壓縮與拉伸性能測試結果

各組樣品壓縮與拉伸性能測試的測定結果如表1所示。由表1可以看出，BC呈現出高拉伸強度和彈性模量，經氧化改性后，OBC支架的力學性能略受影響。這主要是由于氧化改性將部分BC纖維單體上的羥基氧化成羧基，使得纖維間的部分無定形區域被溶解，但并未改變BC纖維間特有的超細三維網絡結構的網狀結構所致。SF的力學性能取決于其所含的三種結構(無規卷曲結構、silkⅠ結構及β-折疊結構(silkⅡ結構))的比例。表1還可看出，SF拉伸性能及壓縮性能欠佳、脆性大。分析認為是由于凝膠過程使SF所含無規卷曲或silkⅠ結構轉變為β-折疊結構，使得SF所含β-折疊結構比例較高所致。OBC/SF支架較BC支架、SF支架而言，拉伸與壓縮性能均顯著提高，壓縮模量、壓縮應力、拉伸模量、拉伸強度分別高達1.6、3.6、23.1、2.9 MPa。這是因為氧化使得OBC纖維間結構較疏松，SF分子易于通過空隙進入纖維素結構的內部。一方面OBC的羧基與SF上的氨基間形成了共價鍵，另一方面OBC與SF復合形成了細膩、疏松的雙網絡孔隙結構，OBC的三維網絡結構包圍SF分子，起到了增強、增彈的作用；SF分子填充了OBC的空隙，改善了纖維素中的水分在受力時容易擠出的缺點，從而提高了復合材料的壓縮性能。因此，OBC/SF支架的力學性能在結合了BC、SF性能優勢的基礎上又進一步提高。

表1 BC、OBC、SF與OBC/SF支架力學性能測試結果Tab.1 Test results of mechanical properties of BC, OBC,SF and OBC/SF scaffolds

2.4 軟骨細胞增殖檢測結果

各組樣品支架上細胞生長曲線如圖4所示。檢測結果表明，軟骨細胞在BC、OBC、SF支架上的生長速度無明顯差別。BC支架細胞倍增時間為4.5 d，OBC支架與SF支架細胞倍增時間為4 d。BC經過氧化改性后，細胞在OBC上的增殖情況略有改善。較BC、OBC、SF支架而言，OBC/SF支架對軟骨細胞的黏附、增殖及擴散顯著提高，細胞倍增時間為3 d。這一結果可歸因于復合支架細膩、疏松的雙網絡孔隙結構，大小適宜而均勻的孔結構及孔之間較好的連通性，這樣的結構更利于細胞的吸附、遷移及增殖。圖5為軟骨細胞在單純的OBC/SF支架及添加了BMP-2的OBC/SF支架上培養7d后的FE-SEM照片。與單純的OBC/SF支架相比，軟骨細胞在加入BMP-2的OBC/SF支架上生長較好，細胞緊密排列、融合成片，顯示出較好的分化特點，證實了BMP-2有誘導軟骨細胞分化、維持軟骨細胞特點的作用[17]。

圖4 軟骨細胞在BC、OBC、SF與OBC/SF支架上的生長曲線Fig.4 Growth curves of cartilage cells on BC, OBC, SF and OBC/SF scaffolds

圖5 軟骨細胞在加入BMP-2前后的OBC/SF支架上培養7d后的FE-SEM照Fig.5 FE-SEM images of cartilage cells on OBC/SF scaffolds before and after the addition of BMP-2

2.5 體外降解測試結果

BC、OBC、SF和OBC/SF支架材料的失重曲線如圖6所示。由圖6可以看出，BC在PBS溶液中的降解非常緩慢，質量幾乎沒變。與BC相比，OBC的體外降解速率明顯較快，這主要是由于BC的C6位上羥基被氧化為羧基，使得BC更易于吸收PBS溶液而溶脹、降解所致。此外，OBC的羧基加速了OBC的水解。圖6還可以看出，SF支架的降解速度與OBC相當，明顯快于BC支架的降解速度，這是由于SF支架中含有易溶于水的無規卷曲結構、silkⅠ結構所致。比較OBC/SF和OBC、SF的降解情況，可以看出，在初始階段OBC/SF支架的降解率小于OBC支架與SF支架的降解率，這可歸因于OBC的羧基與SF上的氨基間所形成的共價鍵的存在[18]；在后期階段OBC/SF支架的降解率顯著上升，超過OBC支架及SF支架的降解率，這主要是因為氧化改性有利于BC對SF溶液的吸收，OBC/SF支架中OBC的水解使得OBC的羧基與SF上的氨基間所形成的共價鍵斷裂，進而加快了OBC/SF支架降解的速度。

圖6 BC、OBC、SF與OBC/SF支架在PBS中的降解Fig.6 Degradation of BC, OBC, SF and OBC/SF scaffolds in PBS

3 結 論

本研究首先采用TEMPO/NaBr/NaClO體系對BC進行氧化，然后以OBC、SF作為基礎材料，負載BMP-2，經電凝膠技術制備得到負載BMP-2的OBC/SF復合水凝膠。結果表明，將力學性能互補的SF與OBC復合，改善了SF水凝膠力學性能較差、易脆的缺點及BC垂直于纖維層方向壓縮模量較低、結構過于致密、表面過于光滑的不足。該負載BMP-2的OBC/SF復合水凝膠具有細膩、疏松的雙網絡孔隙結構，孔隙率高，孔徑適宜、均勻，孔徑連通性好；力學性能良好；體外降解性能良好；細胞黏附、增殖能力較好，適合作為軟骨修復支架。

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Preparationandperformanceofoxidizedbacterialcellulose/silkfibroincompositecartilagescaffold

MAQian1,WANGKe1,WANGShudong1,2,3,ZHULicheng2,MAPibo3,ZHULingling1
(1.College of Textile and Clothing, Yancheng Vocational Institute of Industry Technology, Yancheng 224005, China;2. Key Laboratory of Hubei New Textile Material & Application, Wuhan Textile University, Wuhan 430200, China;3. Key Laboratory of Eco-Textiles, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214112, China)

The bacterial cellulose was modified by TEMPO/NaBr/NaClO-mediated oxidation. The oxidized bacterial cellulose/silk fibroin (OBC/SF) composite hydrogel containing bone morphogenic protein (BMP-2) for cartilage repair was prepared by gel electrophoresis. The prepared composite hydrogel was characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM), porosity, mechanical testing and in-vitro degradation. The chondrocytes were grown on the prepared OBC/SF composite hydrogel scaffold for in-vitro culture. The growth of the chondrocytes on the composite scaffold was observed. Results show that the prepared OBC/SF composite hydrogel is an ideal scaffold for bone tissue engineering, with fine and loose double network structure, appropriate degradability, excellent mechanical properties and native environment for cell proliferation. Besides, the addition of BMP-2 contributes to the differentiation of chondrocytes and helps to maintain the characteristics of chondrocytes.

BMP-2; bacterial cellulose; oxidation; silk fibroin; hydrogel; gel electrophoresis

TQ340.64

A

1001-7003(2017)10-0018-06 < class="emphasis_bold">引用頁碼

頁碼: 101104

10.3969/j.issn.1001-7003.2017.10.004

2016-12-19;

2017-09-01

江蘇省高校自然科學基金項目(16KJB540005)；湖北省紡織新材料及其應用重點實驗室開放課題(Fzxcl2017016)；生態紡織教育部重點實驗室(江南大學)開放課題(KLET1601)；江蘇省鹽城市農業科技指導性計劃項目(YKN2016012、YKN2016013)；江蘇高校品牌專業建設工程資助項目(PPZY2015C254)；鹽城工業職業技術學院院級重點課題(ygy201501)；江蘇省高校優秀中青年教師境外研修計劃項目(蘇教師〔2014〕24號)；江蘇省高等學校大學生創新創業訓練計劃項目(201713752017X)