自噬在大鼠肝再生中作用的初步探討

尹 麗，徐存拴

(1. 河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉 453007;2.河南省-科技部共建細胞分化調控國家重點實驗室培育基地(河南師范大學)，河南 新鄉 453007;3. 漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002)

自噬在大鼠肝再生中作用的初步探討

尹 麗1,2,3，徐存拴1,2*

(1. 河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉 453007;2.河南省-科技部共建細胞分化調控國家重點實驗室培育基地(河南師范大學)，河南 新鄉 453007;3. 漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002)

自噬對肝再生有積極的作用，但具體作用機制仍有待闡明。為了解自噬在大鼠肝再生的變化和機理，通過蛋白質組學(iTRAQ方法)檢測了大鼠肝再生中調控自噬的信號通路相關蛋白和自噬過程相關蛋白的變化。結果表明，調控自噬的PI3K/Akt，mTOR，AMPK均被激活，泛素-蛋白酶體相關蛋白發生顯著表達變化，溶酶體相關膜蛋白和水解酶發生顯著變化。IPA分析發現，自噬在肝再生的啟動階段和進展階段上調。根據研究結果，提出線粒體和溶酶體共存假說，并初步探討并圖示其存在的可能性和機理。

肝再生；自噬；泛素蛋白酶體；線粒體自噬；線粒體溶酶體共存

在正常情況下，大部分肝細胞處于G0期，很少分裂，但是當受到某些機械、病毒、藥物等刺激時，G0期細胞可以進入G1期，啟動細胞周期。大鼠進行2/3肝切除后，剩余肝臟仍可代償性的長到原來大小，并恢復其功能，這個過程稱為肝再生(liver regeneration，LR)。很多激素、細胞因子、蛋白、信號通路參與肝再生過程，迄今為止，對肝再生過程還沒有非常明確的了解，尤其是啟動和終止階段[1-3]。

溶酶體是廣泛存在于真核細胞中對細胞功能有重要作用的細胞器，自噬(autophagy)是溶酶體介導的降解受損或冗余細胞成分為小分子物質的過程，降解后的物質可以被重新利用。這些功能主要是溶酶體膜蛋白和內腔中的酸性水解酶類來執行的。迄今為止，發現至少50種溶酶體酸性水解酶[4]，這些水解酶直接行使催化功能，但溶酶體膜蛋白的作用也極其重要，比如，維持溶酶體內酸性環境，選擇性的運輸需要被降解的物質，介導溶酶體膜和其他膜的融合等[5]。自噬參與了機體很多重要的生理過程，如細胞發育、分化、衰老、死亡等[6-7]。越來越多的證據表明，自噬和人類的一些疾病和腫瘤發生有很大關系[8]。所以，自噬在細胞和機體的生命中扮演著重要角色。

關于肝再生與自噬的研究已有不少報道[9-13]，研究發現，正常小鼠70%肝切除后，發生積極自噬而免于細胞老化，并通過維持健康的線粒體形態刺激線粒體代謝，通過氧化磷酸化為肝再生提供能量[14]。還有研究發現，肝再生早期，線粒體通透性沒有明顯改變，而24 h之后內膜通透性降低，氧化磷酸化偶聯增強，效率提高[15]。為了解大鼠2/3肝切除肝再生與自噬的關系，自噬相關信號通路及相關蛋白在肝再生不同時間點的變化，并闡明其機制，本研究借助同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)結合質譜(mass spectrometry，MS)方法檢測了大鼠肝再生2、6、12、24、30和36 h等6個時間點自噬相關蛋白的表達變化，并分析了他們的表達模式和相互作用及其與肝再生的關系。根據實驗結果本文提出溶酶體和線粒體可能有共存的形式，且從分子水平闡釋其存在的可能機理。除了自噬，真核細胞還有一種降解蛋白質的系統，現已有研究發現兩種蛋白降解體系之間有著某種聯系[16-19]，但是機理有待研究。本文首次在蛋白水平分析了大鼠肝再生自噬與泛素介導的蛋白酶體途徑之間可能的聯系。對自噬和肝再生的研究對闡明肝再生的過程有重要的意義，并且可以對肝病的治療提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 蛋白質組檢測與數據分析

實驗Sprague-Dawle(SD)成年健康雄性大鼠由河南師范大學實驗動物中心提供，體重210～250 g。在控制溫度(20±3℃)，相對濕度(60±10%)，光照時間(8∶00-20∶00)條件下，實驗大鼠可以自由飲水，攝食。取上述大鼠78只分為13組，每組6只，其中6組假手術(operation control, OC)，6組肝切除(partial hepatectomy, PH)，1組正常對照normal control group (NC)。參照實驗室以前的方法構建大鼠2/3肝切除模型。簡單來說，乙醚吸入法麻醉大鼠，腹部消毒，無菌條件下從劍突下方約1～2 cm處沿腹中線向上開腹至劍突，同時壓迫大鼠兩側肋骨，將占全肝重68%的肝左，中葉擠出腹腔外，結扎蒂部，沿結扎線外側切除肝葉，縫合切口，撒上磺胺以防感染。于固定時間取上述0、2、6、12、24、30、36 h的PH大鼠，乙醚吸入法麻醉，75%酒精消毒腹部皮膚，“十字”打開腹腔，取肝右葉?；旌厦拷M6只大鼠的肝組織置于液氮保存備用。SO組不進行肝切除，其他同PH組。

蛋白提取及iTRAQ8標同位素標記和肽段分離，方法詳見文獻[20]。概括說，組織樣品加入500 μL SDT裂解液，勻漿后，進行超聲和沸水浴裂解，離心取上清，BCA方法蛋白質定量后，-80℃冰箱保存。FASP酶解，OD280肽段定量。各組樣品肽段分別取約80 μg, 按照AB公司試劑盒:iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進行標記。將標記后的所有肽段混合。 樣品采用AKTA Purifier 100 (GE Healthcare)液相系統進行分離。每份樣品經毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質譜儀(Thermo Finnigan)進行質譜分析。具體為：分析時長為60 min，檢測方式為正離子；母離子掃描范圍為300～1 800 m/z；一級質譜分辨率為70 000 at m/z 200； AGC target為3e6；一級Maximum IT為10 ms；Number of scan ranges為1，Dynamic exclusion為40.0 s。多肽和多肽的碎片的質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描(full scan)后采集10個碎片圖譜(MS2 scan)為MS2 Activation Type為HCD；Isolation window為2 m/z；二級質譜分辨率為17 500 at m/z 200； Microscans為1；二級Maximum IT為60 ms；Normalized collision energy為30eV；Underfill ratio為0.1 %。質譜分析原始數據為RAW文件，查庫時將RAW文件通過Proteome Discoverer提交至Mascot服務器，選擇已經建立好的數據庫，然后進行數據庫搜索。采用Proteome Discoverer1.4軟件對肽段報告離子峰強度值進行定量分析。以混合樣品通道標簽為內參，各組蛋白質的iTRAQ比值均采取各通道標簽與內參的比值(ratio 值)。當ratio 值≥對照2倍時，認為蛋白發生有意義表達上調，當ratio 值≤對照0.5倍，認為蛋白發生有意義表達下調。

以“autophagy”為關鍵詞在NCBI、GENEONTOLOGY、CAGP，GENMAPP、KEGG、QIAGEN和RGD等網站進行搜索，確認大鼠自噬相關基因和信號通路，有異議的進一步查閱文獻進行確認。經查詢確定mTOR，AMPK，PI3K/AKT，p53和Hedgehog等5條信號通路與自噬相關[21-25]，并把自噬分為溶酶體、自噬、自噬調節和線粒體自噬4個生理過程。

1.2 統計與作圖

Cluster3.0和Treeview進行熱圖分析。具體為，將表達譜數據整理成txt文本文件，導入Cluster3.0軟件，對gene和array進行聚類，選擇Average linkage并生成cdt文件。把cdt文件導入Treeview軟件生成層次聚類圖。將iTRAQ檢測的自噬及調節它們的信號通路的肝再生相關蛋白表達數據上傳至IPA軟件內置的Ingenuity? Knowledge Base數據庫進行Heatmap分析[26]。

2 結果與分析

iTRAQ檢測到大鼠肝再生自噬相關蛋白共64種，其中，mTOR，AMPK，PI3K/AKT，p53和Hedgehog 共5條信號通路與溶酶體、自噬、自噬調節和線粒體自噬等生理活動相關蛋白分別為4、12、35、18、6、6、1、4、3種。PSMD2、PSMA1、GFEF等蛋白上調顯著，IL6、GAA、PARL等下調顯著。對64種自噬相關蛋白聚類發現，第1聚類主要是6個時間點變化不是很明顯，僅12 h有輕微下調的蛋白。第2聚類主要是幾乎全部上調蛋白，且有些蛋白上調顯著。第3聚類主要是30 h變化差異的蛋白。第4聚類主要是下調的蛋白。第5聚類主要是30和36 h表達下調，和前4個時間點不一致的蛋白如圖1所示。

圖1 大鼠肝再生自噬相關蛋白聚類分析Fig.1 The clustering analysis of proteins associated with autophagy in LR

根據文獻，本文把檢測的6個時間點劃分為兩個階段[27]。0～6 h為肝再生啟動階段，6～36 h為進展階段。各蛋白表達變化及所參與的信號通路及各信號通路之間的聯系如圖2所示。

肝切除后的低ATP狀態，激活AMPK信號通路。而AMPK信號通路通過兩條途徑對自噬產生作用。一是直接磷酸化抑制raptor從而解除其對ATG1的抑制，誘導自噬。二是直接磷酸化ATG1，誘導自噬。另外，AMPK信號通路可以通過FOXO途徑影響ATG8，影響自噬。AKT通過對TSC1/2的抑制作用，解除后者對Rheb的抑制，從而激活mTORC1復合體，最終抑制自噬的發生。Hedgehog信號通路和肝再生有著非常重要的關系，但是具體機制仍不明確，其可能通過EIF2AK3和EIF2A影響自噬，而本文未檢測到這兩種蛋白的變化。另外，GFER明顯表達增多，和26S蛋白酶體相關的蛋白表達異常。所檢測到的溶酶體內的酶，除GAA外，其余幾乎都上調，溶酶體膜蛋白LAMP1，LAMP2皆表達增強。線粒體自噬相關蛋白OPA1表達明顯上調，而OPA1是維持線粒體內膜完整性和電位差的重要的蛋白，這可以推測線粒體自噬沒有大量發生。

圖2 自噬相關蛋白之間的聯系Fig.2 The relationship of the proteins associated with autophagy

根據圖3IPA結果可見，和自噬相關的5條信號通路中，有4條信號發生了有意義變化，其中，2條活性增強，即AMPK信號通路在大鼠肝再生的2～36 h信號轉導活性增強，PI3K/Akt信號通路在大鼠肝再生的12、30 h信號轉導活性增強。1條活性減弱，即p53信號通路在大鼠肝再生的2、6、24、30、36 h信號轉導活性減弱。1條在不同時間點的變化不同，即mTOR信號通路在大鼠肝再生的2、6、30、36 h信號轉導活性增強，在12 h信號轉導活性減弱。

圖3 自噬及相關信號通路相關蛋白表達變化預示的自噬及信號轉導活性Fig.3 The comparison of canonical pathway and signaling pathways associated with autophagy

注：橙色為自噬反應活動增強，藍色為自噬反應活動減弱。

3 討 論

在正常條件下，自噬的發生處于基礎水平，但是在饑餓、低氧、胞內壓力、高溫、生長因子或激素缺乏等條件下，自噬急劇上升，以應對胞內ATP和構件分子的缺乏[28-29]。對細胞來說，維持自噬的基礎水平非常重要，因為破損或衰老的細胞器，折疊錯誤的蛋白質在體內的聚集都會產生嚴重的后果，所以通過自噬的消除作用，提供能量的同時，還可以重新利用一些消化后的產物，維持細胞穩定[8]。大鼠2/3肝切除后，ATP含量迅速降低。而剩余肝臟在短時間內就可以重建，這個過程受到非常復雜的調控，各種激素，信號分子等參與其中，幾乎所有的生化代謝過程都受到影響。

IPA分析結果可以發現，和自噬相關的信號通路除p53減弱外，而其余信號通路幾乎多不同程度的被激活，自噬也反應活動增強。p53可能通過兩個途徑對自噬發揮作用，一個是核內調控轉錄因子，一個是調控線粒體[30-34]，而以往所認知的p53和自噬的關系究竟是不是通過調控下游因子DRAM現在也受到一些挑戰[35]，這都有待進一步研究。Hedgehog信號通路作為最早發現的和肝再生相關的信號通路，其具體機制至今不是很清楚。它和自噬有著一定的聯系，但具體的中介連接分子也不很確定[21， 36-38]。

線粒體自噬是自噬一種特殊形式，可以選擇性降解功能障礙線粒體。自噬不足和過度都會導致細胞損傷和死亡。OPA1(optic atrophy 1)是核基因編碼的線粒體蛋白，在維持內膜嵴的完整，呼吸鏈的完整等方面起著非常作用，而這直接和氧化磷酸化產生ATP相關[39-40]。OPA1在肝再生的6個時間點都發生明顯上調，尤其是進展階段。高表達的OPA1對線粒體的融合很重要，這也可以推測線粒體在肝再生中維持著良好的形態和功能，并沒有形成大量片段化，而線粒體片段化對自噬是必需的，這應該和肝再生階段大量的能量需求有著很重要的關系。在正常線粒體膜電位下，PARL(presenilin-associated rhomboid-like)會切割PINK1(PTEN induced putative kinase 1)，一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，但在線粒體膜電位降低時，PARL則會切割PGAM5 (phosphoglycerate mutase family member 5)，也就是說PARL會根據線粒體的狀態選擇不同的切割對象，因此它是一種比較獨特的可以感應細胞壓力的駐線粒體磷酸酶[41]。本文發現，PGAM5在2、24、36 h下調，其余時間點未發生變化。這可以推測肝切除后線粒體并未發生明顯損傷，膜電位正常。

和肝再生與線粒體生成都有關系的肝再生增強因子ALR(augmenter of liver regeneration)在肝再生的整個階段都高表達[42-43]，尤其是進展階段。而其表達降低阻礙線粒體生成，也會誘發細胞凋亡[44]。大鼠2/3肝切除后的6 h內ATP一直處于下降狀態[14]，而肝再生需要大量ATP供應[45]，作為機體能量的發電站，線粒體功能直接影響ATP的供應。溶酶體跨膜蛋白LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1)在肝再生的所有時間點均上調，這對溶酶體膜的完整，pH的維持和正常代謝起到非常重要的作用的作用。另外溶酶體中參與肝素等代謝的GNS(glucosamine (N-acetyl)-6-sulfatase),GLB1(galactosidase) CD81(cluster of differentiation 81)，INPP5B(inositol polyphosphate-5-phosphatase B)，CRAT(carnitine acetyltransferase)，GLB1(Galactosidase, beta 1)，ACTB(beta-actin)在肝再生整個階段都明顯上調。溶酶體內水解糖原的GAA(glucosidase)在2、12 h下調其余時間點沒變化。GAA缺乏可能會因為溶酶體和細胞質之間形成滲透壓梯度而導致溶酶體腫脹。而GAA基因敲除小鼠自噬泡增加，自噬功能改變。巧合的是，骨骼肌raptor(mTORC1復合體的重要亞基)基因敲除小鼠的表型與GAA非常相似[46]，預示兩者之間在自噬方面可能存在某些聯系。溶酶體內氨基酸水平的改變導致自噬泡H+-ATP酶構象改變， mTORC1從細胞質到溶酶體遷移。有趣的是，mTORC1的上游激活劑Rheb也會在溶酶體膜上出現，并且受生長因子刺激而激活。在生長因子刺激的Rheb活性和氨基酸誘導的mTORC1的募集，共同導致mTORC1的充分活化。因此，考慮到GAA敲除小鼠溶酶體的腫脹，mTORC1的激活可能是對正常的溶酶體功能喪失的一種妥協。

綜合上述分析，線粒體自噬在大鼠肝再生中起到非常重要的作用。大鼠肝切除后，合成活動旺盛，需要大量的能量供應。和能量相關的AMPK信號通路激活，以對抗這種應激狀態。而和自噬直接相關的溶酶體膜蛋白和大量酸性水解酶表達上調，線粒體內膜相關蛋白表達增強，意味著線粒體功能并未受到大的影響，根據以上分析，本文提出一個設想，溶酶體和線粒體可以融合共存。也就是內體溶酶體和自噬體融合后，并未發生傳統的線粒體完全被消化，而是像十幾億年前的原真核細胞吞噬原線粒體一樣，線粒體內膜與溶酶體外膜共存，這無論從能量和節約體內物質成分，還是從快速提供能量上，都不失為一種合理的存在方式，示意圖如圖4(a)所示，其共存機理如圖4(b)所示。線粒體內外膜間隙為酸性環境，而溶酶體內也是酸性環境，這就為它們的共存提供了可能。線粒體內膜電子傳遞鏈不斷向膜間隙泵出電子，產生電位差。膜間隙的酸性環境對于酸性水解酶的催化作用必不可少，而水解后的成分轉運出共存體，可以滿足肝再生的需要，而H+向線粒體基質中的回流又可以產生ATP供機體需要。這樣也就不難理解泛素-蛋白酶體的相關蛋白、溶酶體膜蛋白、線粒體膜蛋白等的不同尋常的表達變化。值的注意是GFER在其中究竟起了什么作用還不得知，但它的表達變化卻暗示著其和肝再生的關系或許與此有關。

韓淑媛等[47]研究發現，肝切除后15 h左右，溶酶體數量和體積明顯增加，許多細胞器衰退，唯獨溶酶體數量增加并形成多種形式的自噬體，這表明細胞進入S期前，結構更新加速，溶酶體自噬增加，以清除這些衰退結構，這是細胞增殖的必要前提條件?？娒饔赖萚15,48]對肝再生中線粒體變化的長期研究發現，肝再生中線粒體通過降低線粒體內膜的通透性繼而增強氧化磷酸化來適應再生中的能量需求，并且提出可以有兩個方面增強線粒體功能，一是表達合成大量與氧化磷酸化有關的蛋白質提高ATP產能，但這會消耗很多ATP。二是直接調節線粒體內膜性質，呼吸鏈結構或內環境來提高氧化磷酸化的效率。顯然，第2種比較合理。而線粒體溶酶體共存假說可以解釋這個問題。早期，溶酶體外膜和線粒體外膜融合或把線粒體外膜降解，那么溶酶體本身含有的內含物和酶可以直接把物質降解成小分子跨越線粒體內膜進入線粒體，但是這個時候因為氧氣下降，所以呼吸鏈功能不會太強，而溶酶體內部的酸性環境直接可以提供質子濃度梯度，從ATP合酶進入內膜，合成ATP，所以這個時候ATP不會下降太多。而后期24 h之后，隨著功能的恢復，線粒體功能逐漸恢復，呼吸鏈恢復正常。已有實驗證實，通過降低pH人為的加在線粒體膜質側一個質子質量分數，即使缺少氧化型底物，也能合成ATP[49]。翟心慧等[50]研究發現，輔酶Q10在肝再生增值期有明顯促進線粒體氧化磷酸化功能，且效果和劑量正相關，其中以pH后48 h最明顯。依共存理論，肝再生初期，ATP生成溶酶體建立的質子梯度對ATP的生成起了重要的作用，那么前期添加CoQ10對氧化磷酸化的影響不顯著而后期顯著(后期線粒體內膜通透性恢復)就不難理解了。

圖4 溶酶體和線粒體共存及可能性Fig.4 The hypothesis of coexistance of lysosome and mitochondrion and the mechanism of coexistence of lysosome and mitochondria

泛素-蛋白酶體(the ubiquitin-proteasomes system，UPS)和自噬作為真核細胞兩個最主要的蛋白降解系統，尤其本文發現UPS相關蛋白表達異常，很有必要分析下它和自噬及肝再生的相互聯系。蛋白酶體降解得到的3～25個氨基酸殘基的寡肽或多肽，最終要經由溶酶體降解[16-17]。研究發現，UPS抑制劑可以誘導自噬，這可能是作為UPS系統的一種補償作用[16, 18]。如果UPS系統被抑制，短壽命和錯誤折疊蛋白質會增多，最終導致細胞毒性。持續的氨基酸缺乏導致蛋白質合成受阻，最終導致細胞凋亡。低氨基酸濃度會影響到mTOR信號通路，導致自噬活動增強。研究發現，大鼠2/3肝臟切除后，PSMA1，PSMD2，PSMB8在0～36 h明顯上升甚至幾百倍。PSMC5，PSMD3則在0～36 h一直明顯下調。PSMA3則在0～24 h明顯上升，30～36 h下調。這都顯示26S蛋白酶體在大鼠2/3肝切除后發揮了重要作用。這一方面可能與受損肝臟產生大量受損蛋白需要清除有關，另一方面可能和肝切除后細胞增殖需要大量的氨基酸原料有關系，也可能參與溶酶體本身的構建。

4 結 語

大鼠肝切除后，能量的大量需求和組織損傷形成一種矛盾，而自噬可以在一定程度上解決這個問題。根據能量需求和自噬相關蛋白的表達變化，本文提出酶體和線粒體可以融合共存假說。無論從能量和節約體內物質成分，還是從快速提供能量上，都不失為一種合理的存在方式。如果本文提出的線粒體溶酶體共存假說成立，將對理解細胞功能和細胞器進化都有一定的啟發作用。

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Preliminaryresearchontheroleofautophagyinratliverregeneration

YIN Li1,2,3, XU Cunshuan1,2*

(1.CollegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,Henan,China; 2.StateKeyLaboratoryCultivationBaseforCellDifferentiationRegulationandHenanBioengineeringKeyLaboratory(HenanNormalUniversity),Xinxiang453007,Henan，China; 3.LuoheMedicalCollege,Luohe462002,Henan,China)

Autophagy affects the liver regeneration (LR). However, the detailed mechanism remains to be elucidated. In order to explore the change and mechanism of autophagy in rat LR, we detected the expression changes of proteins in the signal pathways which regulate autophagy and the proteins associated with autophagy process by isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) combined with mass spectrometry (MS). The results indicated that the PI3K/Akt, mTOR and AMPK signaling pathways were activated. The ubiquitin-proteasome-related proteins and the membrane proteins and hydrolases associated with lysosome changed significantly. Autophagy up-regulated at the priming and progression stage in LR by the analysis from IPA. We proposed the hypothesis that lysosomes and mitochondria might coexist and explore the possible mechanism about that kind of coexistence.

liver regeneration; autophagy; ubiquitin-proteasomes system (UPS); mitophagy; coexistence of mitochondria and lysosome; ATP release

Q2

A

1672-5565(2017)03-156-08

10.3969/j.issn.1672-5565.20161222001

2016-12-22;

2017-03-10.

國家自然科學基金(31201093);國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2012CB722304).

尹麗，女，副教授，研究方向：肝再生的分子機理; E-mail：vcourse@163.com.

*通信作者：徐存拴，男，教授，博士生導師，研究方向：肝再生的分子機理；E-mail：xucs@x263.net.