雷帕霉素預處理對大鼠肢體缺血－再灌注肺損傷的影響

袁志軍，唐斌，羅振中，黃丹

（1.江西省分宜縣中醫院，江西新余336600；2.南昌大學第二附屬醫院，江西南昌336600）

雷帕霉素預處理對大鼠肢體缺血－再灌注肺損傷的影響

袁志軍1，唐斌2，羅振中2，黃丹2

（1.江西省分宜縣中醫院，江西新余336600；2.南昌大學第二附屬醫院，江西南昌336600）

目的探討雷帕霉素預處理對大鼠肢體缺血－再灌注肺損傷的影響，為臨床應用及預防提供理論參考。方法將60只健康雄性SD大鼠采用隨機數字表法均分為對照組（C組）、肢體缺血－再灌注組（I/R組）、雷帕霉素預處理組(R組)3組，各20只。所有動物缺血前12 h禁食，自由飲水，麻醉后固定于操作臺，于右側腹股溝處切開皮膚，暴露股動脈、股靜脈和股神經；C組僅分離股動脈、股靜脈和股神經；I/R組和R組用無創血管夾于接近腹股溝韌帶處夾閉股動脈，迫使大鼠雙后肢缺血2 h，后取去血管夾使得再灌注3 h；R組于下肢缺血前灌胃雷帕霉素。應用超聲血流儀監測血流，以未監測到血液流動為缺血，監測到血液流動為再灌注的指標；再灌注3 h后處死大鼠，心臟取血2 mL，離心取血清，硫代巴比妥法測定丙二醛（MDA）的濃度，酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測白細胞介素（IL）－1 、IL－6和腫瘤壞死因子－ （TNF－ ）的濃度；取肺組織計算干濕比及行免疫組化觀察肺組織病理學結果。結果與C組比較，I/R組肺W/D、血清MDA，IL－1 ，IL－6和TNF－ 水平均明顯升高(P＜0.01)，與I/R組比較，R組肺W/D，血清MDA，IL－1 ，IL－6和TNF－水平均明顯降低(P＜0.05)；光鏡下C組大鼠的肺組織紋理結構尚完整，肺泡間隔均勻一致，見少量炎性細胞浸潤，肺泡腔清楚可見；I/R組大鼠肺泡上皮細胞增生，肺間質明顯增生，肺泡壁增厚，可見大量的炎性細胞浸潤，毛細血管明顯擴張充血，肺泡壁及肺泡間質中可見大量中性粒細胞；R組大鼠肺組織病理改變較I/R組明顯減輕，炎性細胞浸潤明顯減少，僅有少量紅細胞滲出。結論雷帕霉素預處理可減輕肢體缺血－再灌注誘發肺損傷，其機制可能與抗氧化應激和抗炎反應有關。

雷帕霉素；肢體缺血－再灌注；肺損傷

肢體缺血－再灌注損傷是臨床常見的病理過程，壓迫止血帶的臨床應用、冠狀動脈粥樣硬化致血栓的形成等因素均可引起下肢缺血－再灌注[1－3]。雷帕霉素(rapamycin，RPM)是放線菌培養液中分離的大環內酯類抗生素，最早作為一種抗真菌藥物被研究。20世紀初，由美國食品藥物管理局（FDA）批準，其又成為應用于器官移植抗排斥反應的一種安全性較高的新型免疫抑制劑[3]。RPM可結合哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR），通過不同的細胞因子受體阻斷信號傳導，特異性抑制mTOR，阻斷T淋巴細胞及其他細胞由G1期至S期的進程，抑制細胞增殖，降低誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的穩定性，進而減少細胞內一氧化氮的生成[4]，從而發揮免疫抑制效應[5]。RPM還可以通過抑制mTOR誘導自噬，從而有助于正常的細胞代謝[6]。有研究表明，在體內和體外的相關疾病模型中，RPM均能明顯抑制小膠質細胞的活化和腫瘤壞死因子－α(TNF－α)水平的下調，從而阻止細胞的程序性死亡[7－8]。近期研究表明，RPM在腎臟缺血－再灌注及肝臟缺血－再灌注損傷中具有保護作用，但是否對肢體缺血－再灌注肺損傷具有保護作用尚不清楚。本研究中通過利用大鼠肢體缺血－再灌注肺損傷模型，探討RPM預處理對肢體缺血－再灌注大鼠肺損傷的影響，以期為臨床RPM的藥物應用預防治療缺血－再灌注肺損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組

60只健康雄性SD大鼠(編號為S20785)，體質量200～250 g，由南昌大學實驗動物科學部提供。采用隨機數字表法分為對照組（C組）、肢體缺血－再灌注組（I/R組）、雷帕霉素預處理組(R組)，各20只。

1.2 建模型

所有大鼠缺血前12 h禁食，自由飲水，腹腔內注射10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司，國藥準字H37022673，規格為3 mL/kg)麻醉，麻醉生效后固定于操作臺。在右側腹股溝處切開皮膚，暴露股動脈、股靜脈和股神經。C組僅分離股動脈、股靜脈和股神經，不做任何操作。于大鼠雙后肢股三角區切開皮膚，分離股動脈、股靜脈；I/R組和R組用無創血管夾于近腹股溝韌帶處夾閉股動脈，使雙后肢缺血2 h再灌注3 h。采用超聲血流儀監測血流以保證肢體缺血－再灌注成功實施，以未監測到血流為缺血，監測到血流為再灌注的標準。R組于下肢缺血前灌胃給藥雷帕霉素[武漢德美凱生物科技有限公司，CAS號為53123－88－9，規格為10 mg/(kg·d)]，最后1次于術前2 h灌胃。I/R組和C組于下肢缺血前給等量生理鹽水灌胃，作為陰性對照。

1.3 觀察指標與方法

再灌注3 h時，心臟放血處死大鼠，開胸，用注射器經心尖部刺入心臟，緩慢抽血液2 mL，離心，取血清，采用硫代巴比妥法測定丙二醛（MDA）的濃度，采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測白細胞介素（IL）－1β、IL－6和腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的濃度。采集血樣后，取右肺上葉組織，常規進行石蠟包埋、切片和HE染色，光鏡下(×100)觀察肺組織病理學結果。取右肺下葉組織，沖洗干凈后，吸干表面水分，用干燥錫紙包裹標本，取肺組織約100 mg，于分析天平上測定濕重(W)，后于120℃下烘烤8 h后稱取其干重(D)，計算并比較肺W/D比值。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差(s)表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察指標

與C組比較，I/R 組肺W/D（t＝3.53，P＝0.01），血清MDA（t＝4.41，P＝0.00），IL－1β（t＝4.01，P＝0.01），IL－6（t＝5.93，P＝0.03）和TNF－α（t＝4.92，P＝0.00）水平均明顯升高；R組肺W/D（t＝3.12，P＝0.03），血清MDA（t＝3.93，P＝0.01），IL－1β（t＝4.00，P＝0.00），IL－6（t＝4.61，P＝0.00）和TNF－α（t＝4.13，P＝0.01）水平均明顯升高；與I/R組比較，R組肺W/D（t＝2.53，P＝0.04），血清MDA（t＝2.81，P＝0.01），IL－1β（t＝3.01，P＝0.00），IL－6（t＝4.73，P＝0.01）和TNF－α（t＝4.59，P＝0.00）水平均明顯降低。詳見表1。

2.2 光鏡下肺組織結構

光鏡下C組大鼠的肺組織結構完整，肺泡間隔均勻一致，可見少量炎性細胞浸潤，肺泡腔清晰（圖1 A）；I/R組大鼠肺泡上皮細胞增生，肺間質明顯增生，肺泡壁增厚，可見大量的炎性細胞浸潤，毛細血管明顯擴張充血，肺泡壁及肺泡間質中可見大量中性粒細胞（圖1 B）；R組大鼠肺組織病理改變較I/R組明顯減輕，炎性細胞浸潤明顯減少，僅有少量紅細胞滲出（圖1 C）。

表1 3組大鼠各項指標比較(s，n＝20)

表1 3組大鼠各項指標比較(s，n＝20)

注：與C組比較， P＜0.01；與I/R組比較，＃P＜0.05。

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圖1 光鏡下3組大鼠肺組織結構(HE，×100)

3 討論

肢體缺血－再灌注不僅可引起局部組織的不同程度改變，還可以引起其他遠處器官系統的損傷，嚴重者甚至導致多器官功能障礙(MODS)[9]，肺臟因容易呈高灌注狀態、與外界空間接觸面積大和對LIR產生的炎性介質非常敏感等多種因素而導致其最易受累病變，嚴重時臨床表現多為急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[10－11]，臨床表現常為非心源性的肺水腫、肺動脈壓升高、動脈血氧分壓降低及肺的順應性下降等改變。目前認為，氧化應激反應是LIR致肺損傷的重要機制[12]，多形核中性粒細胞(PMN)的激活、粘附、運輸而生成的有毒物質是造成此種病癥的關鍵因素，從再灌注組織中釋放入血的物質是使中性粒細胞激活及在肺中聚集而產生效應的必要物質。氧自由基的大量生成、白細胞的滲透作用及炎性因子釋放等多種因素同時作用于肺部血管內皮細胞，破壞其完整性，增加血管通透性，引起肺組織水腫和換氣功能的障礙[13]。常見于肢體再植、大血管栓塞及損傷、高位離斷、嚴重擠壓傷及肢體手術時期長時間止血帶壓迫恢復血流灌注時引起的肺功能損害。因此，加強圍術期肺組織的保護，減少肺的損傷，對術后疾病的預后轉歸有較深遠的影響。

RPM為免疫抑制劑，也是一種經典的自噬誘導劑，通過抑制自噬反應途徑中RPM靶蛋白從而促進細胞自噬的發生。但RPM對臨床上最常見的LIR導致肺損傷是否具有保護作用目前報道尚少，本試驗通過RPM對LIR肺損傷的保護效應，效果滿意，為預防和減輕肢體缺血－再灌注肺損傷提供參考。

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Effect of Rapamycin Pretreatment on Lung Injury Induced by Limb Ischemia－Reperfusion in Rats

Yuan Zhijun1,Tang Bin2,Luo Zhenzhong2,Huang Dan2
(1.Fenyi Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinyu,Jiangxi,China 336600;2.The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi,China 336600)

Objective To investigate the effect of rapamycin pretreatment on lung injury induced by limb ischemia－reperfusion in rats,to provide theoretical basis for clinical application and its prevention and treatment of lung injury induced by limb ischemia－reperfusion.M ethodsTotally 60 healthy male SD rats were divided into control group(group C),limb ischemia reperfusion group(group I/R),rapamycin pretreatment group(group R)by random number table method,20 cases in each group.12 h before ischemia,all were fasted,free drinking water and fixed on the operating table after anesthesia.In the right groin skin incision,the exposed femoral artery,femoral vein and femoral nerve.Only femoral artery,femoral vein and femoral nerve separated in group C,the femoral artery was clamped at the proximal inguinal ligament with a noninvasive vascular clamp in group I/R and group R,in order to force the hind limb of the rats to undergo ischemia for 2 h,and the vascular clamp was removed to make the reperfusion for 3 h.In group R,rapamycin was injected into the lower limb before ischemia.TTFM was used to monitor blood flow,no blood flow was monitored for ischemia,and blood flow was monitored as an indicator of reperfusion.After reperfusion for 3 h,the rats were sacrificed,and 2 mL blood was taken from the heart,the blood serum was taken by centrifuging.The concentration of MDA was determined by thiobarbituric acid method,and the levels of IL－1β,IL－6 and TNF－α were detected by ELISA.The lung tissue was taken,and the pathological results of lung tissue were observed by calculating the ratio of dry－wet and immunohistochemistry.Results Compared with group C,theconcentration of W/D in lung,serum MDA,IL－1β,IL－6 and TNF－α in group I/R increased significantly(P＜0.01).Compared with I/R group,the concentration of W/D in lung,serum MDA,IL－1β,IL－6 and TNF－α in group R decreased significantly(P＜0.05).Under light microscope,the structure of lung tissue in group C was intact,and the alveolar septa were uniform.A few inflammatory cells were infiltrated,and the alveolar cavity was clearly visible.In group I/R,the proliferation of alveolar epithelial cells,the obvious interstitial proliferation of lung and the thickening of alveolar wall wereobserved,a large number of inflammatory cell infiltration and capillary expansion and congestion wereobserved,and a large number of neutrophils were found in the alveolar wall and alveolar stroma.The pathological changes of lung tissue in group R were significantly less than those in group I/R,the infiltration of inflammatory cells was significantly reduced,only a small amount of red blood cells were exuded.Conclusion Rapamycin pretreatment can reduce lung injury induced by limb ischemia－reperfusion,and its mechanism may be related to antioxidant stress and anti－inflammatory response.

rapamycin;limb ischemia－reperfusion;lung injury

R965.2；R978.1

A

1006－4931(2017)21－0007－03

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.21.003

江西省衛生計生委科技計劃項目[20165283]。

袁志軍（1979－），男，大學本科，研究方向為麻醉醫學，（電子信箱）984391041＠qq.com。

黃丹(1981－)，碩士研究生，主治醫師，主要從事器官缺血再灌注保護方面的研究，(電子信箱)tanghuang05＠163.com。

2017－06－29；

2017－07－28)