基于3種載體蛋白的萊克多巴胺抗原的合成與檢測

賈愛娟，劉 姚，張 挺，沈 興

（1.廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東省食品質量與安全重點實驗室/畜禽產品精準加工與安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，廣東 廣州 510642；3.廣州城市職業學院食品系，廣東 廣州 510405）

基于3種載體蛋白的萊克多巴胺抗原的合成與檢測

賈愛娟1，劉 姚2，張 挺3，沈 興2

（1.廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東省食品質量與安全重點實驗室/畜禽產品精準加工與安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，廣東 廣州 510642；3.廣州城市職業學院食品系，廣東 廣州 510405）

為制備高效萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）抗體，將人工合成的RAC-琥珀酸酯半抗原與3種載體蛋白（BSA、OVA和KLH）偶聯合成人工抗原，采用紫外光譜掃描、測定偶聯比和ESI-MS進行鑒定；通過免疫小鼠獲得抗血清，采用ELISA比較其效價，對3種人工抗原的免疫原性進行評定，結果顯示3種抗血清效價為4 000～32 000，表明合成的3種人工抗原都具有免疫原性，其中以KLH為載體蛋白的抗原的免疫效果較好，可用于制備高效RAC抗體。

萊克多巴胺；載體蛋白；半抗原；人工抗原；免疫原性

萊克多巴胺（ractopamine，RAC）又稱為雷托巴胺，化學名4-｛3-〔2-羥基-2-（4-羥基苯基）-乙基〕氨基丁基｝苯酚，分子式為C18H23NO3。RAC屬于β-腎上腺素受體激動劑類藥物，能選擇性激動支氣管平滑肌的β-受體，臨床上用于治療呼吸道疾病，如支氣管炎、哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫等［1］。然而，一些不法商人將RAC用于畜牧業和養殖業，這是由于當RAC的使用量達到臨床用量的5～10倍時，具有增加動物的日增重、提高飼料利用率、促進家禽肌肉的生長、降低脂肪含量等效果［2］。在動物養殖中過度使用RAC，會使其殘留在動物性食物中，并通過食物鏈進入人體，給消費者帶來極大的安全隱患。RAC主要危害人體心血管和中樞神經系統，引起肌肉震顫、心動過速和頭痛［3］。目前，全球超過150個國家已明確禁止RAC作為飼料添加劑在養殖業中使用［4］，但RAC非法使用的現象依然存在。因此加強動物性食物中RAC的檢測至關重要。

RAC傳統的儀器檢測方法主要有高效液相（HPLC）［5-6］、液質聯用法（LC–MS/MS）［7-8］、氣質聯用法［9-10］、毛細管電泳［11-12］、拉曼光譜［13］等。儀器檢測方法具有很好的靈敏度及檢測線，但是樣品前處理復雜、耗時長、儀器費用昂貴，且不利于大量樣品的篩選。免疫檢測法是基于抗原抗體相互作用發展起來的一項檢測技術，具有靈敏度高、特異性高、快速、簡單、高通量檢測、成本低等特點，目前常用于RAC的免疫檢測技術有酶聯免疫吸附檢測［14］、免疫層析法［15-18］、熒光免疫檢測［19-23］等，并在此基礎上發展了一些免疫傳感器，如電化學［24］、表面等離子共振［3，25］。抗體作為免疫檢測技術的核心試劑，對免疫分析的靈敏度、特異性等起著至關重要的作用，而制備高親和力抗體的關鍵是抗原的制備。

大多數藥物分子質量小于1 000 u，屬于僅有反應原性而無免疫原性的半抗原。RAC分子量為337.85，屬于小分子化合物，其本身沒有免疫原性，因此合成人工抗原是建立免疫檢測方法的第一步。載體蛋白本身的抗原性、溶解性和偶聯基團數量直接影響免疫過程，由不同的載體蛋白構建的人工抗原，其免疫原性存在差異［26］。本研究選取三種蛋白，卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）和匙孔血藍蛋白（KLH）作為載體蛋白，與RAC-琥珀酸酯偶聯后合成3種人工抗原，免疫小鼠獲得抗血清之后，采用ELISA測定其效價和抑制率，并對其免疫原性進行了比較和評價，為RAC殘留免疫學檢測方法的建立提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試劑：萊克多巴胺（RAC）標準品、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）、 牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA），Sigma-Aldrich Co. LLC 公司；琥珀酸酐、二環己基碳二亞胺（DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），百靈威科技；匙孔血藍蛋白（KLH），PIERCE公司；HRP-標記羊抗鼠抗體，武漢博士德生物公司；薄層層析硅膠板、柱層析硅膠，中國青島海洋化工集團公司。試驗所用到的其他試劑均為分析純。

主要儀器：U-3010紫外可見光譜掃描儀，日本Hitachi公司；Wallac VICTOR31420多標記分析儀，PE公司；LCQDECA液質聯用儀，Finnigan公司；6K 15冷凍離心機，Sigma-Satorius公司；自動洗板機DEM-3型，北京拓普分析儀器有限責任公司；透析袋（最大截留分子量6 000 D），進口分裝（美國，BIOSHARP）；96孔聚苯乙烯酶標板，深圳金燦華有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 萊克多巴胺半抗原合成 參照文獻［27-28］的琥珀酸酐法合成半抗原（RACSA），如圖1所示。稱取鹽酸萊克多巴胺1 020 mg （約3.0 mmol），加入10 mL無水吡啶中，磁力攪拌器上攪拌溶解，然后加入琥珀酸酐360 mg （約3.0 mmol），再室溫避光攪拌24 h。反應完成后，加入等體積的飽和碳酸氫鈉溶液，混勻；用乙酸乙酯萃取5次除去水相中的吡啶和未反應的原料；用6 mol/L的鹽酸調水相pH至5.0左右，用乙酸乙酯萃取5次；取有機相，用無水硫酸鈉除水，于旋轉蒸發器上蒸干，得到RAC-SA半抗原粗產物，在反應過程中對粗產物進行實時點板（薄層色譜（Thin layer chromatography，TLC），V二氯甲烷∶V甲醇∶V氨水=4∶1∶0.1），觀察反應產物點的位置和形態。粗產物經柱層析純化得到較純的半抗原，用ESI-MS進行鑒定。

圖1 萊克多巴胺人工抗原的合成路線圖［28］

1.2.2 萊克多巴胺人工抗原的合成 （1）RACSA-OVA的合成：取RAC半抗原40.1 mg（0.1 mmol），溶于300 μL DMF中，加入DCC 24.7 mg、NHS 13.8 mg，攪拌，室溫反應8 h，將反應物10 000 r/min離心10 min，取上清，記為A液；取OVA 90 mg，溶于9 mL預冷的0.1 mol/L、pH 8.5的硼酸緩沖液中攪拌使充分溶解，記為B液。將A液加到B液中，在30 min內加完，置于4℃攪拌過夜。次日，將反應液于4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液裝入透析袋中，用生理鹽水于4℃透析3 d，每天換4次透析液。透析后，將人工抗原分裝于-20℃儲存。

（2）RAC-SA-BSA的合成：取BSA 132 mg，溶于10 mL預冷的0.1 mol/L、pH 8.5的硼酸緩沖液中（B液）。半抗原活化方法及其他步驟與RAC-SA-OVA合成相同。

（3）RAC-SA-KLH的合成：取2 mL去離子水注射到KLH瓶中（蛋白質量濃度為10.0 mg/mL）緩慢攪拌使其充分溶解，作為B液。半抗原活化方法及其他步驟與RAC-SA-OVA合成相同。

1.2.3 萊克多巴胺人工抗原的鑒定 將萊克多巴胺半抗原、BSA、OVA、KLH 以及3種人工抗原，配制成一定濃度的溶液，使純蛋白濃度與人工抗原濃度相同，用紫外掃描儀對200～400 nm波長掃描，得到它們的紫外吸收光譜，比較人工抗原紫外吸收曲線與游離半抗原、載體蛋白差異。根據公式：K=OD值/C（K為摩爾消光系數；C為各物質摩爾濃度） ，分別計算半抗原、BSA、OVA、KLH的摩爾消光系數。在純蛋白和半抗原的最大波長處檢測人工抗原的光吸收值，計算半抗原與蛋白在人工抗原中的摩爾濃度比（人工抗原OD值用OD偶表示）即偶聯比［29］：

式中，Ca、Cb分別為RAC和蛋白質的濃度，OD偶280、OD偶274分別為偶聯產物在蛋白質特征吸收峰（280 nm）、RAC特征吸收峰（274 nm）的吸光度，KBSA280、KRAC280分別為載體蛋白BSA和RAC在蛋白質特征吸收峰處的消光系數，KBSA274、KRAC274分別為載體蛋白BSA和RAC在RAC特征吸收峰處的消光系數。載體蛋白OVA和KLH的偶聯比計算公式與此類似。

1.2.4 萊克多巴胺人工抗原免疫原性檢測 將人工抗原用生理鹽水稀釋至1 mg/mL，50 μL的人工抗原與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，在Balb/c小鼠的腹腔和足墊進行注射，50 ng/只。2周后加強免疫，免疫劑量同基礎免疫，改用弗氏不完全佐劑，每2周加強免疫1次，從第3次加強免疫開始，免疫后8～10 d尾部采血，所得血樣與37℃恒溫水浴箱中靜止1 h，12 000 r/min離心10 min，取上清即為抗RAC抗血清。

1.2.5 抗血清效價和抑制檢測 用RAC-SABSA、RAC-SA-OVA抗原作為RAC-SA-KLH抗血清的包被原，用RAC-SA-OVA抗原作為RAC-SA-BSA抗血清的包被原，用RAC-SABSA作為RAC-SA-OVA抗血清的包被原。分別包被適當的濃度100 μL/孔，4℃過夜，洗板3次；每孔加200 μL封閉液，37℃封閉2 h，洗滌同上。

加樣：最后一行作為空白對照組外，其余各列孔加入 100 μL 溶液、50 μL 從 1∶1 000 開始倍比稀釋的待檢血清、50 μL PBST或50 μL稀釋RAC藥物，其中加入PBST的用于測定抗血清效價，加入50 μL稀釋藥物的用于測定抗血清抑制，37℃反應1 h，洗滌同上；加酶標二抗，每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠IgG （1∶10 000倍稀釋），37℃反應1 h，洗滌同上。

顯色：每孔加入新鮮配制的底物顯色液（TMB 10 mg/mL 的 100 μL，30% H2O22 μL，溶于10 mL pH 5.0的檸檬酸緩沖液中）100 μL，置于37℃顯色15 min。顯色終止：每孔加入50 μL的終止液（2 mol/L H2SO4）終止反應。

測定吸光值：用酶標儀測定各孔A450nm的吸光值。在測定抗血清效價組以A450nm值在1附近時抗血清稀釋度作為該抗血清效價。計算抗體血清抑制率：

式中，A效價為未加藥物的酶標孔在450 nm下的吸光值，A抑制為添加RAC藥物的酶標孔在450 nm下的吸光值。

2 結果與分析

2.1 半抗原鑒定

半抗原RAC-SA合成后，經ESI-MS 全掃描質譜驗證。從圖2可以看出，RAC-SA不純，436.3組分為本試驗設計的半抗原。

圖2 RAC-SA半抗原ESI-MS峰圖

2.2 紫外全波長掃描鑒定人工抗原合成

圖3分別為抗原RAC-SA-BSA、半抗原萊克多巴胺-琥珀酸酯和BSA的紫外掃描對照圖。BSA分別在278、212 nm處有2 個吸收峰，半抗原萊克多巴胺-琥珀酸酯分別在273、266 nm 處有2 個吸收峰，而RAC-SA-BSA 則在278、219 nm處分別有2個吸收峰。RAC-SABSA的蛋白濃度與BSA的濃度均為0.5 mg/mL，而RAC-SA-BSA的吸光值明顯高于BSA，偶聯前BSA在212 nm吸收峰在偶聯后移至219 nm，兩譜線在可見光區（300～400 nm） 的差異特別明顯，BSA在可見光區幾乎沒有吸收，而RACSA-BSA則有明顯的吸收。這可能是萊克多巴胺-琥珀酸酯與BSA偶聯后相互疊加的結果。因此可以基本認定RAC-SA-BSA的偶聯是成功的。由此可計算RAC-SA-BSA的偶聯比為18∶1。同理，也可推斷出RAC-SA–OVA、RACSA–KLH合成成功，偶聯比分別為15∶1和50∶1。

圖3 人工抗原紫外掃描圖譜

2.3 抗血清效價和抑制檢測

成功合成的3個人工抗原免疫小鼠獲得抗血清后，用ELISA檢測抗血清的效價和抑制率，結果見表1。RAC-SA-BSA 第3次免疫后抗血清檢測，包被原為RAC-SA-OVA濃度2.0 μg/mL，抗血清效價為4 000 ，抑制率達到69.2%；RAC-SA-OVA 第3次免疫后抗血清檢測，包被原為RAC-SA-BSA濃度2 μg/mL，抗血清效價為8 000，抑制率達到35%；RACSA-KLH 第3次免疫后抗血清檢測，包被原為RAC-SA-BSA濃度0.5 μg/mL，抗血清效價為32 000，抑制率達到68%。以上結果說明3種人工抗原免疫小鼠后得到的抗血清中均產生了針對RAC的抗體。

表1 3種人工抗原獲得的抗血清效價和抑制率

3 結論

本研究以萊克多巴胺為研究對象，在其酚羥基引入連接臂結構-酯鍵、用于偶聯載體蛋白的活性基團和活性偶聯基團-羧基，得到萊克多巴胺的結構衍生物。采用DCC法將該衍生物分別與OVA、BSA和KLH偶聯制備3種不同的人工抗原。經紫外掃描后，發現偶聯產物具有載體蛋白和RAC的紫外吸收特征峰，表明3種人工抗原制備成功。

3種人工抗原分別免疫Balb/c小鼠，獲得針對RAC的特異性抗血清，ELISA鑒定其效價均在4 000～32 000范圍內，以KLH為載體蛋白的人工抗原的免疫效果最好。其原因可能與載體蛋白來源不同有關，BAS和OVA來源于哺乳動物血清白蛋白，對于小鼠而言，BSA和OVA本身的免疫原性較弱；KLH來源于無脊椎動物的血藍蛋白，對于小鼠而言，KLH本身的免疫原性較強。另外，人工抗原需要與佐劑乳化，注射小鼠之后，載體蛋白會有一個復性過程，復性后的蛋白在空間結構上可能會發生一些變化；在這個過程中，KLH不存變形-復性，故能很好的保持原有的天然免疫性［26，30-31］。

為制備抗RAC抗體，建立RAC免疫學檢測方法，合成具有抗原性的RAC人工抗原至關重要。本研究獲得了抗RAC特異性較強的抗血清，為進一步研究和建立RAC免疫學分析方法奠定了基礎。

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Synthesis and testing the ractopamine antigens conjugating with three different carrier proteins

JIA Ai-juan1，LIU Yao2，ZHANG Ting3，SHEN Xing2
（1. Guangdong Meiweixian seasoning Food Co.，Ltd.，Zhongshan 528400，China；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety/ National-Local Joint Engineering Research Center for Processing and Safety Control of Livestock and Poultry Products，Guangzhou 510642，China；3. Department of Food，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou 510405，China）

In order to prepare anti-RAC antibody with high affinity，the synthesized hapten RAC-succinic acid ester was conjugated with three different carrier proteins （BSA，OVA，KLH）. After identified by UV spectroscopy scanning，ESI-MS and conjugation ratio，the successfully synthesized artificial antigens were used to immunize mouse.The titers of the obtained antiserum was detected by ELISA. The titers of the three artificial antigens were 4 000-32 000.The results showed that the three artificial antigens had satisfactory immunogenicity，and the immunogenicity of KLH was better than that of BSA and OVA. Therefore，the antigen can be used to prepare high affinity antibody.

ractopamine；carrier protein；hapten；artificial antigen；immunogenicity

S816.7

A

1004-874X（2017）07-0125-07

賈愛娟，劉姚，張挺，等. 基于3種載體蛋白的萊克多巴胺抗原的合成與檢測［J］.廣東農業科學，2017，44（7）：125-131.

2017-07-03

國家自然科學基金（31601555）

賈愛娟（1974-），女，碩士，高級工程師，E-mail：zlb@mwx.cn

沈興（1987-），女，博士，副教授，E-mail：shenxing325@163.com

（責任編輯 鄒移光）