CART-19在血液惡性腫瘤治療中的臨床應用

吳 利(綜述)，羅玉萍(審校)

(南昌大學a.研究生院2016級； b.生命科學學院遺傳教研室，南昌 330031)

CART-19在血液惡性腫瘤治療中的臨床應用

吳 利a(綜述)，羅玉萍b(審校)

(南昌大學a.研究生院2016級； b.生命科學學院遺傳教研室，南昌 330031)

嵌合型抗原受體基因修飾的T細胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CART)免疫療法是通過基因工程方法改造宿主T細胞，使其能自主靶向結合并殺死腫瘤細胞的治療方法。該療法臨床研究最多的是CART-19，其是以B細胞表面特異性蛋白CD19為靶抗原的CART細胞，主要用于治療急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，BLL)和B細胞系腫瘤。文章就CART-19在血液惡性腫瘤中治療的臨床應用進展作一綜述。

嵌合型抗原受體基因修飾的T細胞-19； 血液惡性腫瘤； 治療； 臨床應用

隨著腫瘤免疫療法的興起，嵌合型抗原受體基因修飾的T細胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CART)技術迅速發展，成為腫瘤免疫治療的新手段之一。CART技術是通過基因工程方法將人工構建的特異性嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)導入T淋巴細胞，使其能在不受主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)的限制下,特異性識別并殺死表達相關抗原的腫瘤細胞。由于腫瘤表面抗原具有多樣性，尋找合適的靶抗原一直都是CART治療的關鍵環節之一[1]。CD19是B細胞特異性表面蛋白，其表達幾乎貫穿B細胞發育的整個過程[2]，且由CART-19治療引起的B細胞缺乏癥臨床上可通過補充丙種球蛋白來緩解，因此，CD19成為CART技術治療B細胞系腫瘤的一個潛在的理想靶點[3-4]。筆者就CART-19在血液惡性腫瘤中治療的臨床應用作一綜述。

1 CART技術原理

CART技術是將抗體抗原的高親和性與T淋巴細胞的殺傷機制相結合來發揮療效的，其原理是：先將能夠識別腫瘤相關抗原的單鏈抗體(single chain variable fragments，scFv)與T細胞受體的亞基(T cell receptor，TCR)相結合，再通過基因工程方法導入宿主T細胞,使其表面產生特殊受體——CAR。用基因工程方法修飾后的CART細胞能夠特異性地識別腫瘤細胞，在與目的抗原結合后直接介導細胞毒性，通過釋放一些細胞因子(如穿孔素、顆粒酶、干擾素和腫瘤壞死因子等)攻擊腫瘤細胞。

2 CAR結構發展

1989年，Gross等科學家首次用小鼠細胞成功構建和表達了CAR。經過二十多年的研究和探索，CAR結構已經從第1代發展到了第4代[1]。CAR的基礎結構包括腫瘤相關抗原(tumor associated antigen，TAA)結合區、胞外鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區。第1代CAR介導的T細胞激活是通過CD3z鏈或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成。雖能成功識別靶抗原，但缺乏協同共刺激分子，而不能被充分激活，其增殖能力和細胞因子分泌能力都很低下，難以維持有效的殺瘤效果。第2代CAR在胞內信號區添加了1個協同刺激分子(如CD28、CD134等)，實現了T細胞的雙重活化，大大提高了因子釋放和T細胞增殖能力，從而增強了CART細胞的殺瘤活性[5]。有研究[6]發現，在胞內信號區域整合2個協同刺激分子，T細胞的活化和殺瘤效應明顯優于1個協同刺激分子的CAR，于是產生了第3代CAR(如同時整合CD28、OX40-f和CD28、4-1BB-f)。第4代CAR是在第3代CAR結構的基礎上，增加了編碼CAR及其啟動子的載體，使CART細胞能更有效分泌細胞因子和表達細胞表面受體，改善體內殺瘤的微環境。目前，第3、4代CART細胞在臨床應用中還比較少，其安全性和有效性是否優于第2代CART細胞也尚無定論。臨床上使用的多為第2代CAR。

3 CART-19在血液惡性腫瘤治療中的臨床應用

CART-19的靶抗原為B細胞表面特異性表達的CD19蛋白，主要應用于B細胞系腫瘤的靶向治療，包括急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，BLL)和B細胞淋巴瘤。有文獻[7]報道，CART-19治療血液腫瘤的總反應率為73%，其中ALL的平均反應率(93%)明顯高于CLL(62%)和B細胞淋巴瘤(36%)。Kochenderfer等[8]首次報道了CART-19免疫療法成功用于治療復發難治濾泡性淋巴瘤(follicular Lymphoma，FL)，患者獲得完全緩解(CR)至少6個月。Brentjens等[9]報道，對2例復發性難治性B-ALL和8例復發性難治性B-CLL采用CART-19治療，不僅證明了CART-19的有效性，且提出在治療前進行環磷酰胺預處理和輸注適當的CART細胞數，對療效有重要的作用，同時5例復發性難治性B-ALL患者經2年隨訪，發現治療前采用環磷酰胺化療預清除體內腫瘤細胞能夠減少治療后的不良反應。有研究[10]指出，在控制因子風暴時所使用的類固醇藥物會降低CART-19的殺傷效率，導致復發。Grupp等[11]采用CART-19治療2例復發性難治性B-ALL患兒均獲得CR，其中1例2個月后出現CD19陰性復發，提示B細胞腫瘤在CART-19持續、有效的過程中仍有可能通過逃逸機制復發。Maude等[12]報道，采用CART-19治療30例復發性難治性B-ALL患者，結果顯示，CR率高達90%，其中無進展生存期超過6個月的患者率達67%，說明CART-19在臨床應用中有無限潛力。Kochenderfer等[13]報道，采用CART-19治療9例彌漫性大B細胞性淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)患者，其中有4例達CR，且最長CR持續時間為22個月。韓為東等[14]報道，采用CART-19治療9例B-ALL患者，總反應率為67%。李萍等[15]報道，采用CART-19治療18例復發難治性白血病/淋巴瘤患者，結果顯示，總有效率達61.1%，其中6例達到CR。Garfall等[16]報道，采用CART-19免疫療法、化療聯合自體干細胞移植治療1例晚期多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者，其療效為CR，且CR持續時間長達12個月以上，說明CART-19(因為腫瘤漿細胞中CD19的表達量非常低，僅有0.05%)在整個治療中發揮了至關重要的作用，這一成果給科學家們提供了更多的思考空間。

4 CART-19在血液惡性腫瘤治療中出現的問題

CART-19在血液惡性腫瘤的臨床研究中已取得令人矚目的進展，但在其真正的廣泛應用于臨床治療之前，還有很多與安全性、有效性相關的問題有待于解決[17-18]。

4.1脫靶效應

免疫反應介導的表達靶抗原的正常組織排斥反應被稱為脫靶效應，脫靶效應表現最明顯的是靶向CD19[15,19]。CART-19細胞不僅會結合和殺傷靶向的CD19陽性的腫瘤B細胞，同時也會清除體內健康成熟的B細胞，從而引起機體損傷。針對這種情況，有學者[3]提出可通過增加靶抗原數目來提高CART細胞的特異性，如CD22在B-ALL細胞上有高表達，可考慮同時靶向CD19和CD22來提高CART細胞的特異性，減少脫靶效應。

4.2不良反應

有文獻[15,18,20]報道，CART-19治療的不良反應主要包括腫瘤溶解綜合征、細胞因子風暴、巨噬細胞綜合征、神經毒性、B細胞缺失等。臨床癥狀輕者僅類似感冒，重者則可發生多臟器功能衰竭，甚至死亡。目前，有研究[21-22]認為CART-19引起的不良反應主要是由于治療后大量釋放細胞因子——白細胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(INF-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-2受體(IL-2R)等引起的。臨床上一般采用類固醇激素和IL-6受體抗體阻斷劑(如托珠單抗注射液)藥物來緩解細胞因子風暴，以及輸注丙種球蛋白等方法來控制上述不良反應。同時，治療前采用注射用磷酸氟達拉濱聯合注射用環磷酰胺預處理來降低體內腫瘤負荷，以及根據患者的體質量來優化每次輸入CART-19細胞數量，從而有效減少不良反應的發生[9,15]。但是，由于患者治療后的個體差異性，上述方法有時也無法及時、有效地控制不良反應，導致病情惡化。

4.3復發問題

CART-19免疫療法的復發主要有CD19陽性腫瘤復發和CAR靶點丟失型腫瘤復發。前者主要是由于CART-19細胞無法在患者體內持續存活和持續、有效殺瘤而引起的[4]。針對這一情況，有學者[4,23]發現可通過整合4-1BB共刺激分子和提高CART細胞中心記憶T細胞的比例來提高其在體內的療效。另外，所有臨床研究應用的CART-19細胞均是采用鼠源的單鏈可變區(scFv)，這可能是患者體內CART細胞丟失的原因之一。但將鼠源的scFv換成人源scFv來減少CART的免疫原性，也有可能增加CAR在體內的持續性。

CAR靶點丟失型腫瘤復發主要是因腫瘤細胞長期處于生存壓力下而產生免疫逃逸引起的。其復發主要有兩種情況：1)靶分子在保留必要功能區段的情況下丟失CART-19靶向區段。2)靶分子表達CD19陰性克隆。對此，科學家們正在研究設計靶向更保守區段的CAR分子或增加靶點，如同時靶向CD19和CD22、CD20等來防止此類逃逸性復發[4]。

4.4插入性突變

CART-19細胞制備大多是以慢病毒或逆轉錄病毒為載體，將CAR導入宿主T細胞，從而將外源基因片段引入患者體內。除了起到積極的治療作用外，也可能會引起有害的插入性突變。目前，針對該問題研究較多的是利用mRNA電轉制備短期效應的CART-19細胞或引入自殺基因系統共同修飾T細胞，如單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷(HSV-TK/GCV)、化學誘導二聚化/半胱天冬酶9(CID/casp9)等[20]。當腫瘤細胞被完全清除時，可誘導啟動自殺基因，從而避免CART-19細胞在患者體內永生化，甚至產生新的腫瘤。

5 展望

CART-19細胞療法的出現給血液惡性腫瘤患者帶來了更多的生存希望，該療法在ALL等早期臨床試驗中成效顯著。但CART-19的臨床研究還處于起始階段，如何提高療效和有效控制治療后的不良反應、提高生存率仍是研究的重點和難點。同時，由于目前的CART-19細胞是用患者自身T細胞制備的，且治療方案也需要根據患者的具體病情來決定，從而大大增加了治療的不確定性。同時，這也是目前CART治療成本高、規模有限的主要原因。因此，如果能降低成本、擴大制備規模和制備通用型CART細胞，這必將為更多的患者帶來福音。

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(責任編輯：胡煒華)

R733； R730.5

A

1009-8194(2017)08-0105-03

2017-01-05

羅玉萍，教授，E-mail：luoyuping@163.com。

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.08.042