酵母菌菌株對普洱茶主要功能成分的影響

李雪玲，陳華紅，*，張金麗，王波，周紅杰

（1.楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南楚雄675000；2.云南農業大學普洱茶學院，云南昆明650201）

酵母菌菌株對普洱茶主要功能成分的影響

李雪玲1，陳華紅1，*，張金麗1，王波1，周紅杰2

（1.楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南楚雄675000；2.云南農業大學普洱茶學院，云南昆明650201）

從渥堆普洱茶樣中分離純化得到一個酵母菌菌株，使用該菌株對普洱茶生茶樣進行發酵，對發酵前后茶葉中的重要風味化學成分（氨基酸、茶多酚、咖啡堿、黃酮、兒茶素和茶色素）的變化進行了分析。研究表明，經過酵母菌發酵，茶樣中的茶多酚、兒茶素、茶黃素的含量增加，而氨基酸、咖啡堿、黃酮、茶紅素、茶褐素的含量減少，與渥堆發酵普洱茶有一定差異，因此酵母菌對普洱茶的品質形成具有較大影響。

酵母菌；發酵；風味化學成分

普洱茶作為云南的特色產品，不僅具有獨特的風味，而且具有多重保健功效[1]。現代的普洱茶是以云南大葉種茶（Camellia sinensis（var.）assamica）的鮮葉制成的曬青毛茶為原料，經潮水、渥堆、陳化及干燥等特殊工序加工而成的人工后發酵茶[2]。普洱茶渥堆過程中的微生物、溫度、水分等環境條件以及發酵時間等對普洱茶品質的影響已有較多的研究[3-4]。當前主要是在傳統的渥堆后發酵方法的基礎上，人為接種專用優勢菌種進行普洱茶的后發酵生產，以抑制雜菌和有害菌群的生長，縮短發酵時間、提高生產效率，減少環境條件等外界因素對生產過程的影響，保證產品的穩定性。人們已認識到不同的菌種對普洱茶的品質可產生不同的影響[5]。但不同的發酵微生物到底對普洱茶發酵有什么影響，對促進普洱茶特征品質成分的形成有什么樣的作用還需要深入的研究。

酵母屬（Saccharomycetes）酵母在自然界分布較廣，一些酵母菌在釀酒業，食品加工等多個領域的應用歷史悠久。研究發現，酵母菌菌體富含蛋白質、氨基酸及多種B族維生素，且具有特殊酶系統，可生產食用、藥用和飼用蛋白[6]。有機物經酵母菌發酵后，其蛋白質、維生素A等物質的生物活性會大幅度提高[7]。在酵母菌所分泌的胞外酶酶促作用下，茶葉中可發生一系列復雜變化，包括茶多酚氧化，縮合蛋白質降解，碳水化合物的分解以及各產物之間的相互聚合等一系列反應[8]，這一系列的化合物可賦予普洱茶獨特的紅褐色和特別的陳香味。但酵母菌對普洱茶品質形成的具體影響還沒有較為深入和系統的研究。

本研究選用一個分離自普洱茶的酵母屬酵母菌株（Saccharomycetes sp.）作為發酵菌株，以曬青毛茶為原料，對滅菌的普洱生茶進行單菌發酵。通過比較發酵前后茶葉中主要功能性化學成分的變化，分析酵母菌對普洱茶品質形成的影響，以期為普洱茶加工工藝的改進和普洱茶品質的提高以及特色普洱茶產品的開發提供相關的試驗和理論依據。

1 材料、試劑與儀器

試驗用茶葉：選用云南大葉種茶曬青毛茶-無葉白毫的春茶、夏茶和秋茶，由普洱市孟連行健普洱茶開發有限公司提供；試驗用微生物：分離自普洱茶產區普洱茶渥堆發酵第一翻采集茶樣。

菌種分離培養基：茶湯培養基（茶葉30 g，加水400 mL，煮沸 30 min，過濾定容至 1 000 mL，瓊脂 20 g，pH自然）；菌種活化培養基：PDA培養基。

722S可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；754紫外分光光度計：上海第三分析儀器廠。

2 方法

2.1 發酵酵母菌種的分離與純化

采集普洱熟茶茶樣，采用稀釋涂布平板法進行分離[9]。

2.2 菌株鑒定

通過菌落形態觀察和細胞顯微形態特征研究初步鑒定，再進一步使用天根的酵母菌基因組提取試劑盒提取酵母菌株DNA，通過PCR擴增ITS序列進行分析[10]，確定酵母菌株分類地位。在NCBI網站對測得的ITS序列進行序列的BLAST分析。采用MEGA 6軟件進行多序列比對及系統發育分析。

2.3 茶樣中主要功能性化學成分的測定

氨基酸含量測定采用茚三酮比色法GB 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》；咖啡堿含量測定采用紫外分光光度法GB/T 8312-2013《茶咖啡堿測定》；茶多酚含量測定采用福林酚試劑法GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；茶紅素、茶黃素、茶褐素含量測定采用萃取比色法[11-12]。兒茶素含量測定采用香蘭素比色法[13]。黃酮含量測定采用槲皮素比色法[14-15]。

2.4 茶樣的發酵

2.4.1 菌株的活化

使用PDA培養基對酵母菌菌株進行活化并培養備用。

2.4.2 菌株生長溫度范圍測定

將活化好的酵母菌接入茶湯培養基平板，分別置于室溫（20℃左右）、28、37、45、50℃條件下培養，每天定時觀察平板上菌株生長狀況，使用游標卡尺測量菌落直徑，連續培養7 d，以確定分離菌株的最適生長溫度。重復3次。

2.4.3 茶葉的滅菌

采用間歇滅菌法對生茶樣（5 g曬青毛茶預先放入250 mL三角燒瓶中，加入蒸餾水50 mL）進行滅菌。滅菌程序為95℃加熱45 min，然后在28℃放置24 h，再95℃加熱45 min后，28℃放置24 h，重復加熱和放置3次。

無菌操作，接種酵母菌于滅菌的茶樣中，隨后置于恒溫震蕩器中，150 r/min，28℃培養 7 d～10 d。

2.5 數據分析

樣本間方差齊性檢驗采用Levene方法。樣本間差異采用單因素方差分析，并利用最小顯著差數法（Least Significant Difference，LSD）比較兩兩樣本間的差異程度。相關性分析選用Pearson指數。所有計算分析都采用SPSS16.0軟件。

3 結果與討論

3.1 菌株的鑒定

分離菌株使用PDA培養基在28℃培養3 d，分離菌株的菌落為乳白色，隆起，邊緣整齊，表面光滑不透明，濕潤，直徑2 cm～4 cm；顯微鏡下觀察，細胞為橢球型或卵圓形，大小為（3～5）μm×（5～9）μm，出芽生殖明顯，經過促孢培養后，可觀察到每個子囊產4個卵圓形的子囊孢子，具有酵母菌株典型的形態特征[16]。

測序得到分離菌株的ITS基因片段為747 bp，通過NCBI的BLAST分析和MEGA 6多序列比對分析發現，分離菌株的ITS序列與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的序列相似性最高，為100%。因此，初步鑒定分離菌株屬于酵母屬（Saccharomyces）。

3.2 試驗菌株生長溫度范圍

經過7 d培養，酵母菌菌株在2℃生長最旺盛，平板上菌落發達，生長速率為1.67 mm/d（菌落直徑/天）；在室溫下生長較慢，生長速率為1.17 mm/d；在37℃微弱生長，平板上僅有零星菌落，生長速率為0.73 mm/d；在45℃未觀察到生長現象，因此選擇28℃作為發酵溫度。推測該酵母菌株主要在渥堆發酵的初期發揮作用，隨著堆溫的升高，菌株生長受到抑制。

3.3 茶樣中氨基酸含量的變化

接種酵母菌對無葉白毫的春、夏、秋茶進行單菌發酵，測定發酵前后茶湯中氨基酸的含量，結果如圖1所示。

圖1 茶樣中氨基酸含量的變化（均值±標準差）Fig.1 Varied contents of amino acids from tea samples during fermentation process（mean±sd）

生茶茶樣中，春茶、夏茶和秋茶的氨基酸平均含量分別為（19.12±0.44）、（18.63±0.51）、（17.66±0.39）mg/g（n=4），春茶＞夏茶＞秋茶，單因素方差分析結果表明，春茶和夏茶的氨基酸含量差異不顯著，p＞0.05；春茶和秋茶的氨基酸含量差異極顯著，p＜0.01；夏茶和秋茶的氨基酸含量差異顯著，p＜0.05。發酵后春茶、夏茶和秋茶的氨基酸平均含量分別為（6.81±0.45）、（7.38±0.51）、（5.52±0.43）mg/g（n=4），T 檢驗表明，春茶、夏茶和秋茶發酵前后的氨基酸含量均差異極顯著，p＜0.01。與發酵前相比，發酵后茶樣中氨基酸的含量呈不同程度的減少，春茶減少了64.38%，夏茶減少了60.39%，秋茶減少了68.74%，幾種茶樣中氨基酸的減少幅度相近。

氨基酸與茶葉嫩度和香氣的形成有密切關系，對茶湯的滋味、色澤也有較明顯的影響。渥堆發酵的普洱茶，氨基酸含量也呈減少趨勢[17]，本研究中氨基酸的減少幅度大于渥堆發酵茶樣，這一方面可能是由于酵母菌利用了部分氨基酸作為氮源，另一方面在酵母的酶系和濕熱條件下，部分氨基酸發生了氧化和轉化。氨基酸還可以與碳水化合物發生梅拉德反應，聚合形成大分子的不溶性黑色素，因此在發酵過程中，氨基酸總體呈減少趨勢。

圖2 茶樣中茶多酚含量的變化（均值±標準差）Fig.2 Varied contents of tea polyphenols（TP）from tea samples during fermentation process（mean±sd）

3.4 茶樣中茶多酚含量的變化

茶樣中茶多酚含量的變化見圖2。生茶中春茶、夏茶和秋茶的茶多酚含量分別是（171.67±1.87）、（184.12±2.63）、（172.41±2.94）mg/g（n=4），單因素方差分析結果表明，春茶和夏茶的茶多酚含量差異極顯著，p＜0.01；春茶和秋茶的茶多酚含量差異不顯著，p＞0.05；夏茶和秋茶的茶多酚含量差異極顯著，p＜0.01，夏茶的茶多酚含量高于春茶和秋茶。發酵后春茶、夏茶和秋茶的茶多酚含量分別是（224.10±2.94）、（238.78±2.98）、（230.09±1.38）mg/g（n=4），T 檢驗表明，春茶、夏茶和秋茶發酵前后茶多酚的含量均差異極顯著，p＜0.01。茶樣中茶多酚的含量在發酵后呈不同程度的增高，春茶增加了30.54%，夏茶增加了29.62%，秋茶增加了33.57%。而對渥堆發酵茶樣的研究表明，在渥堆過程中，茶葉中的茶多酚含量均顯著減少[17-18]。黃振興等研究發現，發酵40 d后，酵母菌可以有效地減少茶多酚的含量[19]。而本研究發現，酵母菌發酵7 d后，茶多酚的含量有一定增加。這可能是由于渥堆發酵時間較長，除了微生物的作用外，在濕熱條件下發生的氧化作用也可使茶多酚數量減少。茶多酚因滋味苦澀且有較強的收斂性，其含量在一定范圍內與茶湯的滋味、湯色成正相關[20-21]。本研究所用酵母菌菌株可使茶樣中茶多酚的含量增加，而多種菌共同作用的渥堆發酵過程中茶多酚含量是減少的，因此該酵母菌菌株在純培養狀態時對普洱茶品質有明顯影響。

3.5 茶樣中咖啡堿含量的變化

茶樣中咖啡堿含量的變化見圖3。

圖3 茶樣中咖啡堿含量的變化（均值±標準差）Fig.3 Varied contents of caffeine from tea samples during fermentation process（mean±sd）

生茶中春茶、夏茶和秋茶的咖啡堿含量分別是（17.48±1.61）、（20.71±1.23）、（21.52±1.48）mg/g（n=4），單因素方差分析結果表明，春茶與夏茶、秋茶的咖啡堿含量差異極顯著，p＜0.01；夏茶和秋茶的咖啡堿含量差異不顯著，p＞0.05；春茶的咖啡堿含量低于夏茶和秋茶。發酵后春茶、夏茶和秋茶的咖啡堿含量分別是（13.08±2.19）、（16.84±1.80）、（16.22±1.50）mg/g（n=4），T檢驗表明，春茶和夏茶中的咖啡堿含量在發酵前后差異顯著，p＜0.05，秋茶的咖啡堿含量在發酵前后差異極顯著，p＜0.01。與發酵前相比，發酵后茶樣中咖啡堿的含量呈不同程度的減少，春茶減少了25.17%，夏茶減少了18.69%，秋茶減少了24.63%。春茶和秋茶的減少幅度相近，但夏茶變化幅度相對較小。而已有的研究也表明，在渥堆過程中，茶葉中的咖啡堿含量逐步增加[17]。周春紅等的研究則表明，在酵母的發酵初期，咖啡堿的含量是減少的[22]。咖啡堿是茶葉重要的滋味成分，其含量對茶葉品質影響較大。本研究中，咖啡堿的含量在發酵后減少，可能是在發酵中咖啡堿被分解轉化，進行了一定消耗所致。

3.6 茶樣中黃酮含量的變化

茶樣中黃酮含量的變化見圖4。

圖4 茶樣中黃酮含量的變化（均值±標準差）Fig.4 Varied contents of flavonid（FL）from tea samples during fermentation process（mean±sd）

生茶中春茶、夏茶和秋茶的黃酮含量分別是（12.10±1.05）、（13.00±1.51）、（12.47±1.35）mg/g（n=4），差異不顯著，p＞0.05，生茶各個茶樣中的黃酮含量相近。發酵后春茶、夏茶和秋茶的黃酮含量分別減少為（7.83±0.69）、（8.86±0.67）、（8.48±0.55）mg/g（n=4），T 檢驗表明，春茶、夏茶和秋茶的黃酮含量在發酵前后差異極顯著，p＜0.01；春茶的黃酮含量減少了35.29%，夏茶減少了31.85%，秋茶減少了32.00%。而對渥堆發酵茶樣的研究顯示，經過渥堆發酵發酵后，茶葉中的黃酮含量有的減少[23]；而有的則為增加，且不同產地的原料增加的幅度差別很大[24]，因此普洱茶發酵中黃酮含量的變化較為復雜，這可能與黃酮類物質的組成以及發酵微生物的組成有關。本研究中，黃酮含量減少可能是由于微生物的酶和濕熱作用使黃酮類物質分解所致。

圖5 茶樣中兒茶素含量的變化（均值±標準差）Fig.5 Varied contents of total catechins（TC）from tea samples during fermentation process（mean±sd）

3.7 茶樣中兒茶素含量的變化

茶樣中兒茶素含量的變化見圖5。生茶春茶、夏茶和秋茶的兒茶素含量分別是（63.17±0.16）、（85.63±0.68）、（82.03±0.59）mg/g（n=4），單因素方差分析結果表明，春茶、夏茶和秋茶的兒茶素含量差異均極顯著，p＜0.01，夏茶中兒茶素的含量最高。發酵后春茶、夏茶和秋茶的兒茶素含量分別是（80.62±0.97）、（101.30±1.28）、（92.30±0.81）mg/g（n=4），T 檢驗表明，發酵前后各個茶樣中的兒茶素含量差異均極顯著，p＜0.01。發酵后茶樣中的兒茶素含量均呈不同程度的增加，春茶增加了27.62%，夏茶增加了18.30%，秋茶增加了12.56%。幾種茶樣的變化幅度差別較大。研究表明，酯型兒茶素包括 EGCG（Epigallocatechin gallate）、ECG（Epicatechin gallate）在渥堆過程中均劇烈的減少，至渥堆完成時已不能發現[19]。EGC在渥堆初期增加，后期劇烈減少。簡單兒茶素如EC在初期呈增加趨勢，后期則逐漸減少[25]。本研究所檢測是總兒茶素，在發酵后含量均增加，兒茶素對茶葉的品質具有重要影響，尤其是酯型兒茶素和簡單兒茶素的含量需要在適度的范圍才有利于茶葉醇和口感和香味的形成[26-27]，但本研究未對增加的兒茶素成分進行分析，因此酵母菌發酵后對茶葉品質的影響還需要進一步研究。

3.8 茶樣中茶色素含量的變化

茶樣中茶黃素含量的變化見圖6。

圖6 茶樣中茶黃素含量的變化（均值±標準差）Fig.6 Varied contents of theaflavins（TF）from tea samples during fermentation process（mean±sd）

生茶中春茶、夏茶和秋茶的茶黃素含量分別是（1.19±0.06）、（1.10±0.11）、（1.19±0.07）mg/g（n=4），單因素方差分析結果表明，春茶、夏茶和秋茶的茶黃素含量差異不顯著，p＞0.05，生茶各個茶樣中的茶黃素含量相近。發酵后春茶、夏茶和秋茶的茶黃素含量分別是（1.47±0.08）、（1.40±0.05）、（1.39±0.10）mg/g（n=4），T檢驗表明，春茶和夏茶發酵前后的茶黃素含量差異極顯著，p＜0.01，秋茶發酵前后的茶黃素含量差異顯著，p＜0.05；春茶的茶黃素含量增加了23.53%，夏茶增加了27.27%，秋茶增加了16.81%。

茶樣中茶紅素含量的變化見圖7。

圖7 茶樣中茶紅素含量的變化（均值±標準差）Fig.7 Varied contents of thearubigins（TR）from tea samples during fermentation process（mean±sd）

生茶中春茶、夏茶和秋茶的茶紅素含量分別是（84.09±1.80）、（82.80±2.37）、（67.97±4.42）mg/g（n=4），單因素方差分析結果表明，春茶和夏茶的茶紅素含量差異不顯著，p＞0.05；秋茶和春茶、夏茶的茶紅素含量差異均極顯著，p＜0.01；生茶組秋茶中茶紅素的含量低于春茶和夏茶。發酵后春茶、夏茶和秋茶的茶紅素含量分別是（50.90±1.85）、（49.82±1.10）、（41.30±1.38）mg/g（n=4），T檢驗表明，發酵前后3種茶樣中的茶紅素含量差異極顯著，p＜0.01，發酵后茶樣中茶紅素的含量呈不同程度的減少，春茶減少了39.47%，夏茶減少了39.83%，秋茶減少了39.24%。

茶樣中茶褐素含量的變化見圖8。

圖8 發酵7 d后茶樣中茶褐素含量的變化（均值±標準差）Fig.8 Varied contents of theobromine（TB）from tea samples during fermentation process（mean±sd）

生茶中春茶、夏茶和秋茶的茶褐素含量分別是（24.00±1.45）、（21.61±0.85）、（21.14±0.97）mg/g（n=4），單因素方差分析結果表明，春茶和夏茶的茶褐素含量差異顯著，p＜0.05春茶和秋茶的茶褐素含量差異極顯著，p＜0.01，夏茶和秋茶的茶褐素含量差異不顯著，p＞0.05。生茶組茶樣中茶褐素的含量為春茶＞夏茶＞秋茶。發酵后春茶、夏茶和秋茶的茶褐素含量分別是（18.08±0.86）、（16.21±0.80）、（16.51±1.11）mg/g（n=4），T檢驗表明，3種茶樣發酵前后的茶褐素含量差異均極顯著，p＜0.01。與發酵前相比，發酵后茶樣中茶褐素的含量呈不同程度的減少，春茶減少了24.67%，夏茶減少了24.99%，秋茶減少了21.90%。

已有研究表明，渥堆發酵過程中，茶色素中茶黃素和茶褐素的含量呈增加趨勢，而茶紅素呈減少趨勢[22]。本研究中，茶紅素和茶褐素在發酵后減少，茶黃素增加。茶黃素對茶的色、香、味及品質有著重要影響，一定范圍內，茶黃素含量與茶葉品質呈正相關[27]。經酵母菌發酵后，茶紅素的含量減少，與渥堆發酵結果相同；而茶褐素的含量下降，與渥堆發酵結果不同。研究認為茶紅素可能是由兒茶素經氧化縮合、聚合等生成[28]，茶褐素是由多酚類物質氧化聚合形成[29]。微生物對茶褐素的生成具有重要影響[30]。本研究中，茶紅素和茶褐素含量下降可能是由于酵母菌對茶多酚和兒茶素的轉化較少，因此經酵母菌菌株發酵后，兒茶素和茶多酚含量增加，而茶紅素和茶褐素含量減少。

4 結論

經過7 d發酵后，酵母菌生長基本已進入衰亡期。發酵后茶樣中氨基酸、咖啡堿、黃酮、茶紅素、茶褐素的含量與發酵前相比都呈不同程度的減少。而茶多酚、兒茶素、茶黃素的含量與發酵前相比都呈不同程度的增加。研究表明，普洱茶中茶多酚、氨基酸與品質得分呈正相關，表明它們的含量越高，茶葉中的品質越好[30]。兒茶素、黃酮、茶黃素、茶紅素與普洱茶品質得分呈負相關[18]。本研究中，經酵母菌菌株發酵后，茶樣中茶多酚含量的增加，黃酮、茶紅素含量的減少可能對普洱茶的品質有一定積極影響，而兒茶素、茶黃素的增加則可能對普洱茶的品質有一定的負面作用，但普洱茶的品質還與水浸出物、多糖、寡糖、粗纖維、蛋白質等多種化學成分相關，還需結合其它指標進行判定。

普洱茶特殊的風味品質是多種微生物包括黑曲霉、青霉、酵母菌、根霉等共同作用的結果，本研究初步明確了在發酵過程中，酵母菌對普洱茶中主要功能性化學成分的影響，可為實現普洱茶可控的發酵過程以及普洱茶品質的改良和風味普洱茶的研究提供相關的理論依據。

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The Effects of A Saccharomycetes Strain on the Main Functional Ingredients of Pu-er Tea

LI Xue-ling1，CHEN Hua-hong1，*，ZHANG Jin-li1，WANG Bo1，ZHOU Hong-jie2
（1.Department of Chemistry and Life Science，Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000，Yunnan，China；2.Longrun Pu-er Tea Academy，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，Yunnan，China）

A Saccharomycetes strain was isolated from a ripe Pu-er tea samples.The sterilized Pu-er raw tea was fermented with this isolate.The important flavor chemical ingredients[amino acids，tea polyphenols（TP），caffeine，flavonoid（FL），total catechins（TC）and tea pigments]from tea samples were determinated and analyzed.The results showed that the contents of tea polyphenols（TP），total catechins（TC），theaflavins（TF）from the fermented tea samples increased，but the contents of amino acids，caffeine，flavonoid（FL），thearubigins（TR），theabromine（TB）from tea samples decreased during fermentation process.These results were different from the results of piles-fermented Pu-er tea.Therefore，Saccharomycetes strain affected evidently the quality of Pu-er tea.

Saccharomycetes；fermentation；flavour chemical ingredients

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.033

國家自然科學基金（31100009）

李雪玲（1965—），女（漢），副教授，學士，研究方向：真菌資源研究。

*通信作者：陳華紅，教授，研究方向：微生物資源研究。

2017-06-28