糖尿病合并缺血性腦梗死后腦組織RECK表達及其與MMP-9關系的實驗研究

，

糖尿病合并缺血性腦梗死后腦組織RECK表達及其與MMP-9關系的實驗研究

上官士娜1，朱梅佳2

目的觀察 RECK、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)在糖尿病合并腦梗死(CI)后腦組織損傷中的作用。方法將110只Wister大鼠隨機分成假手術組、單純腦梗死組(CI組)和糖尿病合并腦梗死DM組+CI組。采用高糖高脂飲食及腹腔注射小劑量鏈脲霉素法制作糖尿病大鼠模型，線栓法實現(xiàn)大腦中動脈缺血再灌注模型，免疫組化法檢測腦組織RECK、MMP-9表達。結果RECK和MMP-9主要表達于缺血半暗帶神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞等處；CI組、DM+CI組RECK較假手術組表達明顯減少(P<0.05或P<0.01)，且DM+CI組較CI組明顯減少(P<0.05)。DM+CI組RECK于再灌注3 h表達開始降低，24 h達波谷，后逐漸增加。CI組、DM+CI組MMP-9表達較假手術組明顯增加(P<0.05)，且DM+CI組較CI組明顯增加(P<0.05)；DM+CI組MMP-9于再灌注3 h開始升高，24 h達波峰，7 d后漸下降；梗死后腦內MMP-9與RECK蛋白表達呈直線負相關。結論糖尿病合并腦梗死大鼠腦內RECK表達減少與MMP-9表達上升相關，考慮兩者參與糖尿病合并腦梗死后腦缺血改變及功能恢復。

糖尿?。籖ECK；缺血性腦梗死；基質金屬蛋白酶-9；血管重塑

糖尿病(DM)病人發(fā)生腦卒中的危險性約為一般人群的4倍，高血糖為缺血性腦卒中發(fā)病的獨立危險因素，腦卒中的嚴重程度和死亡率隨血糖升高而增高[1]。血管新生及側支循環(huán)形成對卒中后腦組織供血、供氧的恢復起決定性作用。國內外研究發(fā)現(xiàn)：局灶性腦缺血后腦內基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)激活，降解細胞外基質，增加血管通透性，破壞腦組織，損傷血腦屏障，促使新生血管形成[2-3]。RECK(reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs)是基質金屬蛋白酶內生性抑制劑，抑制基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9 及膜型1基質金屬蛋白酶(MT1-MMP)等基質金屬蛋白酶[4]，其高表達可抑制新生血管形成，同時也可能調節(jié)其他細胞外信號分子如轉化生長因子-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF) 的數(shù)量及功能等而進一步影響血管重塑。RECK可能通過抑制MMP酶活性和腫瘤血管新生兩方面影響腫瘤的侵襲轉移[5-8]。本研究建立糖尿病大鼠腦梗死(CI)再灌注模型，觀察腦組織RECK、MMP-9的表達，探尋RECK、MMP-9影響糖尿病性腦梗死后腦組織病理改變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 110只體重170 g～220 g的健康雄性Wister大鼠(山東大學實驗動物中心提供)，隨機分組后均喂養(yǎng)至270 g～340 g。假手術組25只和單純腦梗死組(CI組)40只Wister大鼠以普通飼料喂養(yǎng)；糖尿病腦梗死組(DM+CI組)45只Wister大鼠以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，并腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)。CI組和DM+CI組制作大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，隨機分成再灌注1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d亞組，每亞組5只～8只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 高糖高脂飼養(yǎng)DM+CI組大鼠2個月，然后空腹腹腔注射30 mg/kg 鏈脲佐菌素(Sigma公司)1次，注射后1個月和2個月檢測體重、血糖水平[4]。體重270 g～340 g，隨機血糖16.7 mmol/L～25.6 mmol/L者選為糖尿病大鼠。

1.2.2 局灶性腦缺血再灌注模型的建立 改良Longa線栓法[5]實現(xiàn)MCAO模型。室溫下線拴插入CI組和DM+CI組大鼠右側頸內動脈約23 mm，栓塞右側大腦中動脈，假手術組線栓插入深度為17 mm～18 mm，固定線栓，1.5 h后拉出，手術時大鼠肛溫保持在36.5 ℃～37.5 ℃。

1.2.3 神經(jīng)功能評分 大鼠清醒后，參照Longa評分標準[6]進行神經(jīng)功能評分。0分：無陽性體征；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：行走時向對側轉圈；3分：向對側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失[6]。評分為1分～3分的大鼠入組。

1.2.4 切片標本制備 選定時間點斷頭取鼠腦、固定標本、脫水、石蠟包埋，冠狀切片厚度為4 μm，常規(guī)HE染色。

1.2.5 免疫組化法測定RECK、MMP-9表達 切片脫蠟，3% H2O210 min，微波，羊血清封閉液20 min，一抗2 h，0.1 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，二抗20 ℃1 h，0.1 mol/L PBS液洗滌，DAB顯色，蘇木素復染、封片對照片用PBS代替一抗，余步驟相同。

1.2.6 結果判定 RECK、MMP-9表達于胞漿，呈棕黃色，高倍鏡下梗死中心區(qū)和缺血半暗帶區(qū)隨機選擇10個視野、計數(shù)陽性細胞數(shù)目。

2 結 果

2.1 梗死灶HE染色及神經(jīng)功能評分 梗死后腦切片可見蒼白、缺血改變梗死灶，中心梗死區(qū)神經(jīng)元減少、核固縮、小血管壞死、炎細胞浸潤等；半暗帶神經(jīng)元、膠質細胞腫脹，少量炎癥細胞浸潤。DM+CI組病變較CI組更嚴重。梗死大鼠表現(xiàn)為Horner征、左前肢屈曲、向左轉圈或歪斜，神經(jīng)功能評分2分～3分。

2.2 RECK的表達 高倍鏡下假手術組大鼠RECK主要表達于兩側大腦皮質梨形細胞層、海馬等處神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞及血管內皮和脈絡叢；于各時間點，DM+CI組、CI組RECK表達較假手術組明顯減少(P<0.01)，詳見表1。散布于缺血半暗帶神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞及血管內皮細胞漿。

組別1h3h6h12h24h3d7dCI組 26.05±1.12 23.24±1..321)3) 21.08±1.031)3) 18.92±1.171)3) 14.98±1.241)3)13.85±1.253)19.88±1.361)DM+CI組23.36±1.2117.36±1.422)15.81±1.232)13.75±1.022)11.02±1.572)13.33±1.032)19.79±1.452)假手術組 27.01±1.0226.09±1.1125.89±1.2825.33±1.1524.88±1.232466±1.2226.89±1.27 與假手術組同時間比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與DM+CI組同時間比較,3)P<0.05。

2.3 MMP-9蛋白的表達結果 假手術組MMP-9的陽性表達少，各再灌注后時間點，DM+CI組、CI組MMP-9表達較假手術組明顯上升(P<0.05)，主要分布于梗死中心和半暗帶神經(jīng)膠質細胞、神經(jīng)元、血管內皮細胞及脈絡叢上皮細胞等處，以膠質細胞為主。DM+CI 組MMP-9表達較CI組顯著上升(P<0.05)。DM+CI 和CI組MMP-9的時程表達特點相似：再灌注3 h開始上升，24 h達到波峰，3 d后逐漸降低。詳見表2。

組別1h3h6h12h24h3d7dCI組5.35±1.037.11±1.031)2)16.00±1.311)2)29.02±2.031)2)50.53±1.311)2)22.23±1.021)2)14.00±2.251)2)DM+CI組5.32±1.3013.20±1.461)28.04±1.021)46.04±1.321)68.30±2.231)25.00±1.331)16.04±1.321)假手術組5.31±1.034.80±1.234.54±1.335.42±1.824.49±1.025.35±1.194.88±1.38 與假手術組同時間比較,1)P<0.05;與DM+CI組同時間比較,2)P<0.05。

2.4 各個再灌注時間點RECK和MMP-9的相關性分析 隨缺血再灌注后時間增長，梗死組MMP-9與RECK表達呈相反變化規(guī)律：經(jīng)直線相關分析，CI組RECK與MMP-9呈直線負相關(r=-0.769，P<0.05)；DM+CI組RECK與MMP-9表達呈直線負相關 (r=-0.852，P<0.05)。

3 討 論

RECK抑制MMP-9、MMP-2等蛋白水解活性，調節(jié)血管形成過程[9]。對肺癌、肝癌、胰腺癌及乳腺癌等研究表明：腫瘤新生血管形成過程中RECK 基因及MMP相互調節(jié)至關重要，RECK表達水平和腫瘤血管生成密切相關。無RECK基因表達時，MMP的過表達可導致細胞外基質過度降解，血管及周圍組織通透性增加，引起正常組織破壞，并可導致新生血管形成；相反，RECK基因的高表達抑制新生血管形成。本實驗采取糖尿病大鼠腦缺血再灌注模型，研究梗死后再灌注腦組織中RECK表達及其與MMP-9表達的關聯(lián)，結果顯示：糖尿病腦梗死組與單純腦梗死組RECK表達部位相同，均位于神經(jīng)膠質細胞、神經(jīng)元、血管內皮細胞等，兩組均較假手術組表達明顯降低，考慮RECK蛋白參與大鼠腦梗死后病理過程；糖尿病腦梗死組RECK表達強度以及陽性細胞數(shù)目均明顯低于單純腦梗死組，表明血糖水平升高抑制梗死后腦組織RECK表達，原因可能與高血糖導致腦梗死后細胞因子、炎性介質等改變有關；糖尿病腦梗死組RECK與MMP-9表達呈負相關，推測高血糖時RECK與MMP-9相互調節(jié)并共同參與加重再灌注腦組織缺血性損傷，導致新生血管形成等病理過程。

[1] Stegmayr B，Asplund K，Kuulasmaa K，et al.Stroke incidence and mortality correlated to stroke risk factors in the WHO MONICA Project [J].Stroke，2001，4(28)：1362-1367.

[2] Anna Rosell，Arantxa Ortega-Aznar，José Alvarez-Sabín et al.Increased brain expression of matrix metalloproteinase-9 after ischemic and hemorrhagic human stroke [J].Stroke，2006，37(28)：1399-1406.

[3] Vu TH，Werb Z.Matrix metalloproteinases： effectors of development and normal physiology [J].Genes Development，2000，14(17)：2123-2133.

[4] Sasahara RM，Brochado SM，Takahashi C，et al.Transcriptional control of the RECK metastasis/angiogenesis suppressor gene[J].Cancer Detect Prev，2002，26：435-443.

[5] Takahashi C，Sheng Z，Horan TP，et al.Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK [J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(22)：13221-13226.

[6] Egeblad M，Werb Z.New roles for matrix metalloproteinases in cancer [J].Nat Rev Cancer，2002，2(2)：163-176.

[7] Sternlicht MD，Bergers G.Matrix metalloproteinases as emerging targets in anticancer therapy： status and prospects [J].Expert opinion on Therapeutic Targets，2000，4(3)：609-633.

[8] Rhee JS，Coussens LM.RECK in MMP function：implications for cancer development [J].Trends Cell Biol，2002，12(5)：209-211.

[9] Kurata H，Thant AA，Matsuo S，et al.Constitutive activation of MAKP kinases is critical and sufficient for the activation of MMP-2 [J].Exp Cell Res，2000，254(1)：180-188.

The Expression of RECK in Brain Tissue after Diabetic Cerebral Ischemic Infarction and Its Relation with Matrix Metalloproteinase-9

Shangguan Shina，Zhu Meijia

The Affiliated Hospital of Shandong Medical College，Linyi 276000，Shandong，China

Objective To explore the involvement of reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs (RECK) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in diabetic cerebral ischemia.Methods One hundred and ten wistar rats were randomly divided into simulate operation group，cerebral ischemia group(CI group) and diabetic cerebral ischemia group(DM+CI group).The diabetic rat models were established by high fat，saccharose diets and streptozotion injections.The middle cerebral artery occlusion models were made by improved zealong’s method.The expressions of RECK and MMP-9 were examined by immunohistochemistry staining.Results RECK and MMP-9 located mainly in the cytoplasm of neurons，neuroglia cells and etc in the ischemic penumbra zones.RECK distribution significantly decreased in both ischemic groups (P<0.01).At every reperfusion point，less RECK(+)cells in DM+CI group were detected than CI group (P<0.05).RECK decreased at 3 hours，minimum at 24 hours，then gradually increased after 3 days in both ischemic groups.MMP-9 significantly increased in both ischemic groups (P<0.05).MMP-9 increased significantly more than that in CI group (P<0.05)，peaked at 24 hours.Negative correlation of MMP-9 in DM+CI group and RECK were detected at 3 hours to 24 hours after reperfusion.Conclusion The reduction of RECK possibly contribute to the increase of MMP-9，which may be one reason for infarction injuries and terrible results in cerebral ischemia of diabetic patients.

diabetes mellitus；cerebral ischemic infarction；reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs；matrix metalloproteinase-9；vascular remodling

山東省自然科學基金項目(No.2005GG4202027)

1.山東醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院(山東臨沂 276000)，E-mail：maggie4426@163.com；2.山東大學附屬千佛山醫(yī)院

信息：上官士娜， 朱梅佳.糖尿病合并缺血性腦梗死后腦組織RECK表達及其與MMP-9關系的實驗研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(19)：2393-2395.

R741 R255.2

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2017．19．008

1672-1349(2017)19-2393-03

2017-01-16)

(本文編輯 郭懷印)