禽波氏桿菌HagA蛋白基因的序列分析及抗原表位預測

袁 朋，朱瑞良，崔晨晨，楊萍萍

(山東農業大學 動物科技學院，山東 泰安271018)

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1642-1647

袁朋，朱瑞良，崔晨晨，等. 禽波氏桿菌HagA蛋白基因的序列分析及抗原表位預測[J].浙江農業學報，2017，29(10)： 1642-1647.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.07

2017-03-23

國家自然科學基金項目(31602067，31272595)；山東省自然科學基金項目(ZR2014CM044)；山東省“雙一流”獎補資金

袁朋 (1985—)，男，山東德州人，碩士研究生，實驗師，研究方向為預防獸醫學。E-mail: yp8511@163.com

*通信作者，楊萍萍，E-mail: ppyang@sdau.edu.cn

禽波氏桿菌HagA蛋白基因的序列分析及抗原表位預測

袁 朋，朱瑞良，崔晨晨，楊萍萍*

(山東農業大學 動物科技學院，山東 泰安271018)

試驗旨在對禽波氏桿菌的血凝素HagA蛋白的二級結構與B細胞抗原優勢表位進行預測，探討以血凝素HagA蛋白制作單克隆抗體的可能性。首先對禽波氏桿菌的血凝素hagA基因進行了PCR擴增以及序列測定，利用生物信息學的相關軟件與分析方法，對血凝素HagA蛋白的二級結構以及B細胞抗原表位進行分析預測。經綜合分析表明，禽波氏桿菌的HagA蛋白氨基酸序列中存在7個B細胞優勢抗原表位區域，6個可能的糖基化位點。研究結果為進一步分析禽波氏桿菌HagA蛋白的生物學功能、制備單抗和研制疫苗等奠定了基礎。

禽波氏桿菌；HagA蛋白；二級結構；B細胞抗原表位預測

在生物信息學與計算機技術日益發展的今天，越來越多的人利用生物信息學相關軟件和網絡服務器來預測功能蛋白的結構與抗原表位信息，既節約實驗室工作量，又可避免在傳統表位研究中的盲目性[5-7]。本研究對實驗室保存的禽波氏桿菌菌株的hagA基因擴增測序，運用計算機軟件與生物信息學方法來分析HagA蛋白的二級結構、親水性、表面可及性，從而對血凝素HagA蛋白進行初步的探索，皆在為進一步研究HagA蛋白的功能提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

禽波氏桿菌(LL、XT)株，由山東農業大學預防獸醫學實驗室分離鑒定并保存。

1.2 載體與試劑

PMD18-TVector、細菌DNA提取試劑盒、PCR反應試劑盒均購自大連寶生物工程公司。膠回收試劑盒購自TIANGEN公司。

1.3 引物

根據GenBank已發表的禽波氏桿菌197N菌株的序列，BA3062538-BA3064682之間的序列為hagA基因序列，通過DNAstar軟件找到hagA基因序列的開放閱讀框，確定BA3062685至BA3064364之間序列為HagA蛋白的基因序列。利用Premier5.0引物設計軟件設計1對引物對hagA基因序列進行擴增。引物序列如下：

干部教育培訓是干部隊伍建設的先導性、基礎性和戰略性工程，互聯網的廣泛應用為干部教育提供了新的平臺?！?018－2022 年全國干部教育培訓規劃》指出要統籌整合網絡培訓資源，建設兼容、開放、共享、規范的全國干部網絡培訓體系。自2012 年中國干部網絡學院開通，到十九大以來干部網絡教育步入新時代，干部網絡教育以其能夠跨越時空局限的優勢已經成為干部教育領域不可或缺的一部分。

HagA-F: 5′-ATGGGGCTTTTGATGTGTTATTCG-3′

HagA-R: 5′-TTAGAACTGAGCTTGCAGCGTCA-3′

引物序列由華大基因有限公司合成，擴增基因產物片段大小約為1 680 bp。

1.4 禽波氏桿菌hagA基因克隆與測序

利用細菌DNA提取試劑盒進行禽波氏桿菌基因組DNA提取，以提取DNA為模板進行PCR擴增。反應條件如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。電泳鑒定并回收目的DNA，連接pMD18-T載體，并轉化到DH5α感受態細胞中，接種到含有氨芐青霉素(100 mg·L-1)的LB平板上進行培養，12 h后挑取陽性克隆菌落至LB液體培養基中培養。培養12 h后提取質粒，經PCR鑒定陽性后送華大基因有限公司測序。

1.5 禽波氏桿菌HagA蛋白的二級結構預測

將完成測序DNA序列利用DNAStar軟件翻譯為氨基酸序列，利用EXPASY網絡服務器上的SOPMA與GOR方法分析預測禽波氏桿菌HagA蛋白的二級結構[8-9]。

1.6 禽波氏桿菌HagA蛋白B細胞表位預測

選取3種主要參數進行分別預測，包括采用Kyle Doolittle的氨基酸親水性標準預測親水性參數(Hydrophilicity)[10]、用Jameson-Wolf方法預測抗原指數(Antigenicity index)[11]、以及用Emini方法預測可及性參數(Accessibility)[12]，比較各個參數的預測結果，進行綜合分析，然后確定HagA蛋白的B細胞抗原優勢表位。

2 結果與分析

2.1 禽波氏桿菌hagA基因的PCR擴增

禽波氏桿菌hagA基因的PCR擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳中顯示約為1 680 bp，片段大小與預期相符，電泳結果見圖1。

2.2禽波氏桿菌HagA蛋白理化性質及特定位點分析

M， DL2000 DNA相對分子質量標準； 1， 陰性對照； 2， 禽波氏桿菌(LL株)HagA； 3， 禽波氏桿菌(XT株)M， DL2000 DNA marker; 1， Negative control; 2， Bordetella avium HagA(LL strain); 3， Bordetella avium HagA(XT strain)圖1 hagA基因PCR的擴增結果Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR products for hagA gene

禽波氏桿菌hagA基因測序結果經DNAstar軟件翻譯為蛋白質序列表明LL與XT分離株的氨基酸同源性為100%，由559個氨基酸序列組成。與197N菌株hagA基因序列核苷酸同源性為89.2%。利用ProtParam分析軟件對HagA蛋白的氨基酸序列進行理化性質分析，分析結果顯示HagA蛋白的原子總數為8 652，分子式為C2754H4307N751O831S9。理論pI值為9.30，相對分子質量為61 522.56 u。N末端序列為Met(蛋氨酸)，酸性氨基酸總數(Asp+Glu)為43，堿性氨基酸總數(Arg+Lys)為53，不穩定系數為35.24，屬于穩定性蛋白。特定位點分析結果見表1。

2.3 禽波氏桿菌HagA蛋白二級結構的預測

利用EXPASY網絡服務器上的SOPMA與GOR方法進行HagA蛋白二級結構的預測，預測結果見圖2所示。兩種方法對HagA蛋白的預測結果基本相同，均表明HagA蛋白二級結構中柔性區域主要為無規轉曲，且無規轉曲有13個肽段位置，詳見表2。

2.4禽波氏桿菌HagA蛋白B淋巴細胞抗原表位的預測

首先應用KyleDoolittle的方法對HagA蛋白進行親水性預測，結果表明，HagA蛋白的親水性較大的區域有15個區段，再應用Jameson wolf方案預測HagA蛋白的抗原指數較高的區段，結果顯示有17個區段的抗原指數較高，最后應用Eminni方案預測HagA蛋白表面的可及性參數，結果顯示有11個區段出現在蛋白表面的可能性較大，而且表面可及性區段都位于HagA蛋白的親水性較高的區域。結果見圖3和表2所示。

不同方法預測的抗原表位的個數和出現的位置略有不同，但不同的預測方法一致表明在第103～112位、第127～133位、第158～163位、第205～212位、第243～251位、第327～331位、第356～368位這7個區域B淋巴細胞抗原表位的存在性較高。

表1禽波氏桿菌HagA蛋白功能區及作用位點

Table1The functional domains and activity sites of HagA protein

名稱Name氨基酸序列及結合位點Aminoacidsequenceandbindingsites糖基化位點N?glycosylationsiteNRTQ(67) NLSR(130) NESL(267) NNSR(357) NVSY(383) NVSS(475)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點CaseinkinaseⅡphosphorylationsiteSSID(89) SRDD(132) SVVD(155) SFTE(226) SNGD(406) THAE(416)蛋白激酶C磷酸化位點ProteinkinaseCphosphorylationsiteSPR(10) TER(73) TYK(102) TPK(109) SYK(211) TLK(321) TRK(325)SYR(374) SYR(385) SGR(544)N?肉豆蔻酰化位點N?myristoylationsiteGLLMCY(2) GIGLAK(17) GQTQSI(45) GNEINR(51) GVVNTV(98) GLSYTG(271) GNMATV(276) GVKSNF(334) GNTLGS(344) GSVGAL(348) GI?HRGW(488) GLDYGR(504) GLNIAM(521) GVFLTL(550)依賴于cAMP和cGMP的蛋白磷酸化激酶位點cAMP?andcGMP?dependentproteinkinasephosphorylationsiteRRSS(387)

表2多種預測方法對禽波氏桿菌HagA蛋白B細胞抗原表位的預測結果

Table2Epitopes predicted by various methods inB.aviumHagA protein

預測方法Methods肽段位置Results(Peptidesequence)二級結構Secondarystructure42?48、84?114、127?133、147?163、176?188、204?212、242?255、271?310、327?349、356?368、381?389、418?427、434?491、497?517、514?550親水性Hydrophilicity43?84、101?115、122?141、155?166、205?218、228?234、243?254、278?288、307?318、322?334、355?408、417?442表面可及性Surfaceprobability6?9、59?82、103?112、124?136、158?163、204?215、229?233、243?251、307?316、322?331、355?392抗原性Antigenicity6?12、44?86、102?115、122?140、155?164、203?222、228?236、241?251、278?293、308?316、321?333、342?352、356?370、375?392、415?477、504?512、542?552

SOPMA與GOR4為兩種不同的蛋白二級結構預測方法。h， α-螺旋；e， β-片層；c， 無規卷曲；t， β-轉角SOPMA and GOR4 indicated different prediction methods. h， α-helix; e， β-sheet; c， Random coils; t， β-turn圖2 B. avium HagA 二級結構預測Fig.2 Secondary structure prediction of B. avium HagA

圖3 B. avium HagA蛋白親水性、抗原指數及其表面可能性分析Fig.3 Analysis of hydrophilicity plot， antigenic index and surface probability of B. avium HagA protein

3 討論

禽波氏桿菌已經成為威脅養禽業的一種廣泛存在的細菌，由于其基因組比較大，編碼的蛋白也較為復雜[13-15]。目前針對其外膜蛋白OmpA蛋白研究比較多，而對HagA蛋白國內鮮有報道，有關文獻已經報道作為一種重要的毒力因子，HagA血凝素蛋白定位于菌膜表面是波氏桿菌特有表面結構蛋白，其是否具有良好的抗原性需進一步探索。本試驗對本實驗室分離保存的禽波氏桿菌(LL、XT)菌株進行HagA基因克隆測序，結果表明LL與XT分離株的氨基酸同源性為100%。以此為基礎，針對HagA蛋白的氨基酸序列利用生物學相關軟件預測其B細胞抗原優勢表位，為研究HagA蛋白的抗原性以及功能提供理論基礎。

本研究首先運用ProtParam分析軟件對禽波氏桿菌HagA蛋白的氨基酸序列進行理化性質及特定位點進行分析，對HagA蛋白有了基本了解。然后針對蛋白質抗原決定簇的預測，采用多種單參數預測模型和相關分析軟件結合的方法進行，多種參數的綜合考慮避免了單參數預測的局限性，提高了準確性[16]。應用生物學相關軟件對HagA蛋白二級結構、親水性、表面可及性三種尤為重要的參數進行預測。其中對二級結構的預測采用SOPMA、GOR4兩種方法結合的方式進行，兩種方法預測的結果相差不多，二級結構主要以無規轉曲和α-螺旋為主，有少量的β-片層，SOPMA預測的結果中有少量的β-轉角。親水性、表面可及性以及抗原性參數分別按照KyleDoolittle、Eminni、Jameson wolf的方法進行預測，多種預測方法進行綜合分析，結果顯示位于氨基酸序列中第103～112位、第127～133位、第158～163位、第205～212位、第243～251位、第327～331位、第356～368位，這7個區段為B細胞抗原表位優勢區域。

本研究首次針對禽波氏桿菌HagA蛋白利用生物學分析軟件進行了二級結構與B細胞抗原優勢表位的預測，為進一步探索HagA蛋白的抗原性以及其他生物學特性提供了理論依據，同時也為用HagA蛋白研制單抗以及對其免疫機理的研究提供了參考。

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SequencingandB-cellepitopespredictionofBordetellaaviumHagAprotein

YUAN Peng， ZHU Ruiliang， CUI Chenchen, YANG Pingping*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

This article is carried out to predict the secondary structure ofBordetellaaviumHagA and the dominant epitope of B cell antigen， in order to discuss the possibility of HagA protein in the production of monoclonal antibodies. In this study，hagAgene ofB.aviumwas amplified， cloned and sequenced. The secondary structure and B cell epitopes of the HagA protein ofB.aviumwere analyzed and predicted subsequently by using bioinformatics software. The results showed that theB.aviumHagA protein was supposed to include 7 potential antigen epitopes and 6 potential glycosylated sites. The results provide a theoretical basis for the further study of immune mechanisms， monoclonal antibodies preparation and epitope vaccine design.

Bordetellaavium; HagA; secondary structure; B-cell epitope prediction

S858.3

A

1004-1524(2017)10-1642-06

（責任編輯張 韻)