不同活性物質對大海馬爛尾病病原菌的體外抑菌作用研究

姜芳燕,楊寧,馮慧敏,武耀廷,3

(1.海南熱帶海洋學院 海南省熱帶海洋漁業資源保護與利用重點實驗室,海南 三亞 572022;2.三亞鑫海龍工貿有限公司,海南 三亞 572000; 3.海南大學, 海口 570228)

不同活性物質對大海馬爛尾病病原菌的體外抑菌作用研究

姜芳燕1,楊寧2,馮慧敏1,武耀廷1,3

(1.海南熱帶海洋學院 海南省熱帶海洋漁業資源保護與利用重點實驗室,海南 三亞 572022;2.三亞鑫海龍工貿有限公司,海南 三亞 572000; 3.海南大學, 海口 570228)

本研究考察不同活性物質對海馬爛尾病病原菌PseudoalteromonasspongiaeHL11的抑菌作用,結果表明茶多酚、大蒜素、沒食子酸、聚賴氨酸和乳酸5種活性物質具有抑菌效果,而其余13種活性物質沒有抑菌效果.進一步對其進行單因素實驗和正交實驗,其最優復合抑菌配方為:茶多酚27.5 mg.L-1、沒食子酸10 mg.L-1、乳酸10 mg.L-1、大蒜素30 mg.L-1、聚賴氨酸100 mg.L-1,其最大抑菌圈直徑為31.6 mm.本研究旨在為海馬實際生產中爛尾病的防治,提供一種無毒副作用、無藥物殘留和健康環保的養殖方式.

大海馬;海綿假交替單胞菌;抑菌實驗;正交實驗;活性物質

0 引言

海馬(Hippocampusspp.)又名落龍子,隸屬海龍科、海馬屬,是一種藥用價值和觀賞價值很高的小型海洋魚類[1].海馬品種龐雜,分類煩瑣,現階段全世界范圍內共有54種,其中我國沿海區域約有13種[2].伴隨著人類活動對海洋環境的破壞以及過度的捕撈活動,使得自然海域中野生海馬的數量急劇減少[3].為了平衡野生海馬資源保護和市場需求之間的矛盾,人工養殖海馬是其主要解決方案之一[4].

隨著海馬養殖的工廠化程度加深,其病害問題也不可避免地凸顯出來[5].海馬病害的主要種類有真菌性疾病[6]、細菌性疾病[4]和寄生蟲病[7],還有一些非細胞微生物比如病毒引起的疾病[8].魚類細菌性爛尾病是一種發生于世界范圍內的,嚴重危害眾多品種養殖魚類的疾病[9].嚴重時尾部爛掉,骨骼外露,傳染率高,死亡快,可引起病魚大批死亡.在海馬實際養殖過程易患爛尾病,其主要癥狀表現為尾部皮膚發白、潰爛、肝臟糜爛、腸道發白或透明等,不及時隔離治療會導致全部死亡.針對爛尾病的治療,目前已報道患爛尾病的斜帶石斑魚[10]、劍尾魚[9]、眼斑石首魚[11]和大黃魚[12]等常見養殖魚類均采用慶大霉素、環丙沙星、復方新諾明以及左氟沙星等抗生素作為實際養殖生產用藥.但是,抗生素的長期使用,不僅使病原菌產生耐藥性,而且會影響海馬自身的抗病能力,同時還存在著藥物殘留的問題[13].近年來,從天然植物特別是藥用植物中尋找純天然抗生物藥物已成為研究熱點[14].本課題組前期從患爛尾病的大海馬分離鑒定其病原菌為海綿假交替單胞菌(PseudoalteromonasspongiaeHL11),并進行相關的藥敏實驗.本研究對大海馬爛尾病原菌有抑菌作用的生物活性物質進行初步篩選,通過單因素實驗和正交實驗優化獲得最佳復合抑菌配方,旨在為海馬爛尾病的生物防治研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1實驗菌株

本實驗中所用的大海馬爛尾病原菌株為海綿假交替單胞菌(P.spongiaeHL11),由本課題組分離獲得,于冰箱4℃保藏.

1.2試劑

茶多酚、殼聚糖、甲殼素、甜菜堿、曲酸和聚賴氨酸購自山東西亞化學股份有限公司,沒食子酸購自天津市福晨化學試劑廠,大蒜素、蔓越莓提取物、紫雛菊提取物、馬卡根粉、黑升麻提取物、接骨木提取物、南非醉茄和迷迭香葉提取物均購自美國健安喜(GNC)股份有限公司,其他化學試劑均為國產分析純.

1.3培養基

酵母浸膏1 g,胰蛋白胨5 g,牛肉膏3 g,瓊脂20 g,用沉淀、過濾海水定容至1 L,pH 7.2.種子培養基為液體培養基,不加瓊脂.

1.4生物活性物質抑菌實驗

生物活性物質抑菌活性的測定采用瓊脂孔擴散對峙法.將菌懸液用生理鹽水稀釋至1.0×108cfu/mL,取100 μL均勻涂布于瓊脂培養基上,然后在培養基上成“十”字形等距離打孔,每平板打4個孔,取 50 μL待測活性物質加入孔內,30℃恒溫培養24 h后測量抑菌圈的直徑.

1.5生物活性物質初篩

在查閱文獻資料的基礎上,考察茶多酚、Nisin、殼聚糖、甜菜堿和生姜提取物等18種天然活性物質成分對病原菌P.spongiaeHL11的抑菌效果,進行有抑菌作用活性物質初篩.

1.6單因素優化

考察不同濃度活性物質對病原菌P.spongiae HL11抑菌效果.其中,茶多酚、乳酸和聚賴氨酸的濃度梯度均為100、50、25和12.5 mg.L-1.由于沒食子酸的溶解度和大蒜素純度的限制,將其溶度梯度設為40、20、10和5 mg.L-1.

1.7正交實驗

在單因素抑菌實驗的基礎上,綜合考慮沒食子酸的溶解度和單因素抑菌效果,將其溶度固定在10 mg.L-1.以茶多酚、乳酸、大蒜素和聚賴氨酸等活性物質濃度為4個因素,以抑菌圈直徑為響應值,采用L9(34)型正交試驗,確定病原菌P.spongiaeHL11最佳復合抑菌配方.采用國際通用的統計軟件MINITAB 15.0中的“DOE”模塊中的“田口設計”進行試驗方案的設計、試驗結果的統計分析與優化、相關圖表的生成等工作.具體的試驗因素與水平設計見表1.

1.8數據分析處理

所有抑菌實驗均為3個平行,選取抑菌圈比較明顯的平板測定其抑菌圈直徑,結果取3次重復實驗的平均值.正交實驗的方差分析采用MINITAB 15.0進行統計處理.

2 結果與討論

2.1有抑菌作用的生物活性物質初篩

分別考察茶多酚、Nisin、殼聚糖、甜菜堿和生姜提取物等18種天然活性物質成分對病原菌P.spongiaeHL11的抑菌效果.結果表明,茶多酚、乳酸、沒食子酸、聚賴氨酸和大蒜素等5種活性物質有較好的抑菌效果,而其他13種活性物質并無抑菌效果.

表2 不同生物活性物質對病原菌P.spongiae HL11的抑菌效果

2.2單因素優化

進一步研究5種活性物質對病原菌P.spongiaeHL11的抑菌效果,如圖1所示.結果顯示,茶多酚、沒食子酸、乳酸、大蒜素和聚賴氨酸對菌株HL11的抑菌圈直徑,都隨著濃度的增加而增加.

圖1 不同濃度的5種活性物質對病原菌P.spongiae HL11的抑菌效果

傳統水產養殖業中,為了防治魚病,經常在飼料中添加抗生素或激素,帶來藥物殘留和抗藥性等問題[15].天然食藥用活性物質,具有毒副作用小、高效、健康無害、無殘留等優點,避免由于使用抗生素帶來的抗藥性、養殖環境污染、藥物殘留超標等問題,同時滿足人們對綠色水產品的需求,符合無公害水產養殖的發展趨勢[16].茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱,具有較強的抗氧化能力強,抑菌譜廣,無毒副作用,可作為食品添加劑,被廣泛應用于畜禽飼料中[15].龍萌等[15]研究表明茶多酚能顯著提高了團頭魴幼魚的增重率、特定生長率以及肌肉中粗蛋白含量,降低了餌料系數.沒食子酸又稱為五倍子酸、棓酸,是中藥五倍子的主要有效成分之一,是現在許多常用于漁業生產中的單方或者復方中藥的抑菌有效活性成分之一[16].現有大量研究結果表明,五倍子對魚、蝦、中華鱉、鋸緣青蟹等水產動物的氣單胞菌屬、弧菌屬等許多致病菌表現出很強的抑菌抗菌性能[16].乳酸廣泛存在于如泡菜、腌肉、橄欖及酸奶等發酵食品中.喬支紅等[17]研究報道乳酸對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、埃希氏大腸桿菌等3株食源性致病菌均有不同程度的抑制作用.大蒜素是大蒜瓣和蒜精油中含硫化合物的總稱,是大蒜的主要生物活性成分,具有不同程度的抑菌作用,被譽為天然抑菌劑[18].大量研究表明,大蒜素能有效抑制氣單胞菌、愛德華氏菌、鰻弧菌、魯耶爾森氏菌等淡水魚類的主要致病菌,對草魚腸炎病、爛腮病、赤皮病和鰱魚的出血病以及魚類的暴發性傳染病都特別有效[18].聚賴氨酸是由鏈霉菌屬的少數菌種代謝產生的具有明顯抑菌功能的L-賴氨酸聚合物,聚合度通常在25～35個賴氨酸[19].聚賴氨酸作為一種天然的微生物代謝產物,具有完全的可降解特性及生物相容性,在食品、營養保健、生物醫學、材料、農業化學等領域均有廣泛應用[20].上述5種活性物質,除沒食子酸和大蒜素已應用于水產病害防治,其余的尚未有相關的應用報道.在本研究中,這5種活性物質對海馬爛尾病病原菌P.spongiaeHL11的抑菌圈直徑與課題組前期藥敏實驗中的大部分常用抗生素相當,且未表現出耐藥性.而且茶多酚等5種活性物質,均為天然食藥用成分,能通過海馬代謝完全,無藥物殘留,無毒副作用,且不會產生抗藥性,也不會對海馬養殖水體環境造成污染.

2.3正交實驗優化

采用正交實驗設計從4個通過單因素抑菌實驗篩選出的影響因子(即茶多酚、乳酸、聚賴氨酸和大蒜素)中篩選出具有顯著影響因子.每個因子均采用高中低3個水平,正交實驗設計及結果分析見表3,方差分析見表4.

以抑菌圈直徑為響應值,對正交實驗進行極差分析(表3).R值反應某個因素對實驗結果的影響程度,極差越大則該因素對實驗的結果影響越顯著,反之影響會下降.由表3可知,不同活性物質對病原菌P.spongiaeHL11的抑菌作用影響依次為D>C>A>B,即聚賴氨酸>大蒜素>茶多酚>乳酸.K值大小顯示各因素水平對各活性物質抑菌活性的影響程度.各活性物質每個水平對病原菌P.spongiaeHL11的抑菌作用依次為A2>A1>A3,B1>B2>B3,C3>C2>C1,D3>D2>D1.根據以上正交實驗結果分析可知,其最優抑菌復合配方為：A2B1C3D3,即茶多酚27.5 mg.L-1、乳酸10 mg.L-1、大蒜素30 mg.L-1和聚賴氨酸100 mg.L-1.

表3 正交實驗結果及極差分析

針對以上結果,采用Minitab15.0軟件進行方差分析,結果如表4所示,茶多酚、大蒜素和聚賴氨酸的P值小于0.05,均為顯著因子,其中聚賴氨酸對抑菌圈直徑影響最大,其次是茶多酚,最后是大蒜素.而乳酸的P值為0.598,屬于不顯著因子,其F值為0.53(<1),說明乳酸對抑菌圈直徑的影響比誤差項還小.因此四種活性物質濃度對病原菌P.spongiaeHL11的抑菌效果依次為聚賴氨酸>茶多酚>大蒜素>乳酸,與表3極差分析相一致.

表4 方差分析結果

圖2 五種活性物質的主效應圖

由各活性物質的主效應圖(圖2)可知,其最佳抑菌配方為茶多酚濃度(A2)為27.5 mg.L-1,乳酸濃度(B1)為10 mg.L-1,大蒜素濃度(C3)為30 mg.L-1,聚賴氨酸濃度(D3)為100 mg.L-1,與表3極差分析相吻合.為檢驗正交實驗所得結果的可靠性,采用上述最優抑菌配方進行6次重復試驗驗證,結果顯示抑菌圈直徑大小平均值為31.6 mm,與理論預測值相吻合.因此,基于正交實驗優化的天然活性物質對病原菌P.spongiaeHL11抑菌復合配方準確可靠,可用于實際養殖生產中.

3 結論

本研究以大海馬爛尾病病原菌P.spongiaeHL11為研究對象,從茶多酚、Nisin、殼聚糖、甜菜堿和生姜提取物等18種天然活性物質成分篩選對其有抑菌作用的活性物質.體外抑菌實驗結果表明,茶多酚、大蒜素、沒食子酸、聚賴氨酸和乳酸等5種活性物質具有抑菌效果,而其余13種活性物質無抑菌作用.通過單因素實驗,確定5種活性物質具有抑菌作用的濃度范圍.進一步通過正交實驗優化各活性物質的最優抑菌復合配方.根據抑菌實驗的結果,確定復配活性物質的最佳組合為：茶多酚27.5 mg.L-1、沒食子酸10 mg.L-1、乳酸10 mg.L-1、大蒜素30 mg.L-1和聚賴氨酸100 mg.L-1,其最大抑菌圈直徑為31.6 mm.

以天然食藥用活性物質代替傳統抗生素在水產病害防治的應用,不僅能避免抗藥性、藥物殘留、微生態平衡破壞、養殖環境污染等問題,而且可以提高其安全性,發展無公害水產養殖,具有重要的經濟價值和社會價值.本研究旨在為海馬實際生產中爛尾病的防治,提供一種無毒副作用、無藥物殘留和健康環保的養殖模式.課題組下一步將根據各種活性物質的抑菌機理、配伍方法、無公害養殖要求等,開發具有高效、無毒和使用方便等優點的活性物質復方配方,以拓展生物活性物質在水產養殖領域的應用范圍.

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InvitroAntibacterialActivityofVariousActiveSubstancesagainstTail-rotDiseasePathogenofHippocampuskuda

JIANG Fang-yan1, YANG Ning2, FENG Hui-min1, WU Yao-ting1,3

(1.Key Laboratory of Tropic Sea Fishery Protection and Utilization of Hainan Province, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022, China;2.Sanya Xin Hailong Industry and Trade Co.Ltd., Sanya Hainan 572000, China;3.Hannan University, Haikou 570228, China)

In the study, various active substances were tested for their antibacterial activity against tail-rot disease pathogenPseudoalteromonasspongiaeHL11 ofHippocampuskuda. The results indicated that 5 active substances—tea polyphenols, lactic acid, gallic acid, allicin and polylysine had antibacterial effect, while other 13 kinds of bioactive substances had no bacteriostatic effect.And then, the optimal antibacterial formulas gained by single factor experiment and orthogonal experiment are as follows:tea polyphenols 27.5 mg.L-1, gallic acid 10 mg.L-1, lactic acid 10 mg.L-1, allicin 30 mg.L-1， and polylysine 100 mg.L-1.Under optimal conditions, the maximum diameter of the inhibition zone was 31.6 mm.The aim of this study is to provide a non-toxic side effect, no drug residue, healthy and environmentally friendly culture mode for the control of tail-rot disease of seahorses in the actual production.

Hippocampuskuda;Pseudoalteromonasspongiae; antibacterial test; orthogonal experiment; bioactive substances

格式：姜芳燕,楊寧,馮慧敏,等.不同活性物質對大海馬爛尾病病原菌的體外抑菌作用研究[J].海南熱帶海洋學院學報,2017,24(5):14-20.

2017-06-06

海南省重大科技項目(ZDKJ2016009);海南省應用技術研發與示范推廣專項(ZDXM2015006);海南省科技興海專項(XH201403);三亞市專項科研試制(2014CZ09);三亞市院地科技合作項目(2015YD07)

姜芳燕(1984-),女,浙江衢州人,海南熱帶海洋學院生命科學與生態學院副教授,博士,研究方向為水產養殖動物病害防治．

武耀廷(1962-),男,河南駐馬店人,海南大學研究員,博士,研究方向為生物生態和農業科學.

S9

A

2096-3122(2017) 05-0014-07

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.03

(編校李由明)