甲醇超聲溶解-HPLC法測定蜂膠黃酮類化合物含量

陳 文,王湘君,李凌燕, 王玉杰,黃宇志, 錢 明,趙秀志,孟凡猛

(海南熱帶海洋學院 a.海洋科學技術學院; b.生命科學與生態學院,海南 三亞 572022)

甲醇超聲溶解-HPLC法測定蜂膠黃酮類化合物含量

陳 文a,王湘君b,李凌燕a, 王玉杰b,黃宇志a, 錢 明a,趙秀志a,孟凡猛a

(海南熱帶海洋學院 a.海洋科學技術學院; b.生命科學與生態學院,海南 三亞 572022)

為優化五指山蜂膠測定黃酮類化合物實驗條件,研究運用甲醇溶劑超聲溶解浸出法處理蜂膠樣品,除去蜂膠中的蜂蠟及脂溶性雜質;輔以高效液相色譜(HPLC)法,以甲醇-0.4%磷酸(55/45,V/V)為流動相,在檢測波長為270～360 nm條件下,測定蜂膠中7種黃酮類化合物含量;結果發現甲醇溶劑超聲溶解浸出法處理樣品操作簡單快捷,與常規分析方法相比,HPLC法測定簡便快速,回收率高,檢出限低,精密度高,受干擾影響小,準確性好.結論:五指山蜂膠黃酮類化合物的含量均在國家標準含量范圍內,且該測定方法令人滿意.

五指山;蜂膠;超聲溶解; HPLC;黃酮類

0 引言

五指山蜂膠是一種天然、安全、具有多種生物活性的物質,化學成分非常豐富,含有大量黃酮類化合物,被譽為“紫色黃金”[1].國內專家對蜂膠研究的領域也非常廣泛,張翠平等[2]介紹了蜂膠中所含的黃酮類物質的種類;李帥[3]得出了對蜂膠中黃酮類化合物的最佳提取工藝方法,并對提取蜂膠總黃酮進行分離純化,對純化后的蜂膠黃酮提取物進行抗氧化和抑菌功效的研究,找到了各類分離純化方法的最佳條件;焦月華[4]等總結了多種物質總黃酮類化合物的提取及提純方法,為蜂膠中黃酮類化合物檢測提供了校好的方法參考;各國科學工作者對蜂膠的化學成分進行了大量研究,Mohammadzadeh等[5]對伊朗德黑蘭的蜂膠進行TMCS衍生化后,經GC-MS檢測,主要化合物為短葉松素、短葉松素-3-乙酸酯、松屬素、球松素、柯因和高良姜素,其化學組成表明,該蜂膠是典型的楊樹型蜂膠,并從蜂蜜中鑒定出7種異黃酮類化合物[6]

1 材料與方法

1.1材料與儀器

五指山原生態蜂膠;蘆丁、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山萘酚、喬松素、高良姜素(廣州市齊云生物科技有限公司)、甲醇(色譜純)、磷酸(分析純)和超純水(娃哈哈純凈水);高氯酸G.R.(天津市科密歐化學試劑有限公司);硝酸G.R.(洛陽昊華化學試劑開發中心);氫氟酸G.R.(天津市科密歐化學試劑開發中心);鹽酸G.R.(鄭州派尼化學試劑廠);所用玻璃器皿等均用5%硝酸溶液浸泡24 h以上.

AB104-S萬分位天平,瑞士Mettler Toledo公司;島津LC-2010A高效液相色譜儀,包括紫外檢測器、二元泵、在線脫氣機和自動進樣器;JU-6224型超聲發生器,上海杰恩普超聲設備有限公司;島津TU-1901雙光束紫外分光光度計;容量瓶:25 mL,50 mL,100 mL,1000 mL,吸量管:0.5 mL,2 mL,5 mL,10 mL,常用的玻璃儀器等.

1.2 實驗方法

1.2.1樣品前處理

樣品前處理先采用甲醇溶劑超聲溶解浸出法;后采用島津LC-2010A高效液相色譜儀進行檢測.

1.2.2甲醇溶劑超聲溶解浸出法

稱取試樣0.5000 g(精確至0.0001 g)4份置于小燒杯中,分別用9 mL甲醇超聲溶解,加入6 mL 0.1% 甲酸,用JU-6224型超聲發生器溶解,再用甲醇定容于50 mL容量瓶中備用,見表1.

表1 甲醇溶劑超聲溶解條件的比較

甲醇超聲微波溶解的蜂膠樣品溶液所測出的圖譜中檢出峰更明顯,基線更加平穩.因此,選擇溫度28℃、功率240W、保留時間10 min作為本次試驗的樣品前處理方法.

1.3檢測條件

1.3.1紫外分光光度計法

將各標準對照樣品溶液及蜂膠樣品溶液在TU-1901雙光束紫外分光光度計光譜進行預掃描,發現各標準對照樣品溶液及蜂膠樣品中黃酮類化合物的紫外吸收波長均在270 nm、360 nm之間.

1.3.2 HPLC法

根據紫外可見分光光度計光譜預掃描曲線顯示的數值,實驗中7種黃酮類化合物標準對照品溶液及蜂膠樣品溶液在波長為270 nm和360 nm處均有吸收峰.為進一步確定HPLC色譜條件,分別在270 nm和360 nm波長下對紫外可見分光光度計光譜中所用蜂膠樣品溶液進行檢測,確定最佳檢測波長,如圖1.

圖1 蜂膠標準對照品溶液及蜂膠樣液HPLC圖譜(數據1:270 nm,數據2:360 nm)

通過對蜂膠樣品溶液、標準對照品溶液的紫外分光光度計的檢測以及HPLC在相應波長下的檢測發現,波長在270 nm下蜂膠樣品溶液和標準對照品溶液的檢出峰峰型完整、緊湊,容易觀察,檢測波長定位于270 nm波長處.

1.3.3檢測方法的確定

實驗的結果發現,最佳前處理方法為甲醇溶劑超聲溶解法,條件為溫度28℃、功率240W、保留時間10 min;檢測波長為270 nm.

1.4樣品的檢測

1.4.1色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-3(150×4.6 mm,5 μm),柱溫:38℃；流動相:甲醇和0.4%磷酸(二者比例55:45),流速1 mL/min,進樣量10 μL；檢測波長270 nm.

1.4.2樣品制備

稱取試樣0.5000 g(精確至0.0001 g),置于50 mL三角瓶中,分別用9 mL甲醇超聲溶解,加入6 m L 0.4% 磷酸,用CW-2000超聲微波協同萃取儀在溫度28℃、功率240W、保留時間10 min的條件下溶解,再用甲醇定容,用0.45 μm 濾膜過濾,制得樣品溶液.

2 結果與討論

2.1標準曲線的繪制

稱取蘆丁、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山萘酚、喬松素和高良姜素標準對照品1.0 mg,分別置于50 mL容量瓶中,用甲醇定容,搖勻制得標準溶液.分別取4 mL蘆丁、槲皮素、楊梅素、芹菜素、喬松素標準對照品溶液,10 mL山萘酚標準對照品溶液,15 mL高良姜素標準對照品溶液于50 mL容量瓶中,用甲醇定容,制得混合標準溶液;分別取蘆丁、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山萘酚、喬松素和高良姜素標準液,使用超純水配制成濃度為20 μg/mL的母液;再分別量取母液,并分別稀釋至濃度為0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 μg/mL,每種標準品的濃度C(μg/ mL)為橫坐標,峰面積A為縱坐標繪制標準曲線;得回歸方程,并計算其相關系數R2,見表2.

表2 7種黃酮類化合物標準溶液曲線及相關系數

數據及曲線圖表明,線性范圍在0～6.00 μg/mL內,線性方程相關系數R2在0.9997以上.

2.2 HPLC譜圖

2.2.1定性分析譜圖

根據各檢出峰的出峰時間,確定所含物質是否相同,即蜂膠樣品溶液中所含物質出峰時間與標準對照品溶液出峰時間相同,在270 nm波長下對每種標準對照品溶液及蜂膠樣品溶液進行進樣掃描,光譜圖如下.

HPLC光譜圖顯示,蜂膠樣品溶液中蘆丁、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山萘酚、喬松素、高良姜素出峰時間分別是4.9、10.1、6.2、14.8、12.4、23.1、34.2 min,與標準品基本一致.

2.2.2標準對照品混合液HPLC譜圖

由于實驗中選用的流動相對標準對照品混合液物質分離的效果不佳,檢出峰較少,且不規則,即采用單個標準對照品溶液進行對照分析,標準對照品混合液HPLC光譜圖見圖10.

2.3蜂膠樣品溶液中各黃酮類化合物含量

采用高效液相色譜法(HPLC)法來測定五指山蜂膠中黃酮類化合物蘆丁、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山萘酚、喬松素、高良姜素的含量.實驗結果見表3.

表3 蜂膠樣品測量結果 n=6

實驗數據表明,五指山蜂膠中黃酮類化合物總含量為82.680 mg/g,占樣品總量的8.2%,其中蘆丁所占總黃酮最多,含量為15.280 mg/g.

2.4結果準確度分析

為保證實驗數據的可靠性與真實性,減少實驗誤差,確保實驗結果更加準確,研究分別進行精密度實驗、方法檢出限實驗和加標回收率實驗,進一步檢驗研究結論的可信度.

2.4.1精密度實驗

精密度(precision)系指用該法選擇同一勻質樣品在相同條件下重新進行實驗,記錄測量值.比較彼此符合的程度[7-9].兩組測量值相比較越接近則越精密,常用標準(偏)差(standard deviation,SD或S);相對標準(偏)差(relative standard deviation,RSD),也稱變異系數(coefficient of variation,CV),分析時,常用RSD表示精密度;現分別取蘆丁、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山萘酚、喬松素和高良姜素濃度為1.0 μg/mL的標準液,在特定儀器工作參數下進行測定3次,并根據測定的濃度結果計算其標準偏差,結果見表4.

表4 黃酮類化合物精密度實驗

計算結果顯示各物質相對標準偏差均在0.2%以下,儀器精密度較高.

2.4.2方法檢出限

檢出限是評價一個分析方法及測試儀器性能的重要指標,是指某一特定分析方法,在給定的顯著性水平內,可以定性地從樣品中檢出待測物質的最小濃度或最小量;所謂“檢出”是指定性檢出,在檢出限附近不能進行準確的定量[10-13];現將蜂膠的空白樣品測定10次,依據公式DL=3SD/S,S為校準曲線斜率[14-15],計算出黃酮類化合物檢出限,結果見表5.

表5方法檢出限測定結果(n=10)

黃酮類化合物平均空白標準標準偏差斜率檢出限蘆丁0.263848.730.00092962槲皮素0.264776.540.00101959楊梅素0.055782.640.00209816芹菜素0.262645.760.00040619山萘酚0.350370.590.00213332喬松素0.261541.400.00144625高良姜素0.262370.5900.00212094

由方法檢出現測定結果可知檢出限在0.002之內,結果較好.

2.4.3加標回收實驗

加標回收實驗分為樣品加標回收和空白加標回收.實驗采用的是樣品加標回收實驗:取兩份相同的樣品,其中一份加入定量的待測成分標準物質;兩份同時按相同的分析步驟分析,加標的一份所得的結果減去未加標一份所得的結果,其差值同加入標準物質的理論值之比即為樣品加標回收率[16].加標回收率計算公式:加標回收率= (加標試樣測定值-試樣測定值)÷加標量×100%;現取實驗樣品1(低含量:濃度為0.1 mg/標準液),樣品2(高含量:濃度為1.0 mg/標準液)平行制備為6份溶液,其中3份加入蘆丁、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山萘酚、喬松素和高良姜素標準對照品溶液;另外3份直接進行測定,并求其平均值.加標回收率計算公式:[(加標試樣測定值-試樣測定值)/加標值]×100%[17],營養元素見表6.

表6黃酮類化合物回收率測定結果(n=6)

黃酮類化合物名稱試樣值0.1/mg加標試樣測定值/mg回收率/%試樣RSD/%加標試樣RSD/%試樣值1.0/mg加標試樣測定值/mg回收率/%試樣RSD/%加標試樣RSD/%蘆丁0.09950.2005101.000.09960.2007101.100.09990.2008100.900.170.120.99972.0003100.060.99882.0012100.240.99991.999599.960.050.07

續表6

為進一步驗證實驗方法的可靠性,研究通過低含量加標和高含量加標進行測試并計算其回收率,黃酮類化合物計算結果見表3.樣品1(低含量:濃度為0.1 mg/標準液):蘆丁的回收率在100.9%～101.1%之間,RSD為0.12%,槲皮素的回收率在99.8%～100.1%之間,RSD為0.17%,楊梅素的回收率99.5%～100.1%之間,RSD為0.16%,芹菜素的回收率在98.9%～100.5%之間,RSD為0.56%,山萘酚的回收率在99.3%～100.5%之間,RSD為0.29%,喬松素的回收率在99.7%～100.9%之間,RSD為0.43%,高良姜素的回收率在99.7%～99.9%之間,RSD為0.12%;樣品2(高含量:濃度為1.0mg/標準液):蘆丁的回收率在100%～100.2%之間,RSD為0.07%,槲皮素的回收率在99.8%～100.1%之間,RSD為0.06%,楊梅素的回收率99.7%～100%之間,RSD為0.08%,芹菜素的回收率在99.9%～100%之間,RSD為0.07%,山萘酚回收率在100%～100.5%之間,RSD為0.04%,喬松素的回收率在100%～100.2%之間,RSD為0.11%,高良姜素的回收率在96.8%～100.1%之間,RSD為0.01%;加標回收率實驗得出:該研究無論是低含量或是高含量7種黃酮類化合物的加標回收率在96.8%～100.2%之間,并且其RSD結果均小于1%,即蜂膠樣品的基質效應對本方法影響較小,檢測方法穩定可靠,發現回收率結果高濃度較低濃度好.

3 結論

研究采用微波消解和甲醇溶劑超聲溶解法對蜂膠樣品分別進行處理,甲醇溶劑超聲溶解法更適合高效液相色譜法檢測要求,樣品處理充分徹底;各物質在0～6000 μg/L測定線性范圍,呈現出良好線性關系,線性方程相關系數均在0.9997以上,加標回收率為96.8%～100.2%,運用高效液相色譜法(HPLC)測定了蜂膠中黃酮類化合物:發現海南五指山蜂膠中含有豐富的黃酮類化合物:如蘆丁、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山萘酚、喬松素、高良姜素等,測定結果發現蘆丁的含量最高,其次是芹菜素,接著是楊梅素,其他四種黃酮類化合物均有檢測到,黃酮類化合物的含量均在國家標準含量范圍內[18];其總含量接近8.2%,超出國家標準含量8倍左右,屬于二級蜂膠[19],實驗結果滿意.

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ContentDeterminationofFlavonoidsfromPropolisbyMethanolUltrasonicDissolution-HPLC

CHEN Wena, WANG Xiang-junb, LI Ling-yana, WANG Yu-jiea,HUANG Yu-zhia, QIAN Minga,ZHAO Xiu-zhia, MENG Fan-menga

(a.School of Ocean Science and Technology;b.School of Life Science and Ecology,Hainan Tropic Ocean University, Sanya Hainan 572022, China)

To optimize the experimental condition of determinating flavonoids compounds from propolis in Wuzhishan, the propolis samples were dealt with by methanol ultrasonic dissolution, in order to remove wax and fat-soluble impurities in propolis. 7 kinds of flavonoids compounds content were determinated by HPLC with Mobile phase—methanol-0.4% phosphoric acid (55/45, V/V)—at the detection wavelength of 270-360 nm.The operation of methanol ultrasonic dissolution is simple and quick.Compared with conventional analysis methods, HPLC has advantages such as simple and rapid determination, high recovery rate, low detection limit, high precision, low interference, and high accuracy.The result demonstrates that the content of flavonoids in propolis from Wuzhishan is within the range of the national standard, and the method is satisfactory.

Wuzhishan; propolis; methanol ultrasonic dissolution; HPLC; flavonoids

格式：陳文，王湘君,李凌燕，等.甲醇超聲溶解-HPLC法測定蜂膠黃酮類化合物含量[J].海南熱帶海洋學院學報,2017,24(5):81-87.

2017-05-13

陳文(1980-),男,海南東方人,海南熱帶海洋學院海洋科學技術學院副教授,碩士,研究方向為天然產物化學成分分析、提純、鑒定.

王湘君(1982-),女,重慶巴南人,生命科學與生態學院副教授,碩士,研究方向為生態學、動物學.

O656

A

2096-3122(2017) 05-0081-07

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.14

(編校李由明)