土壤重金屬和有機(jī)污染物的微生物修復(fù)：生物強(qiáng)化和生物刺激

郝大程 周建強(qiáng) 韓君

（1. 大連交通大學(xué)環(huán)境化工學(xué)院 生物技術(shù)研究所，大連 116028；2. 北京新源國(guó)能科技集團(tuán)股份有限公司，北京 100016）

土壤重金屬和有機(jī)污染物的微生物修復(fù)：生物強(qiáng)化和生物刺激

郝大程1周建強(qiáng)2韓君2

（1. 大連交通大學(xué)環(huán)境化工學(xué)院 生物技術(shù)研究所，大連 116028；2. 北京新源國(guó)能科技集團(tuán)股份有限公司，北京 100016）

生物強(qiáng)化和生物刺激等綠色技術(shù)以其經(jīng)濟(jì)有效、生態(tài)友好的特性，已逐漸成為治理土壤重金屬和有機(jī)污染的利器。多種細(xì)菌、真菌及混合菌群可與物理化學(xué)修復(fù)手段靈活組合，針對(duì)性開(kāi)展土壤有機(jī)污染、重金屬污染及復(fù)合污染修復(fù)。總結(jié)近5年代表性研究結(jié)果，討論處理菌株的多來(lái)源篩選，其轉(zhuǎn)化/降解不同類(lèi)型污染物的潛力，著重其在多尺度土壤治理案例中的應(yīng)用，包括實(shí)驗(yàn)室、溫室和場(chǎng)地條件下的修復(fù)表現(xiàn)。微生物修復(fù)的復(fù)雜性不僅由于菌的生理和代謝特性差異，還表現(xiàn)在影響因素眾多，包括非生物因素，如pH、溫度、土壤類(lèi)型、污染物濃度、水和有機(jī)質(zhì)含量，外加碳源和氮源等生物因素，如接種量，外加菌株和原地土著菌互作，接種物存活等。指出今后聯(lián)合修復(fù)思路和加強(qiáng)分子方法應(yīng)用的研究方向。

土壤；微生物修復(fù)；有機(jī)污染物；重金屬；聯(lián)合修復(fù)

土壤重金屬污染源以礦山開(kāi)采和電鍍廠的廢水排放為主。物理化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，生物修復(fù)成本較低、效果較好、操作較簡(jiǎn)單。土壤生物修復(fù)包括植物修復(fù)和微生物修復(fù)［1］，目前微生物修復(fù)研究以微生物吸附和氧化還原重金屬及微生物礦化固結(jié)重金屬離子為主，后者通過(guò)微生物分泌有機(jī)質(zhì)將離子態(tài)重金屬轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)礦物［2］。土壤重金屬污染持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可引起生物放大效應(yīng)，在食物鏈中累積［3］。微生物修復(fù)經(jīng)濟(jì)高效，環(huán)境友好。目前對(duì)金屬-微生物互作過(guò)程和機(jī)理研究逐漸深入，開(kāi)發(fā)了多種重金屬解毒/修復(fù)的新方案。

多 環(huán) 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類(lèi)具有致癌、致畸、致突變性質(zhì)的持久性有機(jī)污染物，中國(guó)土壤PAHs污染嚴(yán)重，微生物修復(fù)因其低成本、高效、污染少等優(yōu)點(diǎn)受到關(guān)注。細(xì)菌主要產(chǎn)生雙加氧酶來(lái)催化PAHs的加氧反應(yīng)［4］，真菌通過(guò)分泌木質(zhì)素降解酶系或單加氧酶來(lái)氧化PAHs［5］。兩種途徑均首先降低PAHs的穩(wěn)定性，使其容易被進(jìn)一步降解。微生物修復(fù)技術(shù)正逐步應(yīng)用于PAHs污染土壤的實(shí)地修復(fù)，已取得一定成效。

殺蟲(chóng)劑和除草劑在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)管理系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，常規(guī)用于防治害蟲(chóng)和雜草以及相關(guān)的植物病害，減少或消除損失，保障提供高質(zhì)量農(nóng)產(chǎn)品。然而，持續(xù)廣泛的使用農(nóng)藥對(duì)公眾健康和環(huán)境造成潛在的威脅［6］。例如，殺蟲(chóng)劑進(jìn)入環(huán)境后，經(jīng)歷代謝轉(zhuǎn)化/降解，吸附/解吸附，揮發(fā)，植物攝取，進(jìn)入表層水和轉(zhuǎn)運(yùn)至地下水等多條路徑［7］。代謝轉(zhuǎn)化或降解是其中的關(guān)鍵過(guò)程，包括非生物降解（如氧化、水解和光解）和生物降解。由此，有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化成降解產(chǎn)物，或完全礦化進(jìn)入碳循環(huán)［8-9］。微生物降解通常是最重要的過(guò)程［10］，有機(jī)污染物的分子結(jié)構(gòu)決定其物理化學(xué)性質(zhì)和其生物降解屬性。例如，某些殺蟲(chóng)劑不溶于水，且緊密吸附于土壤顆粒。故這類(lèi)化合物的生物利用度較低，難以生物降解，其殘余物可在土壤中長(zhǎng)期存留，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)影響較大［11］。

有機(jī)污染物對(duì)土壤生物學(xué)的有害效應(yīng)，包括土壤微生物群落的定性和定量的改變，酶活性改變，土壤氮平衡的變化（抑制固氮菌和硝化菌，干擾氨化過(guò)程），破壞菌根共生和豆科根瘤形成等。這些間接和直接的效應(yīng)繼而影響植物生長(zhǎng)和土壤肥力［12］。

有機(jī)污染物帶來(lái)的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)使人們要限制其應(yīng)用，設(shè)計(jì)新型的環(huán)境友好的農(nóng)藥，開(kāi)發(fā)有效的污染治理方案，包括更多生物技術(shù)的使用。微生物修復(fù)技術(shù)是利用微生物（土著菌、外來(lái)菌和基因工程菌）對(duì)污染物的代謝作用而轉(zhuǎn)化、降解污染物，主要用于土壤中有機(jī)污染物的降解。通過(guò)改變各種環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)、氧化還原電位、共代謝基質(zhì)，強(qiáng)化微生物降解作用以達(dá)到治理目的。微生物修復(fù)方法包括強(qiáng)化自然遞減（Enhanced natural attenuation），生物刺激技術(shù)（Biostimulation）和生物強(qiáng)化技術(shù)（Bioaugmentation）等（圖1）。生物強(qiáng)化是指加入古菌、細(xì)菌或真菌培養(yǎng)物，加速降解污染物［6，13］。起源于污染物所在場(chǎng)地的微生物通常有一定分解能力，但是當(dāng)污染物過(guò)載時(shí)，外加菌能協(xié)助降解。生物強(qiáng)化技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)，如能在處理局地維持高濃度生物量，提高處理負(fù)荷；可選擇性固定優(yōu)勢(shì)菌種，提高難降解有機(jī)物的降解效率；抗毒物能力強(qiáng)；對(duì)土質(zhì)及pH變化有較好的穩(wěn)定性。當(dāng)然，篩選表征適于生物強(qiáng)化的菌株需要投入的人力物力都要考慮，適宜的菌株可能需要大量的馴化工作才能獲得，而轉(zhuǎn)基因菌株的安全性必須考慮，慎重使用。生物刺激是指修飾環(huán)境，刺激土著菌使其能進(jìn)行生物修復(fù)［14-15］。可加入多種限速營(yíng)養(yǎng)素和電子受體，如磷、氮、氧或碳。加入電子供體（有機(jī)底物）可刺激修復(fù)厭氧環(huán)境的鹵代污染物，使土著菌以鹵代污染物為電子受體。生物刺激有可能充分利用土著菌的修復(fù)潛力，但是受環(huán)境因素（如污染時(shí)間長(zhǎng)短和污染物的成分）影響，修復(fù)效果變異大。過(guò)多加肥會(huì)降低微生物的降解能力。生物強(qiáng)化技術(shù)可加強(qiáng)生物刺激，兩者常可聯(lián)用，故總稱(chēng)為生物修復(fù)（Bioremediation）［13-14］。

本文綜述近5年代表性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，側(cè)重介紹（1）用適宜的細(xì)菌和真菌菌株，混菌（Consortia）或基因工程菌（GEMs）對(duì)污染土壤進(jìn)行生物強(qiáng)化（圖2），聯(lián)用生物刺激，降解多種類(lèi)型污染物；（2）影響微生物修復(fù)的生物和非生物因素；（3）重金屬、有機(jī)物復(fù)合污染，需要生物修復(fù)和非生物修復(fù)（如植物仿生修復(fù)）聯(lián)用。微生物修復(fù)技術(shù)已成功應(yīng)用于煤氣廠址PAHs污染修復(fù)，石油烴污染土壤修復(fù)，農(nóng)藥污染土壤修復(fù)等領(lǐng)域。微生物修復(fù)的優(yōu)點(diǎn)是費(fèi)用低、易操作及沒(méi)有二次污染等。

圖1 生物強(qiáng)化和生物刺激示意

圖2 面向污染場(chǎng)地生物強(qiáng)化的降解/解毒菌篩選

1 土壤重金屬的微生物修復(fù)

1.1 砷污染土壤

As（III）氧化菌可用于砷污染修復(fù)。從砷污染場(chǎng)地土壤和水樣中分離兩個(gè)?-變形桿菌菌株［18］，不動(dòng)桿菌屬JHS3和克雷白桿菌屬JHW3，它們能自養(yǎng)氧化As（III）-As（V），氧是電子受體。兩菌都有aioA基因，編碼亞砷酸鹽氧化酶，能進(jìn)行化學(xué)無(wú)機(jī)自營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，并以As（III）（10 mM）為電子供體。異養(yǎng)條件下兩菌株細(xì)胞生長(zhǎng)和As（III）氧化速率明顯改善。厭氧條件下，僅JHW3氧化As（III），電子受體為硝酸鹽或生物電化學(xué)系統(tǒng)的固態(tài)電極。有氧As（III）氧化時(shí)JHW3的Vmax和Km高于JHS3。JHW3可用于地表面下的砷污染修復(fù)。

1.2 鉛污染土壤

目前Pb（II）土壤污染日益嚴(yán)重，尤其農(nóng)用地鉛污染通過(guò)食物鏈嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的健康。多種微生物通過(guò)生物累積，沉淀或加速轉(zhuǎn)化Pb（II）至穩(wěn)定礦物等機(jī)制，移除或固定土壤Pb（II），顯著影響Pb（II）的移動(dòng)性和生物利用度［19］。

從鞍山尾礦分離卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）可與茄科龍葵（Solanum nigrum）聯(lián)用于鉛污染土壤的修復(fù)［20］。鉛移除效率 ：聯(lián)合修復(fù) ＞ 植物修復(fù) ＞ 真菌修復(fù) ＞對(duì)照。土壤接種卷枝毛霉加強(qiáng)Pb移除和龍葵生長(zhǎng)。聯(lián)合修復(fù)后土壤肥力增加，酶活性改善。

1.3 復(fù)合污染

有機(jī)改良劑有助于減少?lài)?yán)重污染的礦山土壤的重金屬移動(dòng)性，加強(qiáng)土壤微生物機(jī)能［21］。比較4種有機(jī)產(chǎn)品的效果，減少礦山土壤可移動(dòng)重金屬的能力：城市固體廢棄物堆肥（MSWC）＞橄欖加工固體廢物（OPSW）＞泥炭＞風(fēng)化褐煤，MSWC降低Zn和Cd水平分別達(dá)78和73%。這種改良有助恢復(fù)土壤微生物機(jī)能。5% MSWC處理礦山土，基礎(chǔ)土壤呼吸，脫氫酶，脲酶和堿性磷酸酶活性分別增加187%、79%、42%和26%。MSWC是較佳改良劑，有助化學(xué)和微生物土壤修復(fù)。

密旋鏈霉菌（Streptomyces pactum）Act12和生物炭的不同組合可輔助植物修復(fù)治理重金屬污染土壤［22］。Act12對(duì)礦山和工業(yè)污染土壤的物理化學(xué)性質(zhì)都有影響。Act12活性提高了Zn和Pb生物利用度，Cd吸附于生物炭表面，使得生物利用度降低。Zn和Pb可經(jīng)高粱植物提取修復(fù)，而富含鐵的CZ土壤中Cd攝取減少是由于嗜鐵體細(xì)菌產(chǎn)物的作用。高粱地上部檢測(cè)不到Cd，但是根攝取增加。生物炭減少Cd攝取。Act12聯(lián)用生物炭顯著增加高粱干重和葉綠素量。Act12還能增加土壤β-葡萄糖苷酶，堿性磷酸酶和脲酶活性，Act12和生物炭減少重金屬脅迫，從而減少抗氧化酶活（POD、PAL和PPO）和脂質(zhì)過(guò)氧化。

植物-微生物聯(lián)合修復(fù)體系具有生物固定與生物去除土壤重金屬的兩種功能，根際微生物可以菌根、內(nèi)生菌等方式與根系形成聯(lián)合體，通過(guò)增強(qiáng)植物抗性和優(yōu)化根際環(huán)境，促進(jìn)根系發(fā)展，增強(qiáng)植物吸收和向上轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的能力［23］。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)充分發(fā)揮植物與微生物功能優(yōu)勢(shì)，提高污染土壤的修復(fù)效率。深入研究根際微生物、根系和介質(zhì)載體三者之間復(fù)合功能，結(jié)合污染土壤類(lèi)型與植物群落配置的特點(diǎn)篩選擴(kuò)繁高效菌種和菌群。

2 土壤中石油，PAHs和其它芳香化合物的微生物修復(fù)

2.1 PAHs和其它芳香化合物

用生物泥漿批量實(shí)驗(yàn)研究多環(huán)芳香化合物（PAC）污染土壤中PAH和極性PAC的變化特征［24］。監(jiān)測(cè)修復(fù)5個(gè)月中土壤有機(jī)質(zhì)和反應(yīng)性，溶劑可提取有機(jī)質(zhì)和PAC含量，有機(jī)質(zhì)礦化。定量總細(xì)菌和真菌數(shù)，催化PAH環(huán)羥化的雙加氧酶基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PAHs和極性PACs的降解動(dòng)力學(xué)不同，降解速率差異與土壤類(lèi)型、PAH分布和生物利用度有關(guān)。低分子量化合物優(yōu)先降解。降解選擇性與異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)相似物有關(guān)，可解釋生物修復(fù)的效果。土壤細(xì)菌區(qū)系在PAC降解中處于支配地位。孵育實(shí)驗(yàn)中PAH降解細(xì)菌豐度增加，但其在細(xì)菌區(qū)系中的比例減少。修復(fù)中需要監(jiān)測(cè)一些氧化PACs的累積。

植物根際構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的小生境，含有多種可用于生物轉(zhuǎn)化和污染物治理的微生物［25-26］。豆科植物田菁（Sesbaniacannabina），叢枝菌根真菌（AMF）摩西球囊霉（Glomus mosseae）和根瘤菌（劍菌屬Ensifer）三方共生可用于土壤PAHs修復(fù)［27］。AMF和根瘤菌互利。AMF和/或根瘤菌顯著增加植物生物質(zhì)和植物內(nèi)PAHs積累。植物+ AMF +根瘤菌聯(lián)用能降解＞97菲和85%-87%芘，單用植物修復(fù)則為81%-85%和72%-75%。AMF和/或根瘤菌處理土壤時(shí)產(chǎn)生大量水溶性酚類(lèi)化合物，相應(yīng)地，微生物活性和土壤酶活較高。三方共生中的兩兩互作刺激微生物發(fā)育和土壤酶活，加強(qiáng)了PAHs降解。

從2，4，6-三硝基甲苯（TNT）污染土壤分離楊氏檸檬酸桿菌（Citrobacter youngae）E4［28］。無(wú)外加氨基氮源時(shí)，E4降解TNT效果差，反之則劑量依賴(lài)地顯著增加TNT轉(zhuǎn)化效率。填加氨基氮源促進(jìn)菌細(xì)胞生長(zhǎng)，上調(diào)TNT硝基還原酶，包括NemA，NfsA和NfsB。這說(shuō)明氮營(yíng)養(yǎng)素刺激的E4轉(zhuǎn)化TNT為一共代謝過(guò)程。用E4處理TNT污染土壤泥漿獲得類(lèi)似強(qiáng)化結(jié)果。E4和氮營(yíng)養(yǎng)素的協(xié)同添加也許有助于TNT污染土壤修復(fù)。但是，TNT轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的96 h猛水蚤（Tigriopus japonicas）半數(shù)死亡濃度（LC50）高于TNT，故需要額外的解毒過(guò)程。

偶聯(lián)化學(xué)氧化和微生物修復(fù)值得探索。化學(xué)氧化是否影響土著微生物區(qū)系，烷基苯污染土壤修復(fù)4周后發(fā)現(xiàn)，改良Fenton反應(yīng)（MFR）和高錳酸鹽減少微生物豐度和活性［29］。但某些烴類(lèi)降解菌最終是增加的，表現(xiàn)為alkB基因豐度增加，已知的烴類(lèi)降解菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，如紅球菌屬（Rhodococcus），蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和貪銅菌屬（Cupriavidus）。

2.2 PAH-重金屬?gòu)?fù)合污染

用改良的黏土調(diào)控微生物降解處理PAH/Cd復(fù)合污染［30-31］。棕櫚酸（PA）接枝的基于 Arquad?2HT-75的有機(jī)膨潤(rùn)土吸附Cd量稍多于普通膨潤(rùn)土，羧基基團(tuán)使其表面帶更多負(fù)電荷，能耐受高濃度Cd。共存Cd（5和10 mg/L）時(shí)，與普通膨潤(rùn)土比較，Arquad?2HT-75修飾的膨潤(rùn)土（AB）和PA接枝的有機(jī)膨潤(rùn)土（ABP）使淺黃分枝桿菌（Mycobacterium gilvum）VF1降解更多三環(huán)PAH菲（72%-78% 和62%）。ABP通過(guò)吸附消除Cd對(duì)細(xì)菌的毒性作用，而且創(chuàng)造適于菌生存的微環(huán)境。ABP-細(xì)菌互作產(chǎn)生大分子，克服成分間的靜電排斥，形成一個(gè)穩(wěn)定的黏土-細(xì)菌簇。

廢水灌溉土壤常同時(shí)污染PAHs和重金屬（如Cd和Zn），微生物和植物聯(lián)合修復(fù)效果較好。溫室套種黑麥草和東南景天（Sedum alfredii），結(jié)合定期接種微桿菌屬（Microbacterium）KL5和熱帶念珠菌（Candida tropicalis）C10，最大PAH去除96.4%，PAH礦化和金屬植物提取（36.1% Cd 和12.7% Zn）均為最大值［32］。兩年修復(fù)后，各地塊PAHs均減少至國(guó)標(biāo)范圍內(nèi)（農(nóng)用II級(jí)，pH 6.5-7.5）。外加菌隨時(shí)間逐漸消失，故每?jī)稍略俳臃N可維持土壤中接種菌的高細(xì)胞密度和活性。引入KL5增加了土壤酶活性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，PAH去除和金屬植物提取，C10增加土壤酶活性，促進(jìn)高分子量PAHs去除。

重金屬耐受的PAH降解菌在修復(fù)復(fù)合污染時(shí)十分重要，因其減輕有機(jī)物降解的重金屬抑制。優(yōu)化礦物鹽培養(yǎng)液成分，避免使用金屬結(jié)合成分（如磷酸鹽），保證分離的PAH降解菌群生長(zhǎng)，同時(shí)使Cd2+的生物利用度較高［33］。培養(yǎng)液的Cd超過(guò)60%。分離的菌群最小抑制濃度（MIC）最高為5 mg/L Cd，且能4 d內(nèi)完全代謝200 mg/L菲。

2.3 石油污染土壤的生物強(qiáng)化和生物刺激

微生物修復(fù)在石油污染治理中的重要作用廣為人知，微生物-電化學(xué)處理系統(tǒng)是一較新的技術(shù)，能進(jìn)行有效修復(fù)和能源回收。微生物燃料電池（MFCs）中的電極是電子受體，以柴油（V/V 1%）為唯一底物時(shí)功率密度達(dá)29.05 W/m3，電流密度72.38 A/m3，柴油移除速率提高4倍［34］。掃描電鏡顯示陽(yáng)極碳纖維被生物膜和細(xì)菌膠體覆蓋，它們?yōu)樘祭w維構(gòu)建連接體系，加強(qiáng)電子傳遞。厭氧生物降解中產(chǎn)生的微量代謝物起到乳化劑的作用，有助于油滴分散，在場(chǎng)地修復(fù)中起重要作用。

生物強(qiáng)化+生物刺激（BR，加營(yíng)養(yǎng)素和混合菌群），以及自然遞減（NA）對(duì)新發(fā)嚴(yán)重石油污染土壤的烴類(lèi)降解和微生物區(qū)系有何影響，112 d短時(shí)程修復(fù)后，總石油烴（TPH，61 000 mg/kg土壤）減少 4.5%（NA）和 5.0%（BR）［35］。與自然遞減相比，生物修復(fù)沒(méi)能顯著加強(qiáng)TPH生物降解。脂肪族部位降解最活躍，降解率30.3（NA）和28.7（BR）mg/kg/d。生物修復(fù)時(shí)土壤微生物活性和計(jì)數(shù)一般高于自然遞減。MiSeq測(cè)序提示生物修復(fù)顯著影響土壤微生物區(qū)系的多樣性和結(jié)構(gòu)。生物修復(fù)使得原小單孢菌屬（Promicromonospora），假單胞菌屬（Pseudomonas），Microcella，分枝桿菌屬（Mycobacterium），Alkanibacter和 Altererythrobacter成為優(yōu)勢(shì)菌屬。用投菌法和生物刺激法對(duì)陜北子長(zhǎng)石油污染土壤進(jìn)行微生物修復(fù)研究［36］。測(cè)定不同處理方法對(duì)石油烴的去除效果，確定修復(fù)陜北石油污染土壤的最佳方案。石油污染土壤不同生物處理修復(fù)效果：生物刺激（加入N、P營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）＞生物強(qiáng)化（投加降解菌）＞其它。土壤中石油烴降解率與可降解石油烴的催化酶基因含量之間呈正相關(guān)，修復(fù)中土壤石油烴和烷烴降解菌數(shù)量顯著多于PAH降解菌數(shù)量，投加外源降解菌SZ-1顯著提高土壤細(xì)菌群落的多樣性。深入理解生物修復(fù)石油污染土壤過(guò)程中的微生物生態(tài)效應(yīng)變化有助制定適宜的修復(fù)策略。

污染土壤修復(fù)研究常使用細(xì)粒土而非低肥力砂壤，且很少研究再污染事件。選擇曾經(jīng)歷植物修復(fù)并對(duì)殘余總石油烴（TPH）有一定適應(yīng)能力（土壤微生物已適應(yīng)污染環(huán)境）的砂壤為研究對(duì)象，新引入廢棄機(jī)油，比較有氧和厭氧處理效果［37］。90 d溫室盆栽研究比較了有柳枝稷植被和無(wú)植被條件下修復(fù)含殘余TPH的人為填充土的效果。盡管有植被時(shí)的細(xì)菌CFU高于無(wú)植被時(shí)幾個(gè)數(shù)量級(jí)，有植被時(shí)最終TPH濃度較高。無(wú)植被盆中，不管是否施肥，TPH濃度均較低。已適應(yīng)的土著微生物區(qū)系與植物（及同時(shí)引入的根際微生物）相比，能更有效地分解烴類(lèi)。新引入非水相液體（廢棄機(jī)油）的修復(fù)效果在飽和厭氧環(huán)境中最好，可能由于既有的微生物區(qū)系，污染物生物利用度較好，以及土壤條件適宜菌的生存。

3 土壤殺蟲(chóng)劑和除草劑的微生物修復(fù)

3.1 各類(lèi)型殺蟲(chóng)劑

用富集培養(yǎng)從長(zhǎng)期使用擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的棉田土壤篩選降解β-氯氰菊酯的菌株［38］，用3周連續(xù)繼代培養(yǎng)獲得一個(gè)混合菌群，能以β-氯氰菊酯為唯一碳源。該菌群主要含假單胞菌（Pseudomonas），生 絲 微 菌 屬（Hyphomicrobium），Dokdonella和Methyloversatilis。從中分離出4個(gè)菌株，GXZQ4，6，7和13，分屬鏈霉菌屬（Streptomyces），腸桿菌屬（Enterobacter），鏈霉菌屬和假單胞菌。混合菌群降解率（96 h，89.84%）高于單菌GXZQ4，6，7和13，以及它們的混合菌群。

甘蔗根際接種能降解殺蟲(chóng)劑六氯化苯的念珠菌（Candida）VITJzN04。盆栽實(shí)驗(yàn)中生物強(qiáng)化酵母的應(yīng)用方式為浮游形式或蔗渣固定形式［39］。花園土中六氯化苯（100 mg/kg）移除半衰期為13.3 d（酵母），43.3 d（甘蔗），9.8 d（游離酵母-植物）和7.1 d（固定酵母-植物）。念珠菌還能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，產(chǎn)生生長(zhǎng)激素，促進(jìn)土壤磷酸鹽溶解和植物攝取。蔗渣固定酵母對(duì)土壤的生物刺激進(jìn)一步提高了土壤的總酵母活性，促進(jìn)六氯化苯移除。聯(lián)用固定酵母-植物時(shí)的降解最好。

3.2 各類(lèi)型除草劑污染土壤的生物強(qiáng)化

由紅球菌屬（Rhodococcus）D310-1和腸桿菌屬（Enterobacter）D310-5組成降解磺酰脲類(lèi)除草劑氯嘧磺隆的混合菌群，優(yōu)化后最大降解率87.42%［40］。土壤60 d修復(fù)的降解率達(dá)80.02%。Illumina MiSeq高通量測(cè)序提示土壤微生物多樣性較高，覆蓋33個(gè)菌門(mén)。變形桿菌、酸桿菌、厚壁菌和擬桿菌豐度較高。D310-1和D310-5組成的混合菌群促進(jìn)修復(fù)，并改變了污染土壤細(xì)菌群落組成。

電動(dòng)力方法定期極性反轉(zhuǎn)策略（PRS）可與微生物聯(lián)用于二苯醚類(lèi)除草劑乙氧氟草醚（20 mg/kg）污染土壤的修復(fù)［41］。混合菌群來(lái)自煉油公司廢水處理廠，經(jīng)馴化能降解乙氧氟草醚。使用PRS時(shí)要控制土壤條件，包括溫濕度，pH和電導(dǎo)等。聯(lián)用PRS兩周后各部分土壤的微生物活性均得以保持。在液態(tài)條件下微生物可降解100%乙氧氟草醚，但是單用菌群的土壤修復(fù)效率很低。聯(lián)用低電壓梯度和極性反轉(zhuǎn)，移除效率達(dá)5%-15%，說(shuō)明PRS促進(jìn)基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)，改善修復(fù)效率。

3.3 其它農(nóng)藥

從污染的三七種植地分離出貪銅菌屬YNS-85［42］，其在液體培養(yǎng)中能共代謝200 mg/L殺真菌劑五氯硝基苯（PCNB），5 d后移除率73.8%。該菌能在酸性條件下（pH 4-6）有效降解PCNB，并耐受重金屬砷，銅和鎘。該菌能以PCNB代謝中間體為唯一碳源。土壤實(shí)驗(yàn)顯示該菌的生物強(qiáng)化加強(qiáng)了PCNB移除（37.8%），修復(fù)30 d后代謝產(chǎn)物五氯苯胺增加達(dá)89.3%。微生物修復(fù)改善了土壤酶活性和菌群功能多樣性。YNS-85耐酸耐重金屬擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。

植物用殺真菌劑噻菌靈（TBZ）可用一個(gè)從污染土壤富集培養(yǎng)中分離的混合菌群快速降解［43］。TBZ作為菌的碳源。混合菌群由 α-，β-和 γ-變形桿菌組成。培養(yǎng)非依賴(lài)方法發(fā)現(xiàn)鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）系統(tǒng)發(fā)育型B13是關(guān)鍵的降解菌。以結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物作為培養(yǎng)底物，提示苯并咪唑部分（噻唑或呋喃環(huán)）的環(huán)取代有利于咪唑部分的裂解。裂解后產(chǎn)生噻唑-4-甲脒，苯甲酰基部分被菌群利用。

復(fù)雜的土壤復(fù)合污染日益引起關(guān)注。大量污染物，包括PAHs、石油和相關(guān)產(chǎn)品、殺蟲(chóng)劑、氯酚及重金屬常進(jìn)入同一區(qū)域［44］，對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)系統(tǒng)造成巨大威脅。化學(xué)和物理技術(shù)或者低效或者成本過(guò)高，需要聯(lián)用生物修復(fù)才更具實(shí)用性。堆肥法既增加土壤有機(jī)質(zhì)和肥力，又修復(fù)污染［45］，對(duì)污染場(chǎng)地微生物區(qū)系有積極影響，是最有效的修復(fù)手段之一。

4 結(jié)語(yǔ)

為設(shè)計(jì)高效的生物強(qiáng)化和生物刺激修復(fù)方案，需要更多菌和污染土壤的信息進(jìn)行創(chuàng)新開(kāi)發(fā)研究。用污染物降解/轉(zhuǎn)化菌清理污染土壤仍極具挑戰(zhàn)性，因?yàn)橹两駥?duì)于土壤中的接種菌狀況仍知之甚少。外加菌在污染土壤中的生存能力，其與土著菌的競(jìng)爭(zhēng)能力，以及其降解/解毒活性是制約生物修復(fù)效率的關(guān)鍵因素。一般認(rèn)為微生物適應(yīng)多樣環(huán)境的能力很強(qiáng)，但具體到每個(gè)生物強(qiáng)化菌株，其生存能力和活性差異很大，此常造成強(qiáng)化修復(fù)失敗。一些新策略可能改善修復(fù)效率。植物仿生修復(fù)是一種可行的新型土壤修復(fù)技術(shù)［46-48］。對(duì)植物仿生修復(fù)裝置進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，考察土壤類(lèi)型、填料組成、管件高度、模擬葉片材質(zhì)、活性炭比例等因素對(duì)植物仿生修復(fù)裝置的影響，優(yōu)化后的裝置修復(fù)效率顯著提高，其中管件的高度與修復(fù)裝置蒸發(fā)速率呈負(fù)相關(guān)；活性炭的量與裝置蒸發(fā)速率的相關(guān)不明顯，模擬“葉片”的材料對(duì)蒸發(fā)速率大小的影響順序?yàn)椋翰ＡЮw維絲＞玻璃纖維布＞棉紗，蒸發(fā)速率分別為：100.13 g/d、64.75 g/d和61.61 g/d。考查植物仿生修復(fù)在野外條件下的實(shí)際應(yīng)用效果，分別對(duì)農(nóng)業(yè)污染土壤和工業(yè)污染土壤進(jìn)行實(shí)地修復(fù)發(fā)現(xiàn)，兩類(lèi)污染土壤的重金屬均有降低，其中農(nóng)田污染土壤中Cd的降低率為37.5%-48.15%，工業(yè)污染土壤中Zn、Cr、Ni、Fe的降低率分別為27.03%、17.33%、31.60%和5.17%。與單純植物修復(fù)比較，仿生修復(fù)與植物修復(fù)聯(lián)用，顯著降低紅土Cd和Pb含量［49］，且對(duì)植物富集Cd和Pb無(wú)消極影響，同時(shí)海泡石+硅藻土+高嶺土+活性炭組填料中Pb和Cd含量高于其它填料組合。該技術(shù)可以與植物（及根際微生物）修復(fù)技術(shù)、微生物修復(fù)技術(shù)、物理-化學(xué)修復(fù)技術(shù)等聯(lián)用，構(gòu)建污染土壤的復(fù)合修復(fù)技術(shù)。植物仿生修復(fù)作為一種新型修復(fù)技術(shù)可以有效降低土壤重金屬含量。在同一條件下，植物仿生修復(fù)與植物修復(fù)相比，效率較高，吸附重金屬的量較大。該裝置也有望用于清除有機(jī)物污染。仿生修復(fù)的材料篩選、可行性研究、系統(tǒng)優(yōu)化和實(shí)際應(yīng)用研究需要積累更多實(shí)證數(shù)據(jù)，為開(kāi)發(fā)新型土壤重金屬和有機(jī)物污染修復(fù)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

另一新策略的例子是調(diào)節(jié)接種菌和土著菌的群體感應(yīng)（QS），刺激生物膜形成。QS是一個(gè)與菌群密度相關(guān)的刺激和反應(yīng)系統(tǒng)，使菌在高細(xì)胞密度時(shí)限制特定基因表達(dá)，使表型最優(yōu)。可根據(jù)局部菌群密度用QS協(xié)調(diào)基因表達(dá)［50］。用自誘導(dǎo)物或抑制劑調(diào)控QS，可能顯著影響生物強(qiáng)化和生物刺激的最終效應(yīng)。迅猛發(fā)展的納米技術(shù)可能為微生物修復(fù)提供新穎的解決方案。具有大表面積的納米材料可顯著增加其與污染物的親和力，加速污染物降解/解毒［51］。但應(yīng)注意納米顆粒應(yīng)不抑制微生物生長(zhǎng)。

為獲取接種菌轉(zhuǎn)歸信息，保障污染物降解高效進(jìn)行，目前土壤生物技術(shù)領(lǐng)域注重引入一些分子工具和多相方法學(xué)。例如，可用4種分子方法研究假單胞菌（Pseudomonas monteilli）SB 3078引入污染的活性污泥后的生存和活性［52］。用qPCR和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記監(jiān)測(cè)菌細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行樣品的可視化分析，用RT-qPCR和穩(wěn)定同位素探針（SIP）估計(jì)降解酶基因和接種菌生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，評(píng)價(jià)污染物對(duì)菌的影響。分子方法的最大優(yōu)點(diǎn)是精確監(jiān)測(cè)。靈活結(jié)合分子和傳統(tǒng)方法監(jiān)測(cè)污染物移除是評(píng)價(jià)引入菌株在原位修復(fù)條件下的表現(xiàn)的最好方式。另外，高通量擴(kuò)增子測(cè)序［5］和宏基因組/宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序［53-54］極大地方便了污染場(chǎng)地微生物區(qū)系的詳盡探查和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以及功能基因挖掘。未來(lái)改進(jìn)生物強(qiáng)化和生物刺激策略還應(yīng)更多考慮有機(jī)物-重金屬?gòu)?fù)合污染等復(fù)雜情況。

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Microbial Remediation of Soil Heavy Metal and Organic Pollutants：Bioaugmentation and Biostimulation

HAO Da-cheng1ZHOU Jian-qiang2HAN Jun2
（1. School of Environment and Chemical Engineering/Biotechnology Institute，Dalian Jiaotong University，Dalian 116028 ；2. Beijing E&E Technologies Co.，Ltd.，Beijing 100016）

Green technologies，e.g.，bioaugmentation and biostimulation，are cost effective and eco-friendly，and are becoming Rosetta Stone for the remediation of soil heavy metal and organic pollutants. Various bacteria，fungi and their consortia can be combined with physical and chemical techniques for the targeted remediation of soil organic contamination，heavy metal contamination and combined pollutions. This review exemplifies the representative studies within the recent five years，summarizes the screening of microbial strains from multiple sources and their potentials in transforming/degrading various types of pollutants，and highlights their applications in the case studies of laboratory，greenhouse and field conditions. The complexity of microbial remediation is ascribed to not only the variations of physiological and metabolic traits，but also numerous environmental factors，including abiotic factors，e.g.，pH，temperature，type of soil，pollutant concentration，content of water and organic matter，additional carbon and nitrogen sources，and biotic factors，e.g.，inoculum size，interactions between the introduced strains and autochthonous microbes，and the survival of inoculants. Prospects of combined remediation and the applications of molecular methods are also presented.

soil；microbial remediation；organic pollutant；heavy metal；combined remediation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0294

我國(guó)現(xiàn)有耕地有近1/5受到不同程度的重金屬和有機(jī)物污染，污染土壤將導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，甚至有可能引起農(nóng)產(chǎn)品中污染物超標(biāo)，進(jìn)而危害人體健康和整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展與城市化的加速，工礦企業(yè)導(dǎo)致的場(chǎng)地污染也十分嚴(yán)重。由于產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)與城市布局的變化與調(diào)整，有些化工、冶金等污染企業(yè)紛紛搬遷，加上一些企業(yè)的倒閉，污染場(chǎng)地不斷產(chǎn)生。沒(méi)有處理的污染場(chǎng)地成為潛在隱患，必須妥善管理并加以修復(fù)，使其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)最小化并得到可持續(xù)利用。

2017-04-11

郝大程，男，博士，副教授，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)；E-mail：hao@djtu.edu.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）