污染河流土著異養硝化菌的篩選及其鑒定

劉攀龍 于魯冀，2 李廷梅 范錚 陳濤

（1. 鄭州大學環境政策規劃評價研究中心，鄭州 450002；2. 鄭州大學水利與環境學院，鄭州 450001）

污染河流土著異養硝化菌的篩選及其鑒定

劉攀龍1于魯冀1，2李廷梅1范錚1陳濤1

（1. 鄭州大學環境政策規劃評價研究中心，鄭州 450002；2. 鄭州大學水利與環境學院，鄭州 450001）

利用以琥珀酸鈉和硫酸銨為唯一碳源和氮源的選擇培養基從賈魯河污染水體中篩選異養硝化菌，采用富集、梯度稀釋涂布平板和平板劃線分離的方法對菌種進行分離純化，結合16S rDNA分析、生理生化特性和氮轉化特點對菌種進行鑒定。結果表明，從水體中共分離出的63株純菌株中，經鑒定其中3株菌為異養硝化菌，包括1株硝化假單胞桿菌（Pseudomonas nitroreducens）和2株門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina），對氨氮去除率分別為91.8%、89.8%、81.4%。

異養硝化；土著菌；篩選；鑒定

本研究以鄭州市賈魯河受污染的河水為接種樣品，通過富集、分離、純化和脫氮性能比選從中篩選出高效脫氮的土著異養硝化菌，以分子生物學技術對菌種的16S rDNA測序，結合菌種生理生化試驗現象和對氨氮的轉化性能鑒定菌種，旨為菌種用于河流氨氮污染的治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 土著脫氮微生物篩選所采用的樣品為賈魯河受污染的河水，為增加樣品的生物多樣性，提高成功篩選土著脫氮微生物的概率，選擇沿程有支流匯入的點位以及典型污染區域的河水樣品，共采集9個水樣，編號#1-#9，采樣點位分布，見圖1。

圖1 采樣點位分布圖

1.1.2 培養基及成分 本研究采用的培養基種類、作用及具體成分如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 樣品富集方法 以銨鹽有機培養基（A）對采集的樣品富集培養：以孔徑為0.22 μm的濾膜對采集的水樣抽濾，水體中的微生物被截留在濾膜上，將濾膜剪碎轉移至裝有100 mL液體富集培養基（A）的錐形瓶內，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養，每24 h以萘氏試劑、格里斯試劑、二苯胺試劑檢測培養基內銨鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽的轉化與生成情況，若銨鹽大量減少，以1%接種量轉接入新鮮富集培養基中繼續富集，循環3-4個周期后，富集液具有將銨鹽轉化為亞硝酸鹽和硝酸鹽的能力，得到異養硝化菌的富集液。

1.2.2 脫氮微生物篩選方法 從富集的樣品中挑選銨鹽轉化能力較強富集液開展脫氮微生物的篩選研究：采用稀釋涂布平板的方法將挑選的樣品接種于固體銨鹽有機培養基（C），恒溫培養至菌落出現，挑取典型菌落劃線分離，以純化菌種，重復2-3次，斜面保存備用。將挑選的菌種分別接種于液體銨鹽有機培養基（C）中，考察經純化的菌種對銨鹽的轉化效果，選出效果較好的菌種。

1.2.3 菌種鑒定方法 菌種鑒定包括16S rDNA測序方法和生理生化試驗方法。

表1 培養基及成分

1.2.3.1 菌種的16S rDNA測序方法 （1）基因組DNA提?。河没蚪M快速抽提試劑盒（生工SK8 255）提取基因組，提取方法參照配套說明書。（2）PCR擴增：采用細菌16S rDNA擴增通用引物27F-1 492R對提取的DNA擴增，擴增長度約1 500 bp，經94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃復性 45 s，72℃延伸1 min，共30個循環；最后72℃修復延伸10 min。（3）凝膠電泳：擴增產物在1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min電泳觀察。（4）純化回收：PCR產物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，以PCR引物直接測序，PCR產物的純化和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。（5）序列結果對比：將得到的序列輸入NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），與數據庫中已知菌種序列比對。

1.2.3.2 生理生化試驗方法 生理生化試驗包括：氧化酶試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗等，具體操作方法見《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）。

1.2.4 各形態氮含量檢測方法

1.2.4.1 定性分析 每個樣品取3滴，分別滴加萘氏試劑、格里斯試劑及二苯胺試劑，以顏色顯示氨氮、亞硝態氮及硝態氮的含量，如表2所示。

表2 各形態氮含量初步檢驗方法

1.2.4.2 定量分析 用于初步檢測氨氮、亞硝態氮、硝態氮的顯色劑無法準確表示氮的濃度，因此需對樣品進行定量分析。定量分析的方法如表3所示。其中測定菌液氨氮、亞硝態氮、硝態氮時需對菌液進行離心處理，以消除菌體對吸光度測定的干擾，離心條件為3 000 r/min、15 min。

表3 各形態氮定量分析方法

2 結果

2.1 河流土著異養硝化菌的篩選

2.1.1 脫氮微生物富集結果 將采集的樣品分別接種于銨鹽液體有機培養基（A）作富集培養，經過大約4周的富集，成功得到異養硝化菌富集液，以萘氏試劑、格里斯試劑及二苯胺試劑檢驗最終的富集情況：#1、#2富集液對銨鹽的轉化能力較弱，而#3-#9對銨鹽的轉化能力較強，表明這些富集液能有效利用銨鹽的微生物數量較多。其中#7-#9富集液遇二苯胺藍色最深，表明該3個富集液樣品中-N含量最高，微生物硝化效果最好；#4富集液的NH3-N、-N和的濃度均不高，富集液中明顯可以觀察到大量菌體，表明該富集液中存在異養硝化菌或反硝化細菌。脫氮微生物的篩選重點選擇銨鹽轉化性能較好的#4、#7、#8和#9富集樣品。

2.1.2 菌種分離純化結果 采用梯度稀釋涂布瓊脂平板和平板劃線分離的方法對富集的菌液進行分離和純化，共得到菌落形態有差異的純菌株63株，部分菌株在涂布和劃線分離的平板上的形態（圖2）。

圖2 部分涂布和劃線分離的平板

2.1.3 菌種脫氮性能的比選 從選擇培養基上篩選的63株菌依次編號，分別接種到液體選擇培養基（C），在恒溫搖床中培養3 d，檢驗菌種對氨氮的去除效果，結果如圖3所示。菌種對氨氮去除效果高低各異，C39的去除率最高為95.2%，其次為C38，去除率為91.2%；部分菌種對氨氮去除效果很低，如C20、C16、C13等，去除率在5%以下，結合菌種在液體培養基中的生長情況可以判斷這幾株菌在液體培養基中未正常生長，推測原因為菌株好氧，而液體培養基供氧效率不如固體培養基表面，因此氨氮去除率低。挑選對氨氮去除率高的菌種進行下步研究。

2.2 菌種鑒定

按照菌種對氨氮的去除效率高低排列，選擇去除率75%以上的菌種共22株作16S rDNA測序鑒定。細菌DNA擴增引物采用通用引物27F-1 492R，擴增長度約1 500 bp，部分菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖片，如圖4所示。

圖3 篩選的菌種對氨氮的去效果對比

圖4 部分菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖片

經測序，將所得到的序列與NCBI數據庫中的已知序列進行相似度對比發現，挑選的22株菌包括了假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga sp.）、短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.）等在內的11個不同的屬，序列同源性最低為98.56%，最高為100%。假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）內部分菌種具有異養硝化的效果。因此，從測序的22株菌將假單胞桿菌挑選出來，共5株，分別為C2、C25、C36、C38和C56。查詢《伯杰細菌鑒定手冊》，參考假單胞桿菌屬內模式菌種的生理生化特性，設計9組生理生化試驗輔助鑒定菌種，結果如表4所示。

根據生理生化試驗進一步判斷，5株菌分別為：硝化假單胞桿菌（Pseudomonas nitroredu-cens）、Pseudomonas chengduensis、石油假單胞桿菌（Pseudomonas oleovorans）、門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina）、門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina）。

表4 所篩選5株菌生理生化試驗現象

2.3 菌種脫氮性能研究

2.3.1 菌種的硝化性能 將篩選的5株菌分別接種于銨鹽液體有機培養基（C）中，于30℃、150 r/min條件下培養3 d，對液體培養基內氨氮、亞硝態氮、硝態氮、總氮含量進行測定，研究其硝化性能，結果如表5所示。5株菌對氨氮都有較高的去除效果，其中C2對培養基內氨氮去除率達91.8%為最高。5株菌對硝態氮基本無積累，但菌株C38、C56對亞硝態氮有少量積累，在1 mg/L左右，其余3株菌對硝態氮、亞硝態氮基本無積累。菌株C2、C38、C56對總氮約有20%-25%的去除效果。綜合這3株菌對培養基內氨氮的轉化效果，可以判斷培養基內氨氮一部分以銨鹽形式被菌株同化吸收，用以合成自身菌體蛋白，維持生命活動，另一部分氨氮（約20%-25%）通過氮循環的方式從環境中去除，由于異養型微生物在生長過程中利用的碳源為有機碳源，生長速度較一般自養型微生物快，被同化吸收部分氨氮占比高。其余2株菌對總氮基本無去除效果，可以判斷該2株菌對氨氮去除方式為菌株同化作用。2.3.2 菌種反硝化性能研究 將菌種接種于硝酸鹽液體有機培養基（D）中，于30℃、150 r/min條件下培養3 d，對液體培養基內硝態氮、總氮含量進行測定，以檢驗菌種反硝化性能，結果如表6所示。菌株C25、C36對硝態氮的去除率較低，其余三株菌對硝態氮的去除效果較好，其中菌株C2（Pseudomonas nitroreducens）對硝態氮的去除率最高，達96.4%；5株菌對亞硝態氮都有積累，其中C2且對亞硝態氮積累量最高，達到78.35 mg/L，反硝化性能最強。

表5 菌種接種于銨鹽液體有機培養基后的培養結果

表6 菌種接種于硝酸鹽液體有機培養基后的培養結果

綜合菌種對氨氮和硝態氮的轉化情況，可以判斷菌株 C2（Pseudomonas nitroreducens）、C38（Pseudomonas mendocina）、C56（Pseudomonas mendocina）為異養硝化菌，而其余2株菌是以微生物的同化方式去除氨氮的，非脫氮菌。

3 討論

由于具有生長速度快、溶解氧要求低、氨氮轉化效率高等優勢，近年來，越來越多的異養硝化菌被篩選和研究。姚秀清等［12］采用模擬廢水和活性污泥在SBR反應器中富集培養異養硝化菌，投加的模擬廢水氨氮濃度從100 mg/L逐步提升至1 396 mg/L，歷經5個月，篩選出的兩株異養硝化菌，對氨氮去除率分別為71.2%和85.8%；陳威等［13］利用亞硝化細菌分離培養基從淺層底泥中分離到一株具有硝化反硝化能力的異養硝化細菌，經8 d的培養，氨氮的去除率為49.2%。這些研究中異養硝化菌是從活性強、微生物種類多的環境中篩選得到的，這類細菌與長期棲息于河水中的土著菌相比，對河水環境的適應能力較差，因而難以在河水中發揮高效脫氮作用。

王珺等［14］從城市納污河流中篩選出一株具有異養硝化功能的假單胞桿菌，該菌株7 d內對-N和的去除率分別達56.26%和53.99%；蘇俊峰等［15］從水庫底泥中富集分離出一株貧營養型異養硝化菌，優化培養條件后，對氨氮去除效果明顯，氨氮濃度從9.02 mg/L、7.49 mg/L下降到1.83 mg/L、1.07 mg/L，最高去除率達91.42%；芮傳芳等［11］從巢湖底泥中分離出一株具有氨氮轉化活性的枯草芽孢桿菌，氨氮轉化效率為39.4%。這些研究將菌種判定為異養硝化菌的依據僅是菌種能利用有機碳源、對氨氮去除效果高，然而水體中微生物種類相當復雜，有相當一部分微生物能將氨氮作為氮源用于自身生命活動，這給利用選擇培養基篩選異養硝化菌的方法增添誤導信號，在該類選擇培養基上能生長的細菌并非都是異養硝化菌。本研究從受污染的賈魯河水體中篩選異養硝化菌，所得菌種為賈魯河土著菌種，在河流污染治理上比外來菌種能更快適應環境；在菌種的鑒定上，結合了分子生物學方法以及對菌種的生理生化特性研究初步挑選了5株可能為異養硝化菌的假單胞桿菌，通過該5株菌對氨氮和硝態氮的轉化途徑，從中篩選了3株異養硝化菌，在有效利用銨鹽、硝酸鹽的同時，還通過異養硝化途徑對氨氮去除，該過程是一個連續過程，不生成，與Richardson等［16］對異養硝化途徑的解釋NH3-N→NH2OH→N2O→N2相符。

4 結論

利用銨鹽選擇培養基從賈魯河污染水體中篩選出能高效去除氨氮的5株假單胞桿菌，經菌種鑒定分別為硝化假單胞桿菌（Pseudomonas nitroreducens）、Pseudomonas chengduensis、 石 油 假單胞桿菌（Pseudomonas oleovorans）、門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina）、門多薩假單胞桿菌（Pseudomonas mendocina）。

分析菌株對氨氮和硝態氮的轉化情況，發現菌株C2、C38、C56具有較強的硝化和反硝化性能，對氨氮的去除率最高達91.8%，且在對氨氮的轉化過程中無NO3-生成，符合異養硝化菌對氨氮的轉化途徑，結合16S rDNA測序結果以及生理生化特性最終鑒定其為異養硝化菌。

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Isolation and Identification of Indigenous Heterotrophic Denitrifying Bacteria from Polluted River

LIU Pan-long1YU Lu-ji1，2LI Ting-mei1FAN Zheng1CHEN Tao1
（1. Research Center of Environmental Policy Planning & Assessment of Zhengzhou University，Zhengzhou 450002；2. School of Water Conservancy and Environmental Engineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001）

Heterotrophic denitrifying bacteria from the polluted water of Jialu River were screened on the selective medium，with sodium succinate as sole carbon source and ammonium sulfate as sole nitrogen source. Then，the separation and purification were performed by enrichment，gradient dilution and streaking on the plates. Finally，the strain was identified according to 16S rDNA sequence alignment results，physiological and biochemical experiments and the ammonia nitrogen transformation. The results showed that，63 strains were isolated from the polluted water，and 3 of them were identified as heterotrophic denitrifying bacterium，including a strain of Pseudomonas nirtoreducens and two strains of Pseudomonas mendocina，by which the ammonia nitrogen removal rate were 91.8%，89.8%，and 81.4%，respectively.

heterotrophic nitrification；indigenous bacteria；isolation；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0252

河流、湖泊水體中氨氮含量超標是我國水體污染的主要原因之一［1-2］，因而受到人類的高度關注。多年來，世界各國在氨氮污染治理上投入大量精力，但是河流氨氮污染的現狀仍舊存在。河流水體氨氮治理的方法分為物理法、化學法和生物法，物理法如底泥疏浚、環境調水，化學法如混凝沉淀、加氯處理等都有動力消耗大，需要投入大量人力、物力的特點，適于工程量大、氨氮污染更為嚴重的水體應急性治理［3-4］；而生物法則主要依靠河流微生物的代謝活動實現對水中氨氮去除的目的，因其具有經濟高效、無二次污染等優點受到廣泛應用［5］。

傳統生物脫氮理論中，氨氮經硝化途徑被自養型亞硝化、硝化細菌逐步轉化成亞硝態氮、硝態氮，再經反硝化途徑被異養型的反硝化細菌轉化成氮氣從環境中去除［6］。20世紀80年代，Robertson等［7］篩選出Thiosphaera pantotropha，首次提出了異養硝化的概念。不同于自養硝化，異養硝化是微生物在利用有機底物的同時將氨氮轉化為羥胺和亞硝酸鹽，并還原成氣體從環境中去除的過程，該過程是一個連續的過程，很少生成硝酸鹽［8］。由于異養硝化菌具有生長速度快、溶解氧濃度要求低、氨氮去除率較高等諸多優點［9-11］，異養硝化菌的篩選成為近年來污水脫氮的一個熱點。

2017-03-31

國家水體污染控制與治理科技重大專項（2012ZX07204-001-004）

劉攀龍，男，碩士，研究方向：水污染控制理論與技術，環境微生物；E-mail：lpl6955@126.com

（責任編輯 狄艷紅）