一株鎳抗性和石油烴降解菌的分離鑒定及其生物學特性

馬永松 李琋 李珍珍 王佩潔

（西南石油大學化學化工學院，成都 610500）

一株鎳抗性和石油烴降解菌的分離鑒定及其生物學特性

馬永松 李琋 李珍珍 王佩潔

（西南石油大學化學化工學院，成都 610500）

從四川省長寧-威遠地區頁巖氣開發井場重度污染區的土壤中，篩選出一株鎳抗性和石油高效降解菌株，研究其生物學特性和部分生理生化指標。將種子液接種在原油重金屬液體培養基中，30℃、130 r/min條件下分別培養7 d探究該菌株對金屬鎳離子的抗性和對總石油烴（Total petroleum hydrocarbon，TPH）的降解率，以及經生理生化實驗、形態觀察和16S rDNA對該菌株鑒定分析。結果顯示，該菌株對Ni2+的耐受性可達300 mg/L，對Ni2+的去除率和吸附率分別達到了56.64%和52.16%，同時對總TPH的降解率達到35.65%。確定該菌種屬檸檬酸桿菌屬（Citrobacter sp.），命名為Citrobacter farmeri strain M1。該菌株的最適生長溫度為30℃，最適生長pH范圍為7-9，最適C∶N為10∶1和鹽最高耐受度可達5%。該菌株有較好的石油降解能力并對金屬鎳有較強的抗性，適用于石油重金屬混合污染土壤的修復。

石油降解菌；鎳抗性；分離鑒定；生物學特性

本研究從四川省長寧-威遠地區頁巖氣開發井場重度污染區的含油土壤中篩選出了一株對鎳和石油具有復合抗性和降解的菌株，鑒定其菌屬，測定了其一部分的生物學特性，并研究了它對鎳和石油的去除效果，為后來以該菌株為生物修復劑，對石油-重金屬混合污染土壤的微生物修復奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 含油污泥 含油污泥樣品來源于四川省長寧-威遠地區頁巖氣開發井場內部重度污染區，油泥的主要成分為有機物、無機鹽、油類和重金屬，含油量在100 000 mg/kg以上和重金屬含量為210 mg/kg左右，采用對角線法，采取10份土壤混合均勻后的土樣。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 富集篩選培養基 富集篩選培養基主要成分為葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，（NH4）2SO41 g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH 為 7.2-7.4，1×105Pa滅菌30 min。

1.1.2.2 原油重金屬液體培養基 原油重金屬液體培養基主要成分為原油（原油取自遼河油田，組成為：飽和烴：35.32%，芳香烴：23.17%，膠質-瀝青質：41.51%）10 g/L，酵母粉3 g /L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，（NH4）2SO41 g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH為7.2-7.4，加入一定濃度的重金屬Ni2+溶液，使最終Ni2+濃度為300 mg/L，1×105Pa滅菌30 min。

1.1.2.3 原油重金屬固體培養基 原油重金屬固體培養基主要成分為在相應的原油重金屬液體培養基中加入質量分數為2%的瓊脂［17］。

1.1.2.4 基礎擴大培養基 基礎擴大培養基的主要成分：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，調節 pH 為 7.2-7.4，1×105Pa 滅菌 30 min［19］。

1.2 方法

1.2.1 鎳抗性和石油降解菌的分離和篩選 稱取新鮮土樣10 g，加入到90 mL的無菌水中，在室溫下振蕩30 min，制備成土懸液，然后用移液槍吸取1mL所需濃度的菌懸液，注入到富集培養基內并置于30℃恒溫培養箱中，培養1-2 d，用肉眼觀察培養基內是否有菌生長。取富集樣品1 mL，接種于原油重金屬液體培養基中，在30℃、130 r/min的搖床上培養72 h，再取培養液1 mL進行傳代馴化。每72 h接種傳代一次，經過5次石油重金屬液體培養基馴化后，蘸取馴化菌液于培養皿上涂布分離，30℃培養48-72 h，觀察菌體的生長情況，挑選生長優良的菌落經過多次純化后，將單菌落再次接種于石油重金屬液體培養基中進行搖床培養，在30℃下，130 r/min的搖床上培養［20-22］。經過復篩后，淘汰去除石油和重金屬能力較低的菌株，最終篩出抗鎳（300 mg/L）和具有石油降解能力的菌株，共計7株（編號M1-M7），并從這7株菌株中篩選出一株對鎳和石油烴去除能力較高的菌株接種于擴大培養基中，30℃下進行增殖培養為種子液，作為鑒定和生物學特性實驗的供試菌株。

1.2.2 菌株菌落及細胞形態的觀察 在原油重金屬固體培養基上觀察菌落形態、邊緣、顏色和透明度等［23］。并采用掃描電鏡（SEM）對分離得到的菌株進行大小和形態的觀察［24］。

1.2.3 生理生化實驗 甲基紅實驗、V-P實驗、吲哚實驗、接觸酶實驗、脂酶實驗、酪蛋白水解實驗、糖發酵實驗、檸檬酸鹽實驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗、硫化氫產生實驗和動力實驗等方法見參考文獻［19］。

1.2.4 供試菌株對石油的降解和對鎳的去除及吸附實驗 將供試菌株接種在擴大培養基中培養為種子液。吸取0.5 mL加入到含Ni2+濃度為300 mg/L的50 mL的擴大培養基中，30℃恒溫震蕩（130 r/min）培養 72 h［25-26］。8 000 r/min 離心 10 min，將上清液和菌體沉淀完全分開，取0.5 g上清液通過消解，采用原子吸收分光光度法測定鎳的含量。將剩下的菌體沉淀取0.5 g，通過采用鹽酸-硝酸-氫氟酸-高氯酸消解法預處理后，用原子吸收分光光度法測定鎳的含量，計算鎳的去除率和吸附率［27］。再吸取0.5mL加入到50 mL原油液體培養基中，30℃恒溫震蕩（130 r/min）培養7 d，采用超聲萃取-紫外分光光度法測定培養基中石油含量，計算降解率。計算去除率、吸附率和降解率公式如下：

1.2.5 菌株16S rDNA的序列分析

1.2.5.1 核酸提取 菌株在基礎擴大培養基中，30℃條件下培養，取對數期的菌液于裝有1mL無菌生理鹽水的離心管中，洗滌一次，用生工生物工程（上海）股份有限公司細菌DNA提取試劑盒，提取基因組總的DNA。

1.2.5.2 PCR反應 引物設計來自文獻［28］：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 PCR反應體系

反應條件：94℃預變性4 min后進入循環，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環，最后在72℃延伸10 min后降溫至16℃。

PCR擴增的產物用濃度為1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測得的基因序列提交到NCBI數據庫做BLAST比對，進行序列同源性分析。

1.2.6 培養條件對菌株生長的影響 取種子液1 mL接種于50 mL的基礎擴大培養基中（pH為7.2-7.4）分別置于下列培養條件下震蕩（130 r/min）培養24 h，取樣測定OD600值。設置溫度的梯度為15、20、25、27.5、30、35和37.5℃。調節培養液初始pH至5、6、7、8、9、10和11。用葡萄糖和硝酸鉀作為碳源和氮源調節 C:N［29］為 2∶1、5∶1、7∶1、10∶1、12∶1、15∶1和17∶1。設置NaCl濃度為1%、2%、3%、5%、7%、9%和11%。所有實驗設置3個重復實驗。

1.2.7 菌株生長特性研究

1.2.7.1 菌株的生長曲線 取供試菌株接種于100 mL的基礎擴大培養基中，30℃在0-72 h周期里，間隔2 h取樣，測定OD600值。

1.2.7.2 污染物濃度對菌株生長的影響 分別配制下列不同污染物濃度的基礎擴大培養基中（pH為7.2-7.4），向每瓶接種1 mL種子液，30℃下培養0、2、3、4、5、7、10、18、30和48 h取樣測定OD600值。Ni2+濃度分別為150、200、250、300和350 mg/L。原油濃度分別為2.5、5、7.5、10和12.5 g/L。原油和重金屬混合濃度分別為2.5和0.15、2.5和0.2、2.5和0.25、2.5和0.3、2.5和0.35 g/L。

2 結果

2.1 供試菌株對石油降解和鎳的去除及吸附實驗

由圖1-A可知，在初篩時篩選出的7株菌株中，M1和M3菌株對鎳有較好的吸附和去除效果，當Ni2+的濃度為300 mg/L時，M1菌株對鎳的去除率和吸附率分別達到了56.64%和52.16%，M3對鎳的去除率和吸附率分別為58.07%和54.76%。由圖1-B可知，當總石油烴的濃度為10 g/L時，M1菌株對石油烴的去除率到達35.7%，而M3對石油烴的去除率只有16.4%。

圖1 鎳抗性和石油降解菌株對鎳的去除率及吸附率（A）及菌株對總石油烴的降解率（B）

2.2 菌株形態結構觀察及生理生化實驗指標

通過對菌株菌落的形態觀察及生理生化實驗結果（表2）得出，該菌株的菌落形態為圓形且濕潤、其顏色為淡黃色、邊緣規整、頂部凸起且透明度較差；從圖2可以看出細胞呈桿狀，表面略顯粗糙，直徑約0.6 μm，長約1.1-1.8 μm。此外，M.R實驗、硝酸鹽還原實驗、糖發酵實驗、吲哚實驗、接觸酶實驗及檸檬酸鹽實驗結果均為陽性（記為“+”）。革蘭氏染色、V-P實驗、脂酶實驗及酪蛋白水解實驗、H2S產生實驗、明膠液化實驗和動力實驗結果均為陰性（記為“-”）。從生理生化實驗結果發現，上述菌株生理生化結果與檸檬酸桿菌屬相一致，初步鑒定為檸檬酸桿菌屬。

圖2 菌株細胞掃描電鏡圖片

2.3 供試菌株16S rDNA的序列分析

為進一步確定菌株的種屬關系，通過細菌基因組DNA提取試劑盒提取了M1基因組的DNA，并以27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和 1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'為PCR上下游引物，進行PCR擴增，擴增出約1 407 pb的條帶并測序。序列結果與GenBank中的16S rDNA序列進行Blastn相似性分析發現，上述菌株與檸檬酸桿菌屬（Citrobacter sp.）的16S rDNA序列的同源性均達到了98.7%以上，上述菌株的系統發育樹如圖3所示，從進化距離分析發現與法氏檸檬酸桿菌的標準模式菌株接近，因此將它鑒定為法氏檸檬酸桿菌，命名為Citrobacter farmeri strain M1。

表2 菌株形態觀察及生理生化實驗結果

2.4 不同培養條件對菌株生長的影響

由圖4-A可以看出，該菌株最適宜的培養溫度在27.5℃和32℃之間。在30℃之前，隨著溫度的升高菌株的生長速率升高，超過30℃菌株的生長速率降低；由圖4-B可以看出，該菌株的最適pH在9左右；如圖4-C所示，該菌株最適的C∶N為10∶1；由圖4-D可以看出，該菌株隨著鹽濃度的增大，菌株的生長速率受到抑制，當鹽濃度超過5%生長受到抑制，當達到11%時基本不能正常生長。

圖3 菌株M1的16S rDNA系統發育樹

2.5 菌株生長曲線

由圖5所示，該菌株在生長了2 h時的OD600值為0.08左右，在培養了2-16 h后，OD600迅速上升，達到了2.0左右，說明該菌株在接種0-2 h內處于延遲期；在2-16 h內處于對數生長期；在培養至16-50 h間，OD600值變化不大，說明這時進入了生長的穩定期；50 h之后，OD600值開始減小，說明此時該菌株的生長進入衰亡期。以上結果說明該菌株生長速度快，適用于石油和重金屬復合污染土壤的修復。

2.6 Ni2+和石油濃度對菌株生長的影響

2.6.1 Ni2+濃度對菌株生長的影響 由圖6可知，在菌株的生長前期0-4 h，Ni2+濃度對菌株生長的影響較小，但是4-10 h內Ni2+的存在對菌株的生長抑制較強，隨著對數期的到來，菌株才恢復了正常生長。隨著培養基內Ni2+濃度的升高，菌株的生長提前進入穩定期，當Ni2+濃度為300 mg/L時，菌株在培養10 h后直接進入穩定期緩慢生長，沒有明顯的對數期出現。而當Ni2+濃度為100 mg/L時，菌株在培養至7 h進入對數期，20 h后才開始進入穩定期，對數期持續了13 h左右。

2.6.2 石油濃度對菌株生長的影響 由圖7可知，從其在含原油培養基中的生長的OD600值和其生長曲線比較可以看出，該菌株的生長均隨著培養基中原油質量濃度的升高而受到不同的抑制。在原油質量濃度為2.5 g/L時，供試菌株對數生長期縮短，提前4 h 進入最高生長量期，但當原油的質量濃度進一步升高時，其生長能力相對的有所下降。

2.6.3 石油和Ni2+混合濃度對菌株生長的影響 由圖8可知，當液體培養基同時添加不同量的Ni2+和原油后，菌株生長受到抑制。在原油濃度2.5 g/L時，當Ni2+濃度超過0.25 g/L時，菌株生長受到明顯抑制。

圖4 培養條件對菌株生長的影響

圖5 菌株生長曲線

圖6 Ni2+濃度對菌株生長的影響

3 討論

3.1 抗性菌株對石油和鎳的去除及吸附實驗

通過對菌株M1和M3對石油和鎳去除和吸附實驗，對石油主要通過降解作用從而達到對石油的去除。對鎳的吸附和去除率觀察得到相差不大，由此可見，細菌對重金屬主要通過吸附和通過一系列的活動使重金屬鎳改變價態，使其生成磷酸鹽沉淀而達到去除的作用［30］。利用微生物處理石油-重金屬混合污染土壤的實際應用中，所用菌株對金屬離子有較高的抗性和石油污染物有較好的降解效果，那么該菌株在污染土壤中往往具有較高的存活率，其處理污染土壤的效率也就越強［31-33］。綜合比較選取M1作為接下來的實驗菌株。

圖7 石油濃度分別對菌株生長的影響

圖8 石油和Ni2+混合濃度（g/L）對菌株生長的影響

3.2 不同培養條件對菌株生長的影響

溫度是通過影響蛋白質、核酸等大分子的結構與功能進而影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。溫度過高或過低，都會影響微生物的活性和代謝能力。不同微生物的生長繁殖要求的最適溫度不同，根據微生物生長的最適溫度范圍，可分為高溫菌、中溫菌和低溫菌。因此，每種菌株對環境溫度的要求有一個最適宜的生長范圍，本研究菌株最適宜的培養溫度在27.5-32℃之間。pH通過以下3個方面對微生物的生長產生影響：一是使蛋白質和核酸等大分子物質所帶電荷發生改變，從而影響其生命活性；二是引起細胞膜電荷變化，導致微生物吸收營養物質的能力改變；三是改變環境中營養物質的性質及有害物質的毒性。同時pH是反應菌株對環境的適應能力，不同的菌株對pH條件的要求各不相同，它們只能在一定的范圍內生長，然而每個菌株的生長最適宜的pH常限制于一個較小的范圍。該菌株在pH 7-9范圍內生長良好，說明該菌株具有一定的耐堿性。微生物的生長繁殖需要適宜的營養，碳源、氮源、無機鹽、微量元素、生長因子等都是微生物生長所必須，缺少其中一種，微生物便不能正常生長、繁殖。同時營養元素的比例也會對微生物的生長產生一定的影響，該菌株最適的C∶N為10∶1，在該營養元素比例下，可以為微生物創造一個良好的生長環境。高鹽度對微生物的毒害作用主要是通過升高環境滲透壓而破壞微生物的細胞膜和菌體內的酶，從而破壞微生物的生理活動。微生物生長繁殖受到鹽度影響的作用主要有3種情況：脫水死亡、物質吸收過程受干擾阻斷死亡和中毒死亡。不同微生物對滲透壓的適應能力不同。該菌株屬于耐鹽度比較高的菌株，西南地區頁巖氣井場附近的土壤含鹽量較低，均未超過1%［8］，由此可見該菌株適用于頁巖氣井場附近石油和重金屬復合污染區的修復。

3.3 Ni2+和石油濃度對菌株生長的特性的影響

菌株的適應期相對有所延長，可能由于金屬離子的存在對菌株生長產生了毒害作用。由于隨著Ni2+濃度的升高，使得對數期縮短或者存在不明顯，從而使細胞總量減少。但是從本實驗來看，Ni2+濃度在200 mg/L以下時，菌株受到的抑制比較小，最大OD值達到了2.1左右，和生長曲線相比，反而能得出低濃度的金屬離子的存在反而會促進菌株的生長［34］；當Ni2+濃度達到300 mg/L時，才出現明顯的抑制，說明該菌株對鎳的抗性比較強。重金屬等離子的抑菌作用主要是使菌體蛋白質變性，或者是與酶的-SH結合使酶失去活性。不同因素對微生物的影響不同，同一因素因其濃度不同，對微生物的影響也不同。

原油的質量濃度過高會對原油降解菌產生毒害作用，抑制菌體的正常生長繁殖，最終將會導致原油降解率下降，從而影響石油污染物的去除。另外，原油質量濃度過高，在培養基表面會形成一層油膜，油膜會阻止空氣中的氧氣向水體內部擴散，導致水中的溶解氧不足，從而抑制好氧微生物的生長［35］，因此也會出現原油質量濃度的升高，微生物對生命力下降的現象。綜上所述，該菌株對原油濃度有較高的耐受性。

由于篩選出來的該菌株將用于實際復合污染土壤的修復，該污染土壤中石油類污染物濃度較低，均未超過1%［8］，因此固定原油的濃度，調節鎳離子的濃度考察混合濃度對菌株生長的影響。本研究發現，復合污染物的對菌株的生長有較大程度的抑制，說明該菌株對復合污染物的抗性減弱。

4 結論

從四川省長寧-威遠頁巖氣開發井場重度污染土壤中，分離得到一株耐重金屬鎳的石油降解菌株，經過對菌株與菌落的觀察和生理生化實驗和16S rDNA分析，鑒定該菌株為法氏檸檬酸桿菌，命名為Citrobacter farmeri strain M1。該菌在重金屬鎳和石油污染的生物修復過程中起重要作用。（2）檸檬酸桿菌M1的生長條件試驗結果表明，該菌株具有較寬泛的pH生長范圍，在pH7-9范圍內生長良好；在鹽濃度1%-5%范圍內能較好地生長，并具有一定的耐堿性。當鹽濃度超過5%該菌株生長受到抑制，屬于耐鹽度較高的菌株。檸檬酸桿菌M1生長的最佳條件為是溫度為30℃，pH為9，C∶N為10∶1，鹽最高耐受度為5%。（3）在液體培養基中，檸檬酸桿菌M1對石油和重金屬鎳有較好的降解和去除作用，實驗周期內該菌株對原油降解率可達到35.65%，對重金屬Ni2+的去除率和吸附率分別達到56.64%和54.16%，同時對金屬鎳的抗性可達到300mg/L。

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Isolation and Identification of a Nickel-resistant and Petroleum Hydrocarbon Degrading Strain and Its Biological Characteristics

MA Yong-song LI Xi LI Zhen-zhen WANG Pei-jie
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest Petroleum University，Chengdu 610500）

A bacterial strain with high ability of nickel resistance and petroleum-degrading was isolated from the soil of heavily-polluted areas around the shale gas wells in Changning-Weiyuan，Sichuan Province，and its biological characteristics and physiological-biochemical indexes were studied. The seed liquid was inoculated into the liquid medium containing heavy metal and crude oil，cultured at 30℃ and 130 r/min for 7 days to explore the resistance of the strain to nickel ions（Ni2+）and the rate of degrading total petroleum hydrocarbon（TPH）.Further，the strain was identified based on the experimental results of physiology and biochemistry，morphological observation and 16S rDNA sequences. As results，the tolerance of the strain to Ni2+reached 300 mg/L，and the removal rate and adsorption rate of Ni2+reached 56.64% and 52.16%，respectively; meanwhile，the degradation rate of TPH reached 35.65%. The species of the strain belonged to Citrobacter（Citrobacter sp.）and named Citrobacter farmeri strain M1. The optimal growth temperature of this strain was 30℃，the optimal growth pH was from 7 to 9，the optimal C∶N was 10∶1，and the maximum salt tolerance was up to 5%. In conclusion，solid nickel resistance and petroleum degradability of the strain contributes to its applicability in the remediation of heavy metal and oil-contaminated soil.

petroleum-degrading bacterium；nickel resistance；isolation and identification；biological characteristic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0687

頁巖氣是一種清潔高效的能源，已經成為繼石油、煤炭之后的一種重要能源［1-2］。美國“頁巖氣革命”的成功為我國帶來了新啟示，中國頁巖氣于2011年被批準為獨立礦種，隨后國家出臺多種政策鼓勵頁巖氣開發［3］。在此背景下，四川省豐富的頁巖氣資源成為了能源開發的新熱點［4］。然而，頁巖氣的開發帶來的不僅僅是能源，同時也會對環境造成一定的壓力［5］。頁巖氣開采過程可能會造成土壤的污染，鉆井廢棄泥漿是油井開采過程中產生的污染物，包含礦物油、酚類化合物及重金屬等復雜多項體系［6-7］。西南地區部分頁巖氣開發井場附近土壤和鉆屑中石油類污染物和重金屬（Ni）都超過環境的閾值［8-9］，其中長寧-威遠地區土壤中鎳的含量超過《土壤環境質量標準》（GB15618-2008）三級標準限值，達到210.19 mg/kg［8］。由此治理在頁巖氣開采過程中造成的石油類污染土壤的同時，對重金屬超標的處理同樣不可忽視。而且持久性有機污染物和重金屬（Cd、Pb和Ni等）污染的現象比較突出［10］。其中石油類污染一直是環境的主要問題［11-12］，石油和重金屬在某些情況下可以共存，更難于修復［13-14］，重金屬和有機污染物造成的土壤污染已成為主要的全球環境和人體健康問題［15］，而如何修復多組分污染物土壤已成為近年來研究的熱點問題。利用微生物技術修復復合污染土壤起著重要作用，抗性微生物不僅可以以石油為唯一碳源對石油進行降解，還可以吸附和氧化還原重金屬，將有毒害的金屬元素轉化為無毒或者低毒的金屬離子，有利于重金屬在土壤中沉淀固定［16］。生物法修復多組分污染物目前仍處于起步階段，對于微生物修復技術在石油-重金屬復合污染土壤的修復研究尚且較少［17-18］，在頁巖氣開發井場復合污染土壤的修復研究更是空白，其作用機理及影響因素還需進一步研究。

2017-08-21

四川省科技支撐計劃（2015-SZ-0007）

馬永松，男，碩士研究生，研究方向：土壤生態環境修復；E-mail：hjmays@163.com

李琋，女，副教授，研究方向：生態環境修復；E-mail：icy124@hotmail.com

（責任編輯 狄艷紅）