人工濕地微生物的研究進展

王雨軒 魏巍 李萍萍 趙云 付為國，

（1. 江蘇大學現代農業裝備與技術教育部重點實驗室 江蘇省農業裝備與智能化高技術研究重點實驗室，鎮江 212013；2. 南京林業大學南方現代林業協同創新中心，南京 210037）

人工濕地微生物的研究進展

王雨軒1魏巍1李萍萍2趙云1付為國1，2

（1. 江蘇大學現代農業裝備與技術教育部重點實驗室 江蘇省農業裝備與智能化高技術研究重點實驗室，鎮江 212013；2. 南京林業大學南方現代林業協同創新中心，南京 210037）

人工濕地是20世紀70年代末得到迅速發展的一種污水處理技術工程，具有投資低、運行費用低、維護技術水平低和能耗低等優點。目前已被用于處理各種類型的廢水。它是由基質、植物和微生物構成的復合系統，其中，微生物在人工濕地系統凈化污水過程中發揮著重要作用。從人工濕地微生物群落多樣性和功能性兩方面對人工濕地系統中微生物的研究進展進行了概述，進而對人工濕地微生物研究的前景進行了展望，旨在為該領域的相關研究提供資料和借鑒。

人工濕地；微生物；多樣性；功能基因

鑒于微生物在人工濕地中的重要性，國內外學者已做了一定的研究。隨著生物技術的不斷發展，微生物研究方法也在不斷更新，從對菌種進行純培養的傳統法到微生物生理指標法，再到PCR指紋圖譜法及更為先進的高通量測序技術等，均可從不同的角度來研究濕地微生物群落結構特征［7-14］。近年來，有學者已對人工濕地微生物某些方面的研究進展進行了綜述，如周巧紅等［15］從人工濕地對病原微生物的去除、系統基質中微生物的種群和活性等方面的相關研究進行了綜述。本文從人工濕地微生物的群落多樣性與功能性研究出發，綜合敘述目前人工濕地微生物的研究現狀，并對該類研究進行展望，旨在為該領域的相關研究提供資料和借鑒。

1 人工濕地微生物多樣性研究

人工濕地微生物多樣性是指人工濕地中所有的微生物種類及其所擁有基因的多樣化程度，是影響人工濕地運行效果的重要因素。人們對微生物多樣性的研究已從個體菌株水平過渡到群體水平生理特征，近年來逐漸進入分子水平［16-17］。

研究表明，在大多人工濕地的微生物群落中，細菌數量最多，放線菌數量次之，而真菌數量則最少。其中，細菌中具有脫氮功能的氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌和反硝化細菌數量均處于較高水平［18］，這正是人工濕地具有良好脫氮效果的主要原因，也是人工濕地脫氮微生物成為當前研究熱點的主要原因。盡管以上各種具有脫氮功能的細菌數量均處于較高水平，但各自間數量及其隨濕地運行時間延長所呈現的變化趨勢差異極大。夏宏生等［19］研究發現，氨化細菌數量通常遠遠超過硝化細菌和反硝化細菌，且氨化細菌的數量隨著人工濕地運行時間的延長而增加，硝化細菌數量則隨之下降，而反硝化細菌數量受其影響較小，但它較其他細菌對溫度更為敏感。

另有學者研究了其他環境條件對人工濕地脫氮菌群多樣性的影響。Wang等［20］研究發現，人工濕地中具有硝化功能的菌群在基質的中上層以好氧性的氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）和氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）為主，且AOA豐度通常高于AOB，而在基質的中下層則以厭氧氨氧化菌為主，這主要是由于人工濕地不同層次基質中氧環境差異造成的［21］。也有研究報道，對人工濕地采取適當的氧調控措施如曝氣，會改善人工濕地微生物群落結構，提高微生物群落結構多樣性［22］。不同植物也可影響人工濕地基質中的以上菌群的數量，楊俊娜等［23］通過對濕地基質中氨氧化古菌和氨氧化細菌的amoA基因和反硝化過程中N2O還原酶的nosZ基因拷貝數的研究發現，江南榿木被引種到蘆葦人工濕地后，蘆葦根際和非根際土壤中和反硝化細菌的數量顯著降低，而氨氧化細菌的數量則沒有明顯變化，蘆葦人工濕地的脫氮功能受到削弱。因此，不同植被組合可影響人工濕地微生物的多樣性。

人工濕地中微生物的多樣性還受到植物種類和植物組合方式的影響。雷旭等［24］采用PCR-DGGE技術和基因測序技術，分別對以美人蕉、梭魚草和再力花為濕地植物的人工濕地根際微生物的多樣性進行了研究，結果發現3種植物的根際微生物群落分屬8個綱：α-變形菌綱（14.37%）、β-變形菌綱（38.13%）、γ-變形菌綱（6.87%）、ε-變形菌綱（16.87%）、δ-變形菌綱（6.87%）、放線菌綱（8.76%）、擬桿菌綱（4.38%）及硝化螺旋菌綱（3.75%），其中，β-變形菌綱為不同植物根際富集的主要細菌類群，同時發現3種植物根際的微生物數量各不相同，每種植物都存在一些種屬相同但是數量不同的微生物，根際微生物多樣性有隨著溫度的降低而減少的趨勢。因為不同季節不同植物的生長狀況和代謝活動不同，其輸氧能力和分泌物也不同，這些均會引起根系周圍微生物的種類和數量的變化［25-26］。另有研究顯示，多種植物系統的人工濕地與單一植物的濕地相比，具有更豐富的微生物群落，因此表現出更高的污染物降解率［27］。

以上關于濕地微生物多樣性的研究均從物種多樣性開展的，近年來，也有部分學者從基因水平對濕地微生物的功能基因遺傳多樣性進行了研究。Walsh等［28］在研究潛流人工濕地處理垃圾滲濾液的過程中得出，微生物群落組成有37個OTUs。Ibekwe等［29］運用變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）和細菌克隆文庫的方法，在研究表面流人工濕地中根系微生物和表層水中微生物時，得出了其微生物群落分別有31和36個不同的OTUs，進而得出，人工濕地中的植物覆蓋狀況可同時影響微生物的多樣性和濕地的去污效果，而該人工濕地植物覆蓋率為50%時，濕地微生物生長作為旺盛，群落多樣性最為豐富，且污染去除率最高。Peralta等［30］采用高通量測序技術，研究了人工濕地土壤中微生物的群落結構發現，主要細菌屬于酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，約占細菌總數的80%，而且人工濕地土壤中微生物間的差異比自然濕地小。Ligi等［31］也用該方法在對人工濕地生態系統片段微生物序列進行測序時發現，γ-、δ-和β-變形菌是最豐富的類群，而且不同的水文條件對濕地細菌群落結構有一定的影響。

人工濕地系統中，微生物的種類豐富，結構復雜，各類微生物在人工濕地凈化水質的過程中協同作用，這也正是人工濕地可以高效去污的主要原因之一。不同人工濕地中微生物種群和數量各不同，主要受到人工濕地廢水來源和類型、種植植物、基質材料和運行管理方式等因素的影響。

2 人工濕地微生物功能性研究

人工濕地的主要功能之一是去除污水中的氮素。氮素在人工濕地中的主要存在形式為有機氮、氨態氮和硝態氮。人工濕地對氮的去除主要依靠微生物的氨化、硝化和反硝化作用［32］。氨化細菌屬于好氧性細菌，在污水凈化過程中起到巨大作用；硝化作用在好氧和低氧條件下都能進行，由亞硝化菌與硝化菌共同完成從氨氮轉化為亞硝態氮和硝態氮的硝化作用；反硝化是濕地中氮去除的最后關鍵步驟［33］，該過程是在缺氧條件下由反硝化細菌作用使硝態氮還原成N2O或N2，從而使系統中氮得以去除。

杜剛和夏艷陽等［34-35］研究了潛流人工濕地微生物脫氮效率發現，微生物數量對NH4+-N和TN去除率影響明顯，其中對TN去除率影響更為明顯，微生物數量越多，對TN的去除效果越好。魏成等［36］對旱傘草、美人蕉和蘆葦植物進行組合實驗發現，3種植物組合系統和兩種植物組合系統根際微生物群落去污功能較強，利用碳源的能力較強，而單一旱傘草植物系統根際微生物群落去污功能較弱，利用碳源能力較差。因此，通過不同植物組合而成的濕地系統，可強化根際微生物群落的去污功能，從而提高人工濕地污染物凈化的效率和穩定性。龍麗珠等［37］認為，復合垂直流人工濕地中微生物群落的數量和活性均遠遠高于表面流和潛流人工濕地，其脫氮效果最好。這是由于系統中溶解氧隨深度增加呈現遞減趨勢，上層的有氧環境利于硝化細菌的活動，而中下層的缺氧環境則利于反硝化細菌的活動，這兩類細菌共同作用是去除氮素的有效途徑。

目前，人們對人工濕地微生物的研究已從傳統的間接功能性測定發展到分子水平甚至深入至基因序列等水平的測定。有研究表明，氮轉化速率與編碼氮轉化關鍵酶的基因存在著明顯的定量響應關系［38］。目前，人工濕地微生物主導的氨化、硝化和反硝化作用部分關鍵酶的編碼基因已被探明（圖1）。

近年來，陸續有研究者發現這些功能基因分布在更為廣泛的微生物類群中。例如，Treusch等［39］發現amoA基因不僅存在于細菌中，而且也存在于古細菌中，這表明主導人工濕地硝化作用的微生物可能既包括細菌，又包括古菌。Jones等［40］研究結果表明，具有反硝化功能的nosZ基因不僅存在于反硝化微生物中，而且存在于一些“非典型”的反硝化微生物中。而Wei等［41］的研究結果表明，nir基因不僅存在于變形菌門的α、β和γ變形菌綱中，也存在于放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門和硝化螺菌門等其他細菌類群中。同時，Wei等［42］報道在真菌的子囊菌門和接合菌門中的一些類群也具有nir基因。由此可見，在人工濕地中主導反硝化作用的微生物群落結構多樣性、豐度以及功能性可能被嚴重的低估了。

李鷺珍等［43］在對潮汐流人工濕地的研究中，檢 測 出 ANO、（nap A+nar G）、amo A、nxrA、nirS、qnorB和nosZ 八種氮轉化功能基因，建立了不同水文條件下氮轉化速率與氮轉化功能基因之間的定量響應關系。閆邢君［44］等從分子水平探究在不同低溫條件下和不同土層深度時的微生物群落和氮轉化途徑，建立了氮轉化速率與氮轉化菌群和功能基因amoA、qnorB、nosZ、napA、narG和nirS等之間的影響關系。結果均表明，人工濕地系統內氮轉化速率與氮轉化基因存在著明顯的定量響應關系；人工濕地內部氮轉化過程之間存在多種耦合機制，氮轉化速率受制于多種氮轉化菌群和功能基因的聯合作用。

圖1 生物氮轉化主要途徑及參與該過程關鍵酶的編碼基因

3 展望

在人工濕地污水凈化過程中，微生物發揮了舉足輕重的作用。然而，目前人工濕地微生物的研究表明，多數研究方法較為傳統，未來應運用更加全面先進的測序技術，從分子的水平上對濕地微生物的群落結構等特點進行深入研究。高通量測序技術作為新一代測序技術具有獨特的自身優點，對人工濕地微生物多樣性和功能性的研究具有很大的應用前景，它能夠提供巨大的生物學信息，從而更為準確地解析人工濕地微生物群落結構和功能。因此，有效地利用高通量測序技術將會為人工濕地微生物群落結構和功能研究開辟出全新的途徑。

人工濕地中微生物種群的多樣性和功能性日益成為人們研究的熱點，尤其是具有脫氮功能的菌群備受學者關注。但目前對脫氮微生物的研究過分拘于傳統菌種，譬如對厭氧氨氧化菌的分布、豐富度和活性的研究是不足的，需要進一步深入研究其在氮循環過程中的作用。此外，隨著具有amoA、nosZ和nirK/S等基因的新微生物菌群的發現，影響人工濕地脫氮效率的微生物可能遠遠超過現有種群。因此，需要深入對氮循環相關微生物多樣性的研究。如何提高脫氮效率是未來人工濕地技術需要解決的重要問題之一。

人工濕地中微生物的功能性是整個濕地系統運行成敗的關鍵，目前對濕地系統中不同微生物群落結構和功能方面所做的研究工作還相當少，且多數集中于傳統技術的間接微生物功能性研究，缺少對氮轉化菌群與其功能基因全面系統的定量研究。因此，有必要開發以功能基因研究為基礎的其他分子技術來全面研究人工濕地中微生物群落功能特征，以前文提到的日益多樣的氮素轉化功能基因為研究對象，明確濕地微生物對濕地系統去污能力的影響，這將對人工濕地的設計、去污、運行和管理有十分重要的意義。

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Study Progress on Microorganism in Constructed Wetlands

WANG Yu-xuan1WEI Wei1LI Ping-ping2ZHAO Yun1FU Wei-guo1，2
（1. Key Laboratory of Modern Agricultural Equipment and Technology（Jiangsu University）/Ministry of Education/Key Laboratory of Agricultural Equipment ＆ Intelligent High-Tech of Jiangsu Province，Zhenjiang 212013 ；2. Cooperative Innovation Center of Southern Modern Forestry，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037）

Constructed wetland is a sewage processing technology engineering developed rapidly since the late 1970s. It has the advantages of low investment，low running cost，low-level maintenance technology and low energy consumption. Currently，it has been used to process various types of waste-water. Constructed wetland is a composite system composed of matrix，plant，and microorganism，in which microorganisms play an important role in the process of waste-water purification. This paper introduces the research progress of microorganisms in the constructed wetland system from the diversity and function of microbial community，and further gives the research prospects in this field，aiming at providing information and reference for relevant researches in this field.

constructed wetland；microbe；diversity；functional gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0125

人工濕地是通過模擬自然濕地，經人為設計和建造，并可監督控制的一種污水生態處理工程，它是由基質、植物、微生物和水體組成的一種復合生態系統［1］，其去污機理是利用基質、植物和微生物三者間物理、化學和生物三重協調作用，通過過濾、吸附、沉降、離子交換、植物吸收和微生物分解，實現對污水的高效凈化［2，3］。因具有投資少、效率高、處理效果穩定、運行費用低、抗負荷沖擊能力強和維護方便等優點，現已被廣泛應用于多類廢水處理［4］，相關的研究同時也在廣泛地開展。

目前，人們對人工濕地的研究已從人工濕地的類型、基質的篩選、植物的選取和處理效果等方面逐步深入至微生物水平。微生物承擔著水中污染物的降解任務，是系統中的主要分解者［5］，因此，對人工濕地系統中微生物的探究有助于我們了解濕地植物與微生物在污染物去除過程中的協同作用，從而為優化生物系統組合和構建高效污水處理的人工濕地系統提供參考［6］。

2017-02-22

國家自然科學基金項目（31370448），江蘇省農業科技自主創新引導資金項目［CX（15）1004］，江蘇省高校自然科學研究重大項目（15KJA210001）

王雨軒，女，碩士研究生，研究方向：人工濕地去污；E-mail：jsdxwyx56@163.com

付為國，男，研究員，研究方向：濕地生態；E-mail：fuweiguo@ujs.edu.cn

（責任編輯 狄艷紅）