基于木糖異構酶途徑的木糖發酵釀酒酵母菌株構建研究進展

李云成 孟凡冰 茍敏 孫照勇 湯岳琴

（1. 成都大學藥學與生物工程學院，成都 610106；2. 四川大學建筑與環境學院，成都610207）

基于木糖異構酶途徑的木糖發酵釀酒酵母菌株構建研究進展

李云成1孟凡冰1茍敏2孫照勇2湯岳琴2

（1. 成都大學藥學與生物工程學院，成都 610106；2. 四川大學建筑與環境學院，成都610207）

通過異源表達木糖代謝途徑，構建能高效發酵木糖產乙醇的工業釀酒酵母菌株，對木質纖維素燃料乙醇的開發具有重要意義。與氧化還原途徑相比，木糖異構化途徑的表達不會因輔酶不平衡而造成中間產物木糖醇的累積，因此被視為是理想的木糖代謝途徑。在木糖異構途徑的表達過程中，選擇工業釀酒酵母作為出發菌株進行木糖異構酶途徑的表達具有突出優勢。同時，提高木糖異構酶基因xylA的表達效率對木糖異構菌株的構建至關重要。另外，在對XI菌株進行代謝工程改造時，GRE3的敲除、木糖轉運的提升、木糖代謝途徑的定向改造等均能有效改善菌株發酵木糖產乙醇的能力。除此之外，進化工程也是提升XI菌株木糖發酵效率的重要方法之一。而在相關機理闡釋和改造策略的制定過程中，組學技術已顯示出強大的功能。綜述了近年來木糖異構酶途徑在釀酒酵母中的表達研究進展，同時還對相關研究存在的問題進行了分析。

釀酒酵母；燃料乙醇；木糖異構酶；菌株構建

以農林廢棄物為代表的木質纖維素生物質（Lignocellulosic biomass）是一種重要的可再生資源。農林廢棄生物質主要由纖維素（Cellulose）、半纖維素（Hemicellulose）和木質素（Lignins）構成，可經生物轉化生產多種生物燃料，如燃料乙醇、生物柴油和甲烷等。其中，燃料乙醇（Fuel ethanol）是一種典型的可替代運輸燃油的重要液體燃料［1-2］。發酵法是目前燃料乙醇的主要生產方法，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是燃料乙醇工業化生產中普遍使用的微生物。釀酒酵母具有較強的產乙醇能力，且對木質纖維素水解抑制物具有較好的耐受能力［2-4］，因此被視為纖維素乙醇生產的首選微生物。然而，天然釀酒酵母不能利用木質纖維素水解所產生的戊糖（主要為木糖）進行生長和發酵。因此，開發能同時發酵葡萄糖和木糖的工業釀酒酵母菌株，對推進和加快纖維素乙醇的工業化，促進農林廢棄物資源的高效利用具有重要意義。

目前有兩條木糖代謝途徑能夠在釀酒酵母中表達［3］：氧化還原途徑和異構化途徑（圖1）。在能利用木糖的大多數真菌和酵母中木糖可被NADH/NADPH依賴型木糖還原酶（Xylose reductase，XR）還原為木糖醇，然后被NAD+依賴型木糖醇脫氫酶（Xylitol dehydrogenase，XDH）氧化為木酮糖，再磷酸化后進入戊糖磷酸途徑（Pentose phosphate pathway，PPP）。然而，XR主要為NADPH依賴型酶，XDH則是嚴格的NAD+依賴型，不同的輔酶親和性導致重組釀酒酵母體內的輔酶不平衡，使菌株大量積累中間代謝產物木糖醇，大大降低了乙醇的產量［5］。

在一些細菌和厭氧真菌中，存在木糖異構酶（Xylose isomerase，XI），可直接將木糖異構化為木酮糖，然后磷酸化進入PP途徑［2-3］。由于XI途徑不需要輔酶參與，故不會因輔酶不平衡而導致中間產物木糖醇累積，因此被視為理想的木糖代謝途徑［2］。然而，從目前研究來看，無論何種來源的XI基因（xylA）在釀酒酵母中表達，所構建的重組菌株木糖發酵效率仍達不到工業化生產的要求［6］。要想構建基于XI途徑的高效木糖發酵菌株，還有很多的技術難題亟待突破。因此，本文就近年來木糖異構酶途徑在釀酒酵母中的表達進行了綜述，同時還對相關研究存在的問題進行了簡要分析，以期為今后相關工作的開展提供參考。

圖1 重組釀酒酵母中的木糖代謝途徑

1 XI途徑在釀酒酵母中的表達

1.1 出發菌株的選擇

在基因的異源表達過程中，同一個基因在不同遺傳背景的出發菌株中表達，所構建的工程菌株的發酵性能差異較大［3，7］，即所謂的宿主依賴性（Host dependence）［8］。目前，有關 XI菌株構建的相關研究，大多選擇了實驗室酵母作為出發菌株［3，9］，雖然實驗室酵母遺傳背景清晰，容易對其進行代謝工程改造，但由于實驗室菌株本身具有無法克服的脆弱性，很難將其應用于工業化生產。同時，由于菌株構建過程存在宿主依賴性，利用實驗室酵母得到的研究結果，再次應用到工業酵母時，可能并不能達到預期效果。因此，在燃料乙醇工業化生產過程中，選擇合適的工業釀酒酵母作為出發菌株有著舉足輕重的作用。通常情況下，工業釀酒酵母比實驗室酵母具有更好的乙醇耐受能力，對木質纖維素水解液中的抑制物耐受性也更強［3，6，9］。表1對比了近年報道的不同XI菌株的木糖發酵結果，可以看出，以工業釀酒酵母作為出發菌株，進行XI途徑表達，所構建的菌株無論是在單一木糖條件下，還是在木糖/葡萄糖混合發酵條件下，其在木糖代謝速率、乙醇生成速率、和乙醇收率等方面均表現出了一定的優勢。當然，工業釀酒酵母大多為同宗配合型，很難通過產孢子得到單倍體，因此在進行遺傳操作時較實驗室酵母復雜。

1.2 xylA基因的異源表達

從目前研究來看，從木糖利用微生物中獲得的xylA在釀酒酵母中異源表達時，其表達效率往往較低，直接原因之一可能與物種的密碼子偏好（Codon bias）有關。密碼子偏好，即編碼同一個氨基酸的不同密碼子，在不同物種中的使用頻率不同［17］。因此在xylA表達前，可對其密碼子進行適當優化，消除稀有密碼子、調整GC含量、簡化二級結構，以提升xylA在釀酒酵母中的表達效果。Brat等［18］對比了來自Clostridium phytofermentans的xylA密碼子優化前后在釀酒酵母中的表達效果，結果表明，密碼子優化可直接降低XI酶的米氏常數Km值，提高反應速率Vmax，進而使菌株在木糖培養基上的生長和發酵效率遠高于表達了原始xylA的菌株。然而，并不是所有的xylA密碼子優化都能直接提升XI菌株在木糖培養基上的生長，Hector等［12］和Li等［19］研究表明，對來自 Prevotella ruminicola和Orpinomyces sp.的xylA的密碼子進行優化并表達在釀酒酵母中，與表達了原始xylA的菌株相比，密碼子優化表達菌株的生長和發酵性能并沒有提升，反而稍有降低。不過，進一步的研究卻顯示，優化表達的菌株在適應性馴化過程中，生長和發酵能力的提升幅度更大［19］。因此，密碼子優化在xylA的表達過程中還是有必要的。

影響重組釀酒酵母XI酶活的另外一個直接原因可能與xylA的拷貝數有關。利用多拷貝質粒對xylA進行表達，經過適應性馴化后，發現菌株體內的xylA的拷貝數增多［5，12］，因此在利用基因組整合的方式表達xylA時，往往會采用多位點整合，以提高xylA的拷貝數，如在酵母的δ區整合xylA基因［20］。然而，并不是xylA的拷貝數越多越好，過多的xylA進入釀酒酵母之后，可能會造成轉錄負擔和代謝負擔［15，21］，反而使菌株的木糖發酵效率降低。研究發現，將進化工程獲得的突變型xylA表達在釀酒酵母中，在較低的xylA的轉錄水平上就能獲得較高的XI酶活，進而使菌株具有較高的木糖發酵效率［15］。

2 XI菌株的代謝工程改造

2.1 內源性木糖還原酶基因GRE3的敲除

釀酒酵母雖然不能利用木糖發酵產乙醇，但存在GRE3基因編碼木糖還原酶，可將少量的木糖轉化為木糖醇。一方面會造成碳的損失，降低了乙醇的收率；更為重要的是，木糖醇的存在會嚴重抑制XI的酶活［22-23］，造成菌株的木糖發酵效率大大降低［20］。特別是在偏酸性條件下，木糖醇等其他多元醇會與XI酶上的氨基酸殘基形成氫鍵相互作用，從而阻礙了木糖與XI酶的結合。但這種相互作用在堿性（生理）條件下并未觀察到［22］。不同來源的xylA受木糖醇抑制的作用不同，研究表明，木糖醇對來自Piromyces sp.的XI酶的抑制作用要遠大于來 自 Clostridium phytofermentans的 XI酶［18］， 而 來自Bacteroides stercoris的XI酶活幾乎不受木糖醇的抑制［24］。盡管如此，為了盡量減少副產物生成，在xylA的表達過程中，敲除宿主菌中的GRE3基因仍是有必要的。

2.2 木糖轉運的提升

無論是在XR-XDH菌株還是在XI菌株中，木糖轉運均是非常重要的技術難題。釀酒酵母可依賴自身己糖轉運子（Hexose transporters，Hxt）來轉運木糖，但己糖轉運子對葡萄糖具有高親和力，當培養基存在葡萄糖時，木糖轉運就會受到抑制，從而造成木糖發酵滯后［3，9，25-26］。Hamacher等［27］將釀酒酵母的己糖轉運子HXT1-17和GAL2全部敲除，使菌株不能利用葡萄糖和木糖進行生長和發酵，然后分別將這些基因重新進行表達發現，表達HXT4、HXT5、HXT7、或GAL2后，菌株在木糖培養基上的生長得到恢復。利用類似的方法，Saloheimo等［28］發現HXT1和HXT2也具有轉運木糖的功能。因此，研究者們希望通過高表達這些具有木糖親和力的己糖轉運子來提高菌株對木糖的轉運能力，如Subtil等［29］研究表明，高表達HXT7或GAL2基因，可在一定程度上提升菌株的木糖發酵速率。然而，由于這些轉運子對木糖的親和力遠遠低于對葡萄糖的親和力，通過簡單的高表達并不能有效的解決葡萄糖/木糖共發酵時木糖代謝滯后的問題。因此，研究者們試圖通過其他方式提升菌株的木糖轉運能力，例如通過適當突變改變己糖轉運子的親和力，使其親和葡萄糖的能力降低，親和木糖的能力升高［30-33］。Farwick等［33］將 HXT7和 GLA2的葡萄糖 C6結合區附近的氨基酸進行突變，可增加它們對木糖的親合性，降低甚至消除對葡萄糖的親合性。另外，對HXT7的第79位的苯丙氨酸突變為絲氨酸，同樣可以增加其對木糖的親合性［30］。報道顯示，通過適應性馴化后，木糖菌株的己糖轉運子HXT36的第36位天冬酰胺突變為丙氨酸，可使菌株的木糖轉運顯著加強［31］。

表1 不同XI菌株木糖發酵性能對比

通過異源表達其他物種的高親和力木糖轉運子也可提高菌株的木糖轉運能力。目前為止，已有30多個糖轉運子被鑒別出具有轉運木糖的能力［34］，其中關注最多的有來自Sch.stipitis［35-37］的SUT1、XUT1-7， 以 及 來 自 Candida intermedia［36，38-40］的GXF1、GXS1。然而，從目前報道來看，有些轉運子在釀酒酵母中異源表達后可在一定程度上提升菌株的木糖發酵，但仍沒有轉運子能夠同時轉運葡萄糖和木糖，或顯著提升菌株的木糖發酵［34］。因此在未來的研究中，還需要繼續挖掘能在釀酒酵母中成功表達的木糖轉運子，或通過基因工程等手段對現有的轉運子進行適當改造。

2.3 木糖代謝途徑的定向改造

同XR-XDH菌株一樣，XI菌株的木糖代謝途徑調控主要涉及木酮糖激酶（XK）的高表達，PPP途徑代謝能力的提升等。釀酒酵母自身的XK活性比較低，會限制木糖發酵速率［3］，高表達釀酒酵母自身的XKS1基因，或異源高表達來自Sch. Stipitis的XK基因 XYL3，可有效提升菌株的木糖發酵效率。因此在進行xylA表達時，一般都會同時對XK的活性進行提升（表1）。然而，XK的酶活并不是越高越好［3，41］。如異源高表達了XYL3的XI菌株H131-A3經過多輪適應性馴化后，XKS1的拷貝數降低，但mRNA量升高，XK酶活有所下降［5］，說明菌株在馴化過程中進行了適度調節。在進行xylA表達時，XK的需求量需要根據XI活性及PPP等下游途徑的代謝通量進行調整，如可以選擇不同的啟動子可對XKS1（或XYL3）的表達水平進行調節［15］。

非氧化PPP途徑是釀酒酵母中木糖代謝的必經之路，由于釀酒酵母主要利用葡萄糖進行乙醇發酵，因此其PPP途徑的代謝效率一般較低［3］。另外，PPP途徑中的某些中間代謝產物也是菌株合成代謝的前體物，如核糖-5-磷酸（Ribose-5-phosphate，R5P）是合成5-磷酸核糖-1-焦磷酸（Phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP）的前體物，而PRPP可參與某些核苷酸、輔酶、氨基酸的合成。因此，適當調節非氧化PPP途徑中的相關基因，如轉醛醇酶基因TAL1、轉酮醇酶基因TKL1、5-磷酸核酮糖異構酶基因RPE1及核糖-5-磷酸異構酶基因RKI1，對提高菌株木糖發酵效率具有重要作用。研究表明，高表達非氧化PPP途徑中的TAL1、TKL1、RPE1、RKI1基因的XI菌株SyBE002要比其出發菌株SyBE001的木糖消耗速率提高1.19倍［15］。在PPP途徑的基因中，關注最多的基因就是TAL1。Vilela等［14］研究發現，XI菌株在經過多輪適應性馴化后，木糖消耗速率大大提升，定量PCR顯示，馴化菌株的TAL1表達水平比出發菌株提高了3倍。然而，非氧化PPP途徑的這些基因的表達水平并非越高越好，不同菌株PPP途徑的代謝效率可能有所差別。Zhou等［5］同源高表達了XI菌株的TKL1、RPE1、RKI1基因，以及異源高表達來自Sch. Stipitis的TAL1基因，通過進化工程馴化后，TAL1基因的表達水平下降到與其他3個基因的表達水平接近。說明PPP途徑中各基因的表達水平需要與XKS、xylA，以及自身途徑中各基因的表達水平達到平衡，才能使整個代謝途徑通暢的流通。同樣，TKL1高表達的XI菌株，在適應性馴化過程中，其表達水平也會適當下調，以使整個PPP途徑保持平衡［15］。另外值得注意的是，在進行葡萄糖/木糖混合發酵時，釀酒酵母自身的PPP相關基因容易受到葡萄糖的抑制，異源高表達來自其他物種的基因可能會緩解這一問題，如Sch.Stipitis的TAL1基因在釀酒酵母中表達后就不容易受到葡萄糖抑制［42］。

3 進化工程育種

除上述代謝工程外，進化工程也是提升XI菌株木糖發酵效率的重要方法之一［3，9］。進化工程是利用自然選擇的原理，通過模擬自然進化中的變異和選擇過程，以實現對目標微生物的快速進化，從而獲得具有目標性狀的菌株［43］。由于木糖異構酶基因在釀酒酵母表達后，即使通過代謝工程對菌株的木糖轉運和代謝進行定向調控，其在木糖培養基上的生長和發酵效率一般都較低，因此常通過進化工程手段來提升菌株的發酵性能［5，10-12，44］。進化工程主要是從細胞全局上提升菌株發酵性能，對于其分子機制尚不是很清楚，但可以知道，馴化過程改變了木糖的轉運和代謝相關基因的表達水平，或使相關基因發生突變，改變對應酶的特性。例如，通過適應性馴化，XI菌株的己糖轉運基因HXT7的第79位氨基酸發生突變，使其對葡萄糖的親和力下降，對木糖的親和力上升［30］；同樣通過馴化后，具有木糖親和的轉運基因HXT2的表達顯著提高［14］。馴化過程除了增強了菌株的木糖轉運外，還會對菌株的木糖代謝途徑進行調整，特別是對 xylA［5，12，15］、XKS1（或 XYL3）［5，15］、PPP 途徑［14-15］，以及糖酵解等途徑［15］中的基因表達的調整。Qi等［15］的研究表明，當XI菌株經過適應性馴化和篩選后，其木糖異構酶基因xylA表達下調，木酮糖激酶基因XKS1表達上調，PPP途徑中的大部分基因表達變化不顯著，但糖酵解途徑中的大部分基因表達下調，說明馴化菌株中的基因表達更加平衡，從而使菌株發酵木糖產乙醇的途徑更加通暢。

XI菌株進化工程育種過程中，選擇合適的馴化方式和條件十分重要，不同的馴化條件下馴化的周期和效果不同［13］。從現有報道來看，反復批次馴化是應用最多的馴化方式。在反復批次馴化過程中，接種量和轉接時間是兩個非常重要的參數，Lee等［13］的研究結果表明，采用低接種量（0.5%）進行馴化時的馴化效果要比高接種量（1%和5%）的馴化效果好，這可能是因為接種量越大，對于單個菌株的自然選擇壓力相對變小，從而不利于快速篩選出有利突變。另外，該研究還發現，當菌體生長到對數期進行轉接時，要比在穩定期進行轉接的效果好，可能是因為對數期的菌株生長旺盛且突變正在進行，此時進行轉接，則有利于鞏固有利突變；如果當菌株生長到穩定期時，不利突變大量積累，此時進行轉接，也不易獲得有利突變［13］。另外，在馴化培養基的選擇方面，XI菌株的馴化采用最多的培養基為基本培養基（也即 YNB 培養基）［8，15，30，45］，只有少數的研究采用了營養培養基（YP培養基）［12，41］和完全補充混合培養基（CSM培養基）［46］，雖然目前尚無研究表明哪一種培養基更適合菌株的適應性馴化，但它應該受到關注。

由于xylA在釀酒酵母表達活性較低，所構建的XI菌株在以木糖為單一碳源的培養基上有氧生長較緩慢，因此馴化過程可采用“分段式馴化”法：首先在有氧條件下馴化其生長能力，然后再轉移到微氧或厭氧條件下馴化其發酵能力［8，12，41，47］。除此之外，通過改變碳源組成，可以有效馴化改善菌株對混合糖的發酵能力。如Wisselink等［44］將XI菌株在葡萄糖/木糖/阿拉伯糖培養基上進行馴化一段時間，然后轉到木糖/阿拉伯糖培養基上，最后在只含阿拉伯糖的培養基上馴化，這樣逐步提升菌株對木糖和阿拉伯糖的利用能力。

單獨使用馴化工程手段對菌株木糖代謝能力的提升效率不高，將馴化工程與代謝工程或基因突變相結合，往往效果更佳。例如在馴化前，一般會將菌株的木糖轉運、木酮糖磷酸化、PPP途徑等進行定向改造［10，45］。將XI菌株首先進行隨機誘變，提高突變幾率，然后再用進化工程進行定向選擇，能夠較易獲得目標性狀菌株［11，13，45］。Lee 等［45］利用隨機誘變結合進化工程的方法分離出的XI菌株，其XI酶活較出發菌株提升了77%；Demeke等［11］利用隨機誘變、genome shuffling、進化工程對XI菌株木糖發酵能力進行提升，得到的工程菌株在接種量為1.3 g DCW/L時，13 h內就能同時發酵36 g/L的葡萄糖和37 g/L的木糖，其乙醇收率和產率分別達到0.46g/g-consumed sugar和2.58 g/（L·h），同時具有較好的發酵木質纖維素水解液產乙醇的能力，為同類菌株中的翹楚，其方法也值得借鑒。

4 組學技術的應用

傳統的菌株改造方法主要通過多次隨機誘變和定向篩選，或通過馴化獲得優良菌株，這些方法改造過程隨機性大，費時費力，并且對性能提高的機制認識不足［48-49］。基因組學、轉錄組學、蛋白組學、流量組學等組學技術的發展可使人們在不同層次上更加系統深入地了解生物復雜網絡的代謝及調控機理，識別目標基因、挖掘新的代謝途徑等［6，50］，從而使研究工作更具靶向性和明確性，更加易于獲得目標性狀，并大大縮短育種周期。無論是在XI菌株，還是其他釀酒酵母代謝調控方面，組學技術在機理闡述方面的應用較多，也已經顯示出了強大的功能。例如通過代謝流量組學分析，可以預測整個木糖代謝網絡的變化，包括pp途徑、糖酵解途徑、產乙醇途徑等各代謝節點的流量情況，為進一步的代謝調控提供依據。然而，由于組學分析數據量大，如何在海量的數據中篩選出有效信息，是研究的難點，亟待進一步突破。因此真正運用組學技術制定代謝調控策略的報道并不多。Hou等［51］利用基因組測序，識別出XI菌株經馴化后ASK10基因發生突變，突變型Ask10p通過影響分子伴侶的高表達進而影響了XI的表達效率。

5 結語

與XR-XDH途徑相比，XI途徑在釀酒酵母中的表達不需要輔酶參與且沒有中間產物木糖醇生成，因此XI菌株在木糖發酵過程中有更高的乙醇收率。雖然從目前的研究結果來看，XI菌株的木糖代謝速率仍較低，但隨著研究的深入，XI菌株的構建在最近兩年已經取得了很大的進展，顯現出很好的應用前景。未來在XI菌株構建過程中，應關注以下方面：（1）提高xylA的表達活性。目前在xylA表達過程中，主要靠提高拷貝數來提高XI的活性。然而，大量的拷貝數進入到釀酒酵母體內，可能會產生轉錄負擔和代謝負擔，反而阻礙菌株對木糖的代謝，因此如何讓xylA在較低拷貝數下保證較高的表達活性，是研究的重點。（2）多種育種手段組合使用。在XI菌株的構建過程中，單一的菌株選育手段得到的XI菌株木糖代謝能力提升有限，利用多手段，如基因工程、酶工程、進化工程、genome shuffling等手段結合起來，對菌株進行改造，往往效果更佳。（3）組學技術的應用。組學技術對于代謝機理的闡釋和改造靶點的識別方面逐漸顯現出強大的功能，因此在XI菌株木糖改造策略的制定方面會應用的越來越多。

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Research Progresses on Strain Construction of Xylose Isomerase-based Recombinant Xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae

LI Yun-cheng1MENG Fan-bing1GOU Min2SUN Zhao-yong2TANG Yue-qin2
（1. College of Pharmacy and Bioengineering，Chengdu University，Chengdu 610106 ；2. College of Architecture and Environment，Sichuan University，Chengdu 610207）

It is of utmost significant to construct industrial xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae strains for lignocellulosic bioethanol production through the heterologous expression of xylose metabolic pathway. Xylose isomerase pathway is regarded as the most promising pathway expressing in S. cerevisiae，since there is no xylitol accumulation resulted from the coenzyme imbalance in xylose redox pathway. In heterologous expression of xylose isomerase，selecting an industrial S. cerevisiae strain as initial strain is of outstanding advantages for lignocellulosic bioethanol production. Concurrently，improving the expression efficiency of xylose isomerase gene（xylA）is vital for constructing a robust xylose fermentation strain. In addition，the deletion of GRE3，strengthening of xylose transport and rational modification of xylose metabolic pathway during the metabolic modification of strain XI effectively improved the xylose fermentation capacity of the recombinant strains. Besides，evolutionary engineering also increased the xylose fermentation efficiency of XI strains. Furthermore，the omics technologies have presented their power in explaining the mechanism and developing the modification strategies of xylose metabolism. This paper reviews the research progresses on the expressions of xylose isomerase pathway in S. cerevisiae and analyzes the issues in the relevant studies.

Saccharomyces cerevisiae；fuel ethanol；xylose isomerase；strain construction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0448

2017-05-30

四川省科技創新苗子工程重點項目（2017RZ0021），成都大學校青年基金項目（2017XJZ18）

李云成，男，博士，講師，研究方向：微生物代謝調控；E-mail：liyunchengs@126.com

湯岳琴，女，博士，教授，研究方向：環境生物工程；E-mail：tangyq@scu.edu.cn

（責任編輯 狄艷紅）