仿生礦化PLGA/MWNTs/HA引導(dǎo)組織再生膜的細(xì)胞相容性研究

張華林 王凱戎 馬海絨

（寧夏醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川750004）

·論 著·

仿生礦化PLGA/MWNTs/HA引導(dǎo)組織再生膜的細(xì)胞相容性研究

張華林 王凱戎 馬海絨

（寧夏醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川750004）

目的 通過(guò)仿生礦化的方法制備PLGA/MWNTs/HA牙周引導(dǎo)組織再生膜并對(duì)其細(xì)胞相容性進(jìn)行表征。方法 先將聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]與多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWNTs）復(fù)合，采用溶液澆鑄法制備PLGA/MWNTs復(fù)合膜；再將其仿生礦化，制得PLGA/MWNTs/羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）復(fù)合膜，再將人牙周膜干細(xì)胞接種于PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜上培養(yǎng)，采用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）觀察細(xì)胞在復(fù)合膜上的形貌，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法分析細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果 PLGA/MWNTs復(fù)合膜表面比較均勻、致密；礦化7天后，PLGA/MWNTs復(fù)合膜表面有磷灰石晶體形成；人牙周膜干細(xì)胞在PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜表面生長(zhǎng)、增殖良好，HA的加入有利于細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。結(jié)論 通過(guò)仿生礦化法制得的PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜具有良好的細(xì)胞相容性，有望在牙周引導(dǎo)組織再生領(lǐng)域發(fā)揮作用。

仿生礦化；PLGA/MWNTs/HA；引導(dǎo)組織再生膜；細(xì)胞相容性

目前，牙周病在世界范圍內(nèi)患病率較高，嚴(yán)重影響人的口腔健康和生活質(zhì)量[1]。傳統(tǒng)的牙周病治療方法包括刮治術(shù)、根面平整、翻瓣術(shù)等，主要目的是去除感染、阻止病變進(jìn)展，卻無(wú)法實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生[2]。因此，重建已喪失的牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能是目前口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所面臨的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問(wèn)題。

20世紀(jì)80年代初由Nyman等提出的引導(dǎo)組織再生（Guided tissue regeneration，GTR）為牙周組織的再生提供了可能。它是指在齦瓣與根骨面之間放置一種屏障膜，以阻擋牙齦上皮、結(jié)締組織與根面接觸，而使具有形成新附著能力的牙周膜前體細(xì)胞在愈合過(guò)程中沿著根面生長(zhǎng)，重新形成牙骨質(zhì)、牙槽骨以及牙周纖維，建立新附著，進(jìn)而達(dá)到牙周組織再生[3]。在GTR中，GTR膜是決定其手術(shù)效果的關(guān)鍵因素之一。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]和多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWNTs）這兩種生物材料目前在組織工程領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。可降解高分子聚合物PLGA，具備很好的組織相容性、力學(xué)性能和降解性能。MWNTs同時(shí)具備高強(qiáng)度、高彈性和高剛度，其超強(qiáng)的力學(xué)性能可以極大地改善復(fù)合材料的強(qiáng)度和韌性；另一方面，MWNTs在與血液、骨、軟骨和軟組織接觸時(shí)，表現(xiàn)出了良好的生物相容性[4]。但這兩種材料均缺乏骨誘導(dǎo)性，而仿生礦化法可以改善此缺點(diǎn)。

本研究將溶液澆鑄法制得的PLGA/MWNTs復(fù)合膜進(jìn)行仿生礦化，制備一種PLGA/MWNTs/HA引導(dǎo)組織再生膜，并研究其細(xì)胞相容性，可望得到一種新型的引導(dǎo)組織再生膜，為牙周引導(dǎo)組織再生膜的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 PLGA/MWNTs復(fù)合膜的制備：取PLGA 2 g，溶于20 mL的三氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中，待PLGA完全溶解后加入0.2 gMWNTs，充分?jǐn)嚢?0 min后，超聲震蕩60 min使MWNTs分散均勻，然后將混合溶液倒入聚四氟乙烯皿后靜置于通風(fēng)櫥中，48 h后揭膜。

1.2 過(guò)飽和礦化液（SCS）的配置：過(guò)飽和礦化溶液按 Li F 的配方由 CaC12、NaH2PO4、NaHCO3配制[5]。三種化合物使用前按比例混合，配成SCS礦化液，pH值為5.96。

1.3 PLGA/MWNTs復(fù)合膜的仿生礦化：將干燥的PLGA/MWNTs復(fù)合膜浸泡于37℃的恒溫SCS礦化液中，礦化時(shí)間為7 d，得到PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜。礦化結(jié)束后，樣品用蒸餾水漂洗，自然干燥。

1.4 PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜的表征：采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察膜及沉積物的表面形貌；采用X射線能量色散譜儀（EDX）檢測(cè)沉積物的元素種類(lèi)和比例。

1.5 人牙周膜干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：收集臨床正畸拔除的雙尖牙，年齡12～16歲，所選牙齒均無(wú)齲壞、根尖周疾病及牙周炎。拔牙前徹底消毒術(shù)區(qū)。拔除后將牙齒立即投入DMEM培養(yǎng)液中，用生理鹽水（含青霉素 500 μ/mL，鏈霉素 500 μg/mL）反復(fù)浸洗滅菌后，將牙齒移入另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中，仔細(xì)刮取根中1/3的牙周膜組織。將組織塊以均勻間距接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，加入5 mLDMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清，青霉素100 μ/mL，鏈霉素100 μg/mL），將培養(yǎng)瓶置于37℃含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，觀察細(xì)胞游出情況，待細(xì)胞爬滿瓶底時(shí)，更換液體去除組織塊，每3 d更換一次培養(yǎng)基。待貼壁細(xì)胞接近鋪滿瓶底時(shí)，0.5%胰蛋白酶消化，按1：2或1：3比例傳代培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞形貌觀察：將實(shí)驗(yàn)組（PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜）和對(duì)照組（PLGA/MWNTs復(fù)合膜）的樣品置于6孔板內(nèi)，加入DMEM培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)的細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于放有樣品的培養(yǎng)板內(nèi)，在倒置相差顯微鏡下觀察樣本側(cè)壁及周邊細(xì)胞的生長(zhǎng)，在培養(yǎng)48h后，從各組分別取出一塊材料，PBS漂洗3遍，2.5%戊二醛固定過(guò)夜，乙醇梯度脫水，干燥、噴金后掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.7 細(xì)胞增殖情況測(cè)定：將培養(yǎng)的細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于放有樣品的培養(yǎng)板內(nèi)，分別在第 1、3、5、7 天取每組試樣加入 MTT5 mg/mL 溶液40 μL，37℃下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)的上清液，每孔加入420 μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。吸取每孔中液體100 mL到96孔板內(nèi)，492 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度值，記錄結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLGA/MWNTs復(fù)合膜、PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜的SEM觀察：PLGA/MWNTs復(fù)合膜上方有均勻分布的成簇的結(jié)晶礦化物出現(xiàn)，覆蓋復(fù)合膜面積的40%～50%。高倍鏡下，可以看到有的礦化物為小球形；有的為盛開(kāi)的花朵狀。“花朵”中的單個(gè)晶體呈葉片狀，錯(cuò)落有致，相互交織成叢，詳見(jiàn)圖1。

圖1 PLGA/MWNTs復(fù)合膜、PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜的SEM圖注：（a）PLGA/MWNTs復(fù)合膜（×5000）；（b）PLGA/MWNTs復(fù)合膜（×100000；（c）礦化后的 PLGA/MWNTs/HA 復(fù)合膜（×50）；（d）礦化后的 PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜（×500）

2.2 礦化膜的EDX分析采用EDX對(duì)礦化的沉積物進(jìn)行檢測(cè)：沉積物以鈣、磷元素為主，Ca/P=1.58，接近羥基磷灰石的Ca/P理論值1.67，詳見(jiàn)圖2。

2.3 人牙周膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)觀察：細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形，間隙狹窄，緊密排列成束，呈漩渦狀外觀，詳見(jiàn)圖3。

圖2 PLGA/MWNTs復(fù)合膜礦化7 d后礦化物的EDX圖

圖3 組織塊法培養(yǎng)21 d的牙周膜干細(xì)胞的生長(zhǎng)情況（×50）

2.4 細(xì)胞與復(fù)合膜共培養(yǎng)SEM觀察：培養(yǎng)48 h后，在PLGA/MWNTs復(fù)合膜表面，黏附細(xì)胞數(shù)量較少，部分細(xì)胞體呈多邊形，部分細(xì)胞體呈細(xì)長(zhǎng)梭形，面積較小，表明部分細(xì)胞尚未發(fā)生鋪展。在PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜表面，細(xì)胞數(shù)量明顯較PLGA/MWNTs組多，細(xì)胞分布均勻，大部分細(xì)胞己經(jīng)鋪展呈多邊形，部分細(xì)胞黏附于礦化物表面。結(jié)果表明，礦化后的PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜更有利于細(xì)胞的初始黏附與生長(zhǎng)，詳見(jiàn)圖4。

圖4 人牙周膜干細(xì)胞在復(fù)合膜上培養(yǎng)48 h的SEM圖注：（a）PLGA/MWNTs復(fù)合膜；（b）PLGA/MWNTs/HA 復(fù)合膜

2.5 細(xì)胞的增殖活性：兩組細(xì)胞的數(shù)量都隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。第1天、第3天、第5天和第7天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的數(shù)量比對(duì)照組都有顯著的增加，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的速度和活性明顯高于對(duì)照組。這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組磷灰石礦化物增加了復(fù)合膜的親水性和生物活性，因此，也促進(jìn)了牙周膜干細(xì)胞早期的黏附和增殖，詳見(jiàn)圖5。

圖5 牙周膜干細(xì)胞接種于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表面培養(yǎng)7 d的MTT圖

3 討論

本研究通過(guò)仿生礦化法對(duì)利用溶液澆鑄法制得的PLGA/MWNTs復(fù)合膜進(jìn)行仿生礦化，可制備得到PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜。其表面有均勻分布的成簇的結(jié)晶礦化物出現(xiàn)，礦化物以鈣、磷元素為主，Ca/P=1.58。PLGA/MWNTs/HA復(fù)合膜對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的黏附和增殖具有良好的作用。該礦化復(fù)合膜有可能作為牙周引導(dǎo)組織再生膜材料應(yīng)用于牙周組織再生領(lǐng)域。

［1］ Ramseier CA，Duong HY，Schmid E.Natural history of periodontitis［J］.Current Oral Health Reports，2014，1（4）：286-294.

［2］ Kamoi K，Iino M，Ishiguro H.Regeneration therapy for oral disease［J］.Human Cell，2006，19（2）：76-82.

［3］ Pontoriero R，Nyman S，Ericsson I，et al.Guided tissue regeneration in surgically-produced furcation defects.An experimental study in the beagle dog［J］.Journal of Clinical Periodontology，1992，19（3）：159-163.

［4］ Zhang HL.Biomimetic synthesis ofpoly（lactic-co-glycolic acid）/multi-walled carbonnanotubes/apatitecomposite membranes［J］.Express Polymer Letters，2012，6（8）：620-628.

［5］ Li F，F(xiàn)eng QL，Cui FZ，et al.Schubert H.A simple biomimetic method for calcium phosphate coating［J］.Surface and Coatings Technology，2002，154（2）：88-93.

Study on Cell Compatibility of BiomineralizedPLGA/MWNTs/HAGuided Tissue Regeneration Membrane

Zhang Hualin Wang Kairong Ma Hairong
（College of Stomatology，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

Objective To prepare the PLGA/MWNTs/HA guided tissue regeneration membrane by biomimetic mineralization and study its cell biocompatibility.Methods The PLGA/MWNTs composite membrane was prepared by solvent casting method；then，the PLGA/MWNTs composite membrane was immersed in the biomimetic mineralization solution to prepare the PLGA/MWNTs/HA membrane；the human periodontal ligament stem cells were cultured on the PLGA/MWNTs/HA composite membrane.The morphology of the cells was observed by SEM and the proliferation of the cells was analyzed by MTT method.Results The surface of PLGA/MWNTs composite membranewas uniformand dense；after 7 days of mineralization，apatite crystals were formed on the surface of PLGA/MWNTs composite membrane；human periodontal ligament stem cells grew well on the surface of PLGA/MWNTs/HA composite membrane，and the addition of HA crystals was beneficial to cell adhesion and growth.Conclusion The PLGA/MWNTs/HA composite membrane prepared by biomimetic mineralization has good biocompatibility，which is expected to play a role in periodontal guided tissue regeneration.

Biomimetic mineralization；PLGA/MWNTs/HA；Guided tissue regeneration membrane；Cell compatibility

R781.4

A 學(xué)科分類(lèi)代碼： 32044

1001-8131（2017）05-0401-03

寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（NZ14063）

2017-05-18