在線固相萃取-超高效液相色譜-線性離子阱串聯質譜法直接測定水中10種藻類毒素

徐瀟穎 劉 柱 朱炳祺 梁晶晶 陳萬勤 羅金文

(浙江省食品藥品檢驗研究院， 杭州 310052)

在線固相萃取-超高效液相色譜-線性離子阱串聯質譜法直接測定水中10種藻類毒素

徐瀟穎 劉 柱 朱炳祺 梁晶晶 陳萬勤 羅金文*

(浙江省食品藥品檢驗研究院， 杭州 310052)

建立了全自動在線固相萃取-超高效液相色譜-線性離子阱串聯質譜法直接測定水中10種藻類毒素的方法。利用程序實現多次進樣，通過在線固相萃取對藻類毒素進行富集，然后切換六通閥，將富集的目標物沖洗至分析柱進行分離后，進入線性離子阱質譜檢測。10種藻類毒素在相應的濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.99，檢出限在0.0015～0.0050 μg/L之間，3個濃度水平(0.02、0.10和1.00 μg/L)的加標回收率為83.7%～98.5%。結果表明，在線固相萃取極大簡化了前處理過程，線性離子阱串聯質譜法提高了痕量藻類毒素測定的靈敏度，增強子離子掃描(EPI)譜庫的建立為藻類毒素的確證提供保障。本方法適用于水體中多種藻類毒素的快速確證和定量測定。

藻類毒素； 在線固相萃??； 超高效液相色譜-線性離子阱串聯質譜； 水樣

2017-05-27收稿； 2017-08-29接受

本文系浙江省食品藥品監管系統科技計劃項目(No. SP201704)資助

* E-mail: luojw31@163.com

1 引 言

近年來，水體富營養化所導致的水華現象頻頻出現。水體出現富營養化現象時，藻類大量繁殖，同時代謝產生氰毒素類化合物，主要包括為肝毒素、神經毒素和脂多糖內毒素[1]。肝毒素包括微囊藻毒素(MCs)、節球藻毒素(NOD)和柱孢藻毒素(CYN)[2～4]。其中微囊藻毒素由一個環七肽和特殊的芳香族氨基酸側鏈-AD-DA構成，由于環七肽中含有兩個可變氨基酸基團，導致其具有多種異構體，迄今為止被報道的微囊藻毒素已達到100多種[5～7]。MC-LR作為一種最常見的微囊藻毒素，世界衛生組織規定其在水中最高允許量為1 μg/L[8]，我國制定的相關飲用水標準對其的限量為1.0 μg/L[9]。

藻類毒素在水體中極低的含量大大增加了分析難度。在常規的液相色譜(HPLC)檢測方法中，需通過固相萃取(SPE)柱對大體積的樣品進行富集后，才能達到HPLC分析的靈敏度，該方法前處理耗費大量時間，難以實現大批量樣品的快速分析[10,11]，且檢出限較高。為簡化樣品前處理過程，馮桂學等[12]采用全自動在線固相萃取(Online SPE)，實現了樣品的自動化在線處理和測定，節約時間的同時避免了大量有機試劑的接觸；而對于采用HPLC進行測定時存在靈敏度低的問題，研究者多選用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)代替HPLC[13,14]， 如趙起越等[13]采用LC-MS/MS直接進樣，對水中藻類毒素進行測定，檢出限達到0.007～0.047 μg/L。

本研究采用全自動在線固相萃取-超高效液相色譜(Online SPE -UHPLC)系統結合線性離子阱串聯質譜(LIT-MS/MS)進行樣品分析。 通過直接進樣，在Online SPE-UHPLC系統中[15,16]分別實現連續的自動化在線固相萃取和洗脫分離的過程。離子阱(Qtrap)功能是通過最后一級四極桿切換的切換，在保留傳統三重四極桿功能的同時對給定條件的目標離子進行阱集，提高靈敏度[17]。本方法較傳統方法極大簡化了前處理操作，提高了檢測效率，并且降低了檢出限。此外，利用增強子離子掃描(EPI)建立的藻毒素二級譜庫可為痕量檢測提供判定依據，為水體藻類毒素的監管提供科學的依據。

2 實驗部分

2.1儀器與試劑

AB Qtrap5500質譜儀(美國AB Sciex公司)；Ultimate 3000雙三元超高效液相色譜(美國Thermo Fisher公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；XBridge C18Direct Connect HP 色譜柱(30 mm × 2.1 mm, 10 μm)，Oasis HLB Direct Connect HP 色譜柱(30 mm × 2.1 mm, 20 μm)；Waters Cortecs C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm, 2.7 μm)。

甲醇-乙腈(質譜純，德國Merck公司)；甲酸銨、 乙酸銨(分析純，國藥試劑公司)；甲酸(質譜純，美國Sigma Aldrich公司)；微囊藻毒素標準品MC-LY、MC-LW、MC-YR、MC-WR、MC-LA、MC-LF、MC-RR、MC-LR(濃度均為10 μg/mL，北京振翔公司)；CYN、NOD(純度均≥95%，加拿大TRC公司)。

2.2混合標準溶液配制

分別稱取適量CYN和NOD固體標準品，用甲醇溶解，配制5 μg/mL的標準儲備液；分別準確移取適量CYN、NOD標準儲備液和其它8種微囊藻毒素液體標準品，用20%(V/V)甲醇溶液稀釋配制為1 μg/mL的混合標準使用溶液，于18℃下保存。

2.3在線固相萃取高效液相色譜-串聯質譜分析條件

在線固相萃取超高效液相色譜條件：在全自動Online-SPE以及分析系統中均采用甲醇為流動相A，5 mmol/L甲酸銨為流動相B。進樣量400 μL(采用變色龍軟件連續進樣2次實現，每次進樣200 μL)，上樣泵對應在線富集過程流速為0.8 mL/min，分析泵對應目標物在分析柱上的洗脫分離過程流速為0.4 mL/min，柱溫35℃，通過六通閥切換來實現在線富集以及洗脫分離過程的連續進行，梯度程序及閥切換時間表見表1。0～2 min，分析泵進行分析柱平衡，上樣泵通過連續進樣后完成富集過程，比例閥位置于1～2，如圖1； 2 min時，六通閥切換至6～1，對富集柱進行反相洗脫，6 min后六通閥切回初始位置，此過程中分析泵通過改變流動相的比例，對進入分析柱的目標物進行分離，最后流入檢測器。

表1 在線固相萃取梯度洗脫程序及閥切換時間

Table 1 Gradient elution program and valve-switching time of online solid phase extraction (SPE)

上樣泵Loadingpump時間Time(min)流動相BMobilephaseB(%)分析泵Analyticalpump時間Time(min)流動相BMobilephaseB(%)閥切換Valveswitching時間Time(min)閥位置Valveposition0．01000．0800．01～22．01002．0802．06～13．1104．0556．01～26．0106．0556．11008．04520．010011．54512．02514．02516．08020．080

圖1 全自動在線固相萃取流路示意圖Fig.1 Flow schematic illustration of fully automated SPE

質譜分析條件：電噴霧正離子模式，噴霧電壓4.5 kV，霧化器壓力(GS1)40 psi，輔助器壓力(GS2)40 psi，離子溫度450℃，氣簾氣壓力(CUR)35 psi；優化后各目標物的母離子、子離子、碰撞能量和錐孔電壓的多反應監測(MRM)模式相關參數見表2。

采用MRM-信息依賴性采集(IDA)-EPI模式檢測，建立在線EPI譜庫定性分析，IDA參數：啟動EPI閾值為5000 CPS，采用動態背景扣除模式；EPI參數：掃描速度10000 Da/s，掃描范圍m/z100～1100，采用動態填充阱集時間，且不大于1 ms，EPI碰撞能量：(35 ± 15)eV。

表2 藻類毒素的質譜分析條件

Table 2 ESI-MS/MS parameters for algal toxins analysis

化合物Compounds母離子Parention(m/z)定量子離子Quantitativeproduction(m/z)碰撞能Collisionenergy(eV)錐孔電壓Conevoltage(V)定性子離子Qualitativeproduction(m/z)碰撞能Collisionenergy(eV)錐孔電壓Conevoltage(V)MC?LR498．5135．11730482．34342MC?RR519．9135．13628103．24028MC?YR523．2135．11554213．03442MC?LW1025．5517．23511375．43511MC?LF986．5478．53412375．14730MC?LY1002．6494．33432375．14520MC?LA910．5375．14623776．43224MC?WR534．9135．01826103．15524CYN416．1194．34933176．14830NOD825．4227．26320135．26127MC?XZreferstodifferentkindsofmicrocystine．Here，MCreferstomicrocystine．AsforX，Lisleucine，Risarginine，Yistyrosine，Wistryp?tophan．AsforZ，Risarginine，Wistryptophan，Aisalanine．CYN，cylindrospermopsin．NOD，nodularin

3 結果與討論

3.1固相萃取色譜柱的選擇

在線固相萃取過程中，富集柱的正確選擇至關重要。理想的富集柱需要在低有機相條件下實現基質中目標物的有效捕集，而在閥切換啟動洗脫程序后，富集柱中的目標物可以迅速被洗脫，并進入分析柱，而不存在因難以洗脫而導致的拖尾等問題。在對微囊藻毒素進行大體積水樣離線富集過程中多采用C18和HLB固相萃取柱[18～21]，故在本實驗中選用HLB和C18富集柱進行比較，結果表明，在最終實驗條件下，以100%水相富集2 min時，C18柱和HLB柱對目標物的捕集回收率分別為92.5%～97.8%和95.8%～96.9%，均能滿足固相萃取過程對目標化合物的富集要求。在反沖過程中，隨著有機相比例逐漸升高，因為HLB trap柱對藻類毒素的保留效果優于C18柱，易造成目標物的色譜峰拖尾，定量積分不準確。故在本實驗中選用XBridge C18Direct Connect HP作為富集柱。

3.2流動相選擇

實驗考慮閥切換后，富集柱中的目標物以及流動相最終進入質譜進行定性與定量檢測，所以需選用揮發性較好的流動相，流動相B分別采用0.1%甲酸-水和5 mmol/L甲酸銨代替液相色譜分析藻類毒素時常用的K2PO4(pH 2.5)進行比較分析。結果表明，5 mmol/L甲酸銨所獲得的目標物峰形及響應優于0.1%甲酸-水，主要是由于酸性緩沖溶液提高離子強度，有助于改善峰形。在甲醇和乙腈中，流動相A選用甲醇，主要是因為乙腈洗脫能力強，會在反沖過程中使擴散于富集柱中的目標物出現拖尾現象。而在線固相萃取條件中，采用100%水相，10種藻類毒素可在XBridge C18Direct Connect HP 富集柱上得到良好富集，隨有機相升高至40%，目標物逐漸被洗脫，流動相中緩沖鹽含量以及酸堿度對洗脫效果未造成顯著影響。本實驗中，為防止富集與分離時流動相的不同對分離過程的影響，在線固相萃取時，液相色譜的流動相與分析過程中的液相流動相一致。

3.3質譜掃描模式的建立

3.3.1MRM條件優化分別利用大氣壓化學電離源(APCI)、電噴霧離子源(ESI)正、負離子檢測模式(ESI+、ESI)對10種藻類毒素進行考察。結果表明，使用APCI時未見信號響應；使用ESI時信號極低，其中MC-LW、MC-WA未見信號；而使用ESI+模式時，10種藻類毒素響應均顯著優于ESI模式。文獻[22,23]中采用ESI+模式，主要是因為MCs的極性結構使其易于形成正離子，其中MC-LR、MC-YR、MC-RR離子容易結合兩個H+，并在m/z498.5[M + 2H]2+、519.9 [M + 2H]2+、523.2 [M + 2H]2+產生較高響應，因此選擇上述離子作為母離子，得到的10種藻類毒素的MRM色譜圖見圖2 。

圖2 10種藻類毒素的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 10 kinds of algal toxins

3.3.2MRM-IDA-EPI掃描模式和EPI譜庫的建立由于藻類毒素在水體中含量低，采用MRM法進行分析時，質譜絕對響應值較低，目標分析物容易受到基質干擾的影響，定性離子和定量離子豐度比率易超出容許范圍，影響定性判定，造成假陽性或假陰性的情況。而Qtrap可將滿足MRM模式的目標物的離子進行阱集，經過累積的離子在一定碰撞能下獲得更多二級碎片離子，隨后進入檢測器掃描獲得EPI譜圖。對增強二級碎片離子的EPI掃描，可以在LC-MS/MS的基礎上進一步提高檢測靈敏度，通過一次進樣可得到用于定量的MRM色譜圖和用于定性的增強二級全掃描質譜圖，更有利于痕量目標化合物的準確定性分析。

采用優化后的MRM條件進行EPI促發，啟動閾值為1000 CPS，選擇動態背景扣除模式，掃描速度為10000 Da/s，設置的掃描范圍為m/z100～1100 Da，動態阱集時間不大于1 ms，EPI碰撞能量為35 eV，對0.5 ng/mL混合標準溶液進行分析，結果見圖3。在該碰撞能下除NOD外均能獲得包含各目標物特征碎片的信息，而NOD則需將碰撞能提高至50 eV才能獲得足夠的信息碎片。將獲得的子離子增強二級質譜圖編輯譜庫，補充對應的目標物名稱、相對分子量、CAS號以及化學結構圖，在進行樣品中痕量藻類毒素測定時，可利用MRM-IDA-EPI掃描模式獲取樣品中疑似目標物的EPI譜圖進行定性譜庫檢索，特別是在檢出限濃度附近進行質譜庫檢索時，其匹配度均大于85%這一功能是線性離子阱所特有的。

3.4方法學驗證

3.4.1標準曲線、檢出限及定量限取混合標準使用液, 用初始比例流動相進行逐級稀釋，得到濃度在0.005～8.0 μg/L范圍內的系列標準溶液，以目標物的峰面積y為縱坐標，質量濃度x(μg/L)為橫坐標進行線性擬合，并以色譜峰信噪比(S/N)≥3計算方法檢出限(LOD)，S/N≥10確定方法定量

限(LOQ)，結果見表3，各藻類毒素在線性濃度范圍內呈良好線性關系，相關系數>0.99，本方法中各藻類毒素的檢出限為0.0015～0.0050 μg/L,遠低于現行國家標準規定的0.1 μg/L[9]，優于同類文獻中的結果[13]。Online SPE-UHPLC-MS/MS-QTRAP方法靈敏度高，可以滿足對水中痕量藻毒素檢測的要求。

表3 10種藻類毒素的標準曲線、線性范圍、相關系數及檢出限

Table 3 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients and LODs for 10 kinds of algal toxins

化合物名稱Compounds線性范圍Linearrange(μg/L)回歸方程Regressionequation相關系數Correlationcoefficient(R2)檢出限LOD(μg/L)定量限LOQ(μg/L)MC?LR0．005～2．0y=561298x-2990．99930．00150．0060MC?RR0．005～2．0y=1200800x-68070．99950．00150．0060MC?YR0．005～2．0y=896169x-81060．99900．00150．0060MC?LW0．02～8．0y=2247x+4600．99870．00500．015MC?LF0．01～4．0y=2084x+8610．99620．00250．0080MC?LY0．01～4．0y=12787x-5990．99940．00250．0080MC?LA0．01～4．0y=105488x-41750．99210．00300．010MC?WR0．01～4．0y=219298x-66490．99080．00300．010CYN0．02～8．0y=882x+14680．99790．00500．015NOD0．02～8．0y=97125x+6070．99450．00500．015

3.4.2方法的精密度及準確性在陰性礦泉水水樣中加入混合標準溶液，加標水平為0.02、0.10和1.00 μg/L，按本實驗優化方法對每個水平樣品平行測定6次，計算回收率及相對標準偏差(RSD)，結果見表4。在0.02 μg/L的加標水平下，10種藻類毒素的回收率在83.7%～90.2%，相對標準偏差2.8%～4.7%；在0.10 μg/L的加標水平下的回收率在90.5%～97.5%，相對標準偏差2.1%～3.2%；在1.00 μg/L的加標水平下的回收率在92.8%～98.5%，相對標準偏差1.8%～3.2%。結果表明，本方法的準確度和精密度良好，滿足水中藻類毒素的測定。

表4 10種藻類毒素的回收率及精密度(n=6)

Table 4 Recoveries and RSDs of 10 kinds of algal toxins(n=6)

化合物Compounds加標水平Spiked0．02μg/L回收率Recovery(%)RSD(%)加標水平Spiked0．10μg/L回收率Recovery(%)RSD(%)加標水平Spiked1．00μg/L回收率Recovery(%)RSD(%)MC?LR88．63．697．52．198．51．8MC?RR89．23．196．82．897．72．1MC?YR88．72．896．72．998．12．2MC?LW90．23．393．13．294．23．0MC?LF84．54．692．63．694．41．7MC?LY87．73．190．52．993．62．2MC?LA85．14．792．62．892．82．9MC?WR83．74．593．13．293．53．2CYN84．63．991．12．895．43．2NOD90．43．395．52．593．61．9

3.5實際樣品分析

于2017年5月15～17日，對浙江省內包括杭州、湖州、金華地區不同地點的表層水體進行采樣，采樣時間集中在15～17點，采集29份湖泊水樣、 11份河流水樣，此外收集20份市售預包裝飲用水(包括礦泉水、純凈水、蒸餾水)，使用本方法進行測定，結果見表5。 20個品牌市售飲用水中均未檢出藻類毒素，根據飲用水中MC-LR、NOD、CYN均不得超過1.0 μg/L安全濃度的規定[8,24]，所測定樣品均未超標。

表5 10種藻類毒素在表層水樣中的測定結果

Table 5 Determination of 10 kinds of algal toxins in surface water samples

采樣點SamplesitesMC?RR(μg/L)MC?LR(μg/L)MC?YR(μg/L)MC?LA(μg/L)MC?LY(μg/L)MC?LW(μg/L)MC?WR(μg/L)MC?LF(μg/L)NOD(μg/L)CYN(μg/L)Lake?40．00760．00960．0028/0．0090//0．0100．016/Lake?10/0．0021/0．0013//////Lake?240．00540．0077/////0．0096//Lake?250．00680．0120．0083///////River?9/0．0052////////

4 結 論

本研究建立了Online SPE-UHPLC-MS/MS-QTRAP分析水樣中10種藻類毒素的方法。 Online SPE的應用使前處理過程實現了自動化，縮短了前處理的時間，減少了有機試劑使用量；利用UHPLC-MS/MS-QTRAP建立了10種藻類毒素的EPI質譜庫，實現了MRM定量檢測和在線EPI譜庫定性確證的雙重功能，很好地解決了傳統串聯四極桿制譜對低濃度樣品定性的問題。Online SPE與UHPLC-MS/MS-QTRAP聯用進行水樣中痕量藻類毒素測定時，與現有標準和已報道的方法相比，成本更低、分析時間更短、靈敏度更高，檢出限可達到0.0015～0.0050 μg/L之間，為藻類毒素的準確定性和定量分析提供了新方法。

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XU Xiao-Ying, LIU Zhu, ZHU Bing-Qi, LIANG Jing-Jing , CHEN Wan-Qin, LUO Jin-Wen*
(ZhejiangInstituteforFoodandDrugControl,Hangzhou310052,China)

An online solid phase extraction (online-SPE) combined with ultra high performance liquid chromatography-quadrupole linear ion trap mass spectrometry (UHPLC-MS/MS-Qtrap) was established for the simultaneous identification and determination of 10 kinds of algal toxins in water samples. Multiple injections of water samples were controlled by a preset program, and the target analytes were enriched by trap column. The six-way valve was switched subsequently, and the algal toxins in the trap column were back-flushed to the analytical column for separation and analysis. The results showed that the online SPE significantly simplified pretreatment process, and the linear ion trap tandem mass spectrometry improved the sensitivity of the determination. Moreover, the establishment of enhanced product ion (EPI) scan library provided evidence for the confirmation of algal toxins. The 10 kinds of algal toxins showed a good linear relationship with correlation coefficientR2>0.99. The limits of detection (LOD) were 0.0015-0.0050 μg/L. The mean recoveries at three spiked levels of 0.02, 0.1, 1.0 μg/L were from 83.7% to 98.5%. The method was suitable for the rapid confirmation and quantitative determination of various algal toxins in water.

Algal toxins; Online-solid phase extraction; Ultra performance liquid chromatography-quadrupole linear ion trap mass spectrometry; Water

27 May 2017; accepted 29 August 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.170339