人乳頭瘤病毒31和33亞型L1基因導入水稻及轉基因植株的鑒定

孟鳳麗，張改平，劉運超，陳玉梅，王聚財，祁艷華，冉云偉，王愛萍

1.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；2.河南省農業科學院 動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002

人乳頭瘤病毒31和33亞型L1基因導入水稻及轉基因植株的鑒定

孟鳳麗1，張改平2，劉運超2，陳玉梅1，王聚財2，祁艷華1，冉云偉1，王愛萍1

1.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；2.河南省農業科學院 動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002

目的：結合水稻胚乳生物反應器的優點，將人乳頭瘤病毒（HPV）31、33亞型的L1蛋白編碼基因導入水稻，構建HPV31 L1、HPV33 L1植物表達載體，最終實現其在水稻胚乳表達系統中的表達。方法：利用生物信息學方法分析并優化合成HPV31及HPV33 L1蛋白編碼基因，將其重組于中間載體pMP3和植物表達載體pCAMBIA1300中，分別構建植物雙元表達載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1，采用遺傳轉化法經根癌農桿菌介導轉化水稻TP309種子的愈傷組織，經共培養、潮霉素篩選和分化再生，獲得潮霉素抗性植株。結果和結論：構建了HPV31 L1、HPV33 L1的植物表達載體，經根癌農桿菌介導轉化水稻TP309種子的愈傷組織，獲得轉基因植株。

人乳頭瘤病毒L1基因；根癌農桿菌；水稻胚乳表達系統；遺傳轉化；植物表達載體

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在全球女性癌癥死亡率中居第2位，僅次于乳腺癌[1-2]，全球每年約有50萬新發病例，約20萬死于宮頸癌。宮頸癌與生殖道人乳頭瘤病毒（human papil?lomavirus，HPV）感染有密切關系，99.7％以上的宮頸癌病例伴有HPV感染[3]。HPV屬于乳頭瘤病毒科、乳頭瘤空泡病毒A屬，是一類雙鏈小分子DNA病毒，直徑45～55nm，衣殼呈二十面體立體對稱，含72個衣殼亞單位，沒有囊膜。該病毒有嚴格的種屬特異性，主要感染人的皮膚和黏膜組織，引起相應部位上皮組織的增生性病變[4]。近年來，HPV感染呈明顯增多趨勢，因此HPV預防性疫苗的研究成為防控宮頸癌研究的熱點[5-6]。重組表達的HPV L1蛋白可在體外自組裝成病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs），并誘發機體產生保護性免疫應答[7-8]，可有效預防HPV感染。

轉基因植物表達系統是一種高效、廉價的制備外源蛋白的表達系統，在生物制藥、疫苗等研究領域應用廣泛。植物的轉基因操作主要有基因槍法、PEG法、電極法等[9]。雙子葉植物的轉基因主要采用農桿菌介導的方法。Mason等利用煙草和馬鈴薯表達了乙型肝炎病毒抗原和諾沃克病毒HBsAg抗原成分[10-11]；Warzecha等利用馬鈴薯表達了HPV11-L1-NLS L1蛋白[12]，并證實所表達的病毒衣殼蛋白能組裝成VLPs。鑒于農桿菌介導的基因轉移是雙子葉植物中運用廣泛而有效的遺傳轉化系統，因此有許多學者嘗試將這一體系用于水稻的基因轉化[14]。Yang等利用水稻表達了重組人血清白蛋白OsrHSA[13]，Huang等則利用水稻表達了人乳鐵蛋白[15]。

在本研究中，我們利用生物信息學方法分析HPV31、HPV33不同變異株的L1基因序列，再根據水稻密碼子偏愛性和mRNA結構優化并合成HPV31和HPV33的L1基因，分別克隆于植物表達載體，通過根癌農桿菌介導的轉化方法將其轉入水稻種子愈傷組織，獲得表達HPV31 L1、HPV33 L1蛋白的轉基因水稻植株，為開發HPV31 L1、HPV33 L1疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻種子TP309、根癌農桿菌EHA105、中間載體pMP3、植物表達載體pCAMBIA1300由武漢禾元科技股份有限生物公司提供；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態細胞購于TaKaRa公司；質粒pUC57-HPV31 L1及pUC57-HPV33 L1由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。各種工具酶購自NEB公司；PCR beads購自Amersham Phar?macia公司；頭孢霉素（Cef）、羧芐青霉素（Cb）、卡那霉素（Kan）、乙酰丁香酮（AS）和植物激素6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、激動素（KT）等購自Biosharp公司；潮霉素（Hyg）購自Roche公司；質粒提取試劑盒、切膠回收試劑盒購自Axygen公司。

研究過程所用培養基按文獻方法配制[16-17]。MS為基本培養基，各培養基附加蔗糖30g/L、瓊脂7.5g/L，pH值調至5.8。種子發芽培養基為1/2MS；種子誘導培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；共培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；選擇培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+Cb 400 mg/L；生根培養基為1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+Cb 200 mg/L。

1.2 目的基因及引物的設計與合成

根據大腸桿菌密碼子的偏愛性優化HPV31及HPV33的L1蛋白編碼區基因，委托上海生工生物工程有限公司合成，合成的基因分別命名為pUC57-HPV31 L1和pUC57-HPV33 L1。在合成基因的5'端和3'端分別引入MlyⅠ、XhoⅠ酶切位點，并設計合成相應的鑒定用引物（表1）。

1.3 構建HPV31、HPV33 L1中間載體

將優化合成的pUC57-HPV31 L1和pUC57-HPV33 L1基因用XhoⅠ和MlyⅠ雙酶切，獲得HPV L1蛋白編碼區基因序列；將pMP3載體用XhoⅠ和NaeⅠ雙酶切，獲得含有啟動子Gt13a、信號肽序列SP的序列；將上述雙酶切的序列用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，連接產物分別轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，構建含有啟動子Gt13a、信號肽序列SP的中間載體pMP3-HPV31 L1和pMP3-HPV33 L1，經菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定后用于構建植物表達載體。

1.4 構建HPV31、HPV33 L1重組植物表達載體載體

將構建的中間載體和含有潮霉素抗性基因的植物表達載體pCAMBIA1300用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，切膠回收目的基因，用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，構建含有水稻特異性啟動Gt13a、信號肽序列SP、潮霉素抗性基因及HPV31 L1和HPV33 L1基因的水稻胚乳特異性表達載體，經菌液PCR鑒定和雙酶切及測序鑒定，將構建的重組表達質粒命名為pCAM?BIA1300-pMP3-HPV-31L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1。

1.5 重組植物表達載體轉入根癌農桿菌EHA105

分別用電穿孔法將構建的水稻胚乳特異性表達載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1導入根癌農桿菌EHA105感受態細胞，涂于含鏈霉素（100 mg/L）及卡那霉素（50 mg/L）的YEB選擇培養基，經PCR及酶切鑒定后的陽性菌落用于植物轉化。

1.6 水稻的遺傳轉化

選取飽滿、大小一致、新鮮的水稻種子置于37℃恒溫箱中1～2d；在無菌條件下先后用75％乙醇對水稻種子消毒30s、20％次氯酸鈉消毒（加入1～2滴吐溫 20）10min，無菌水沖洗 4～5次，用無菌濾紙吸干水分后，接種于種子誘導培養基中，于26℃光照預培養10d；挑取淡黃色的生長狀態良好的愈傷組織，置于含重組質粒的根癌農桿菌EHA105（D600nm=0.6～0.8）侵染液中侵染30～45min，侵染期間須不時搖動；侵染結束后，棄菌液，用無菌濾紙吸干殘留菌液，接種于共培養基上，于25℃暗培養3～4d；用無菌水洗去未侵入愈傷組織的農桿菌，然后用加了頭孢霉素的無菌水抑制農桿菌的生長，用無菌濾紙吸干水分后轉入篩選培養基，26℃暗培養30d；挑選新長出來的朝下與篩選培養基表面接觸的嫩黃色凝結成塊的愈傷組織，將其轉入分化培養基，于26℃光照條件下培養30d；將分化成的苗轉入生根培養基，于26℃光照條件下生根培養30d；將水稻苗移栽至土壤中，溫室培養。

表1 所用引物列表

1.7 轉基因水稻的PCR檢測

剪取200 mg新鮮葉片，65℃干燥后研磨成粉末，用CTAB法提取總DNA，干燥后溶于100μL TE中。取1μL總DNA作為模板，用HPV31、HPV33 L1上下游引物進行PCR擴增（擴增條件：95℃預變性 10min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃90s，30個循環；72℃延伸 10min），PCR 產物經1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果

2.1 中間載體的構建與鑒定

中間表達載體pMP3-HPV-31-L1和pMP3-HPV-33-L1含有啟動子Gt13a、信號肽序列SP及L1蛋白編碼區基因（圖1A），經化學轉化法導入大腸桿菌感受態細胞DH5α，其菌液PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在約458、445bp處可見特異性條帶，大小與預期相符（圖1B）。提取質粒用HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切，酶切產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，可見2條與預期相符的條帶（圖1C）。測序（序列未示）證實HPV31 L1和HPV33 L1編碼區基因成功插入中間載體pMP3。

2.2 植物表達載體的構建與鑒定

植物表達載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1含有水稻特異性啟動Gt13a、信號肽序列SP、潮霉素抗性基因及L1蛋白編碼區基因（圖2A），經化學轉化法導入大腸桿菌DH5α感受態細胞，其菌液PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在約458、445bp處可見特異性條帶，大小與預期相符（圖2 B）。提取質粒用HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切，有2條與預期大小相符的條帶（圖2C）。測序（序列未示）證實HPV31 L1和HPV33 L1編碼區基因成功插入植物載體pCAMBIA1300。

2.3 植物表達載體轉入根癌農桿菌EHA105

將構建的水稻特異性表達載體用電穿孔法[12]轉入根癌農桿菌EHA105，挑取單克隆，菌液PCR可擴增到HPV31、HPV33 L1基因片段（圖3），證實植物表達載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1已導入根癌農桿菌，與根癌農桿菌中的Ti質粒共同構成植物表達雙元載體。

2.4 轉基因水稻植株的PCR鑒定

分別用含有pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1的根癌農桿菌EHA105浸染水稻種子愈傷組織，經篩選、分化、生根培養，移栽至土壤中，采取葉片提取其基因組DNA進行PCR鑒定，結果如圖4、5所示。經T0代HPV31葉片PCR鑒定，共篩選出35株HPV31 L1基因（458bp左右有目的條帶）PCR陽性的轉基因水稻植株；經T0代HPV33葉片PCR鑒定，共篩選出38株HPV33 L1基因（445bp左右有目的條帶）PCR陽性的轉基因水稻植株。

圖1 中間載體pMP3-HPV31 L1、pMP3-HPV 33 L1的構建及鑒定

3 討論

圖2 植物表達載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV31 L1、pCAMBIA1300-pMP3-HPV33 L1的構建及鑒定

HPV感染與宮頸癌的發生和發展密切相關，因此研制預防性疫苗以防止HPV的感染極為重要。HPV預防性疫苗主要是基于L1蛋白自組裝或L1、L2蛋白共同組裝形成的VLP疫苗[7-8]。研究證實，這類VLP疫苗能誘發機體產生持久的保護性免疫反應，從而阻斷病毒入侵宿主細胞[18-19]。用酵母表達系統或桿狀病毒表達系統獲得的L1 VLP疫苗已獲批進入市場，但這種疫苗的生產成本較高，使其在發展中國家的推廣應用受到限制。因此，嘗試發展新的廉價表達系統生產疫苗仍是目前研究的熱點。

近年來，轉基因植物作為生物反應器生產藥用生物大分子的研究在不斷深入，利用轉基因植物生產HPV VLP疫苗是一條可探索的途徑。水稻是分子生物學研究的模式作物之一，遺傳轉化已成為水稻分子生物學研究和基因工程的必需手段。He等應用水稻胚乳表達系統表達的人血清白蛋白OsrHSA產量可達2.75g/kg，占水稻可溶性蛋白總量的10.58％，且純度高達99.9％[13]；An等應用水稻胚乳表達系統表達的堿性成纖維細胞生長因子OsrbFGF產量可達8.33 mg/kg，純度高達95％[20]，表明水稻胚乳表達系統作為一種新的植物表達系統可表達外源重組蛋白。

我們構建的植物重組表達載體pCAM?BIA1300-pMP3-HPV-31L1及pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1具有完整的植物表達調控元件，如組成型啟動子Gt13a、植物篩選標志及左右邊界序列，同時含有目的蛋白HPV31 L1或HPV33 L1的編碼區基因，可與農桿菌中的Ti輔助質粒構成植物雙元表達載體，為HPV31或HPV33 L1基因轉入水稻胚乳奠定了基礎。隨后我們用轉化的含有HPV31、HPV33 L1基因的重組表達菌株分別浸染水稻種子愈傷組織，最終得到了含有目的基因的水稻植株，說明我們構建的植物雙元表達載體適用于根癌農桿菌介導的植物轉化，為HPV31或HPV33亞型L1蛋白在水稻胚乳表達系統中的表達奠定了基礎。

圖3 根癌農桿菌EHA105菌液PCR鑒定

圖4 T0代HPV31轉基因水稻植株葉片DNA的PCR鑒定

圖5 T0代HPV33轉基因水稻植株葉片DNA的PCR鑒定

[1] zur Hausen H.Papillomaviruses in anogenital cancer as a model to understand the role of viruses in hu?man cancers[J].Cancer Res,1989,49（17）:4677-4681.

[2] Parkin D M,Bray F.Chapter 2:the burden of HPV related cancers[J].Vaccine,2006,24（S3）:S11-S25.

[3] Clifford G M,Smith J S,Plummer M,et al.Human papillomavirus types in invasive cervical cancer world?wide:a meta-analysis[J].Br J Cancer,2003,88（1）:63-73.

[4] Munger K,Baldwin A,Edwards K M,et al.Mecha?nismsofhuman papillomavirus-induced oncogenesis[J].J Virol,2004,789（21）:11451-11460.

[5] Osen W,Jochmus I,Muller M,et al.Immunization against human papillomavirus infection and associated neoplasia[J].J Clin Virol,2000,19（1-2）:75-78.

[6] Lehtinen M,Malm C,Apter D,et al.Preventive vac?cines againstpapillomavirus and cervix cancerwill soon enterclinicalpractice[J].Lakartidningen,2003,100（43）:3408-3412.

[7] De Bruijn M L,Greenstone H L,Vermeulen H,et al.L12specific protection from tumorchallenge elicited by HPV16 virus2likeparticles[J].Virology,1998,250（2）:371-376.

[8] Schiller J T,Lowy D R.Papillomavirus-like particle vaccines[J].J Natl Cancer Inst Monog,2001,15（28）:50-54.

[9] 劉明華,張景六,洪孟民,等.轉基因AC/DS導入水稻花藥懸浮細胞并再生植株[J].植物生理學報,1995,21（2）:195-205.

[10]Mason H S,Lam D M,Arntzen C J.Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89（24）:11745-11749.

[11]Mason H S,Ball J M,Shi J J,et al.Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and itsoralimmunogenicity in mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93（11）:5335-5340.

[12]Warzecha H,Mason H S,Lane C,et al.Oral immuno?genicity ofhuman papillomavirus-like particles ex?pressed in potato[J].J Virol,2003,77（16）:8702-8711.

[13]He Yang,Ning Tingting,Xie Tingting,et al.Largescale production of functional human serum albumin from transgenic rice seeds[J].Proc NatlAcad Sci USA,2011,108（47）:19078-19083.

[14]劉巧泉,張景六,洪孟民,等.根癌農桿菌介導的水稻高效轉化系統的建立[J].植物生理學報,1998,24（3）:259-271.

[15]Huang N,Bethell D,Card C,et al.Bioactive recombi?nant human lactoferrin,derived from rice,stimulates mammalian cell growth[J].In Vitro Cell Dev Biol An?im,2008,44（10）:464-471.

[16]Sambrook J,Fribsch E F,Maniatis T.Molecular clon?ing:a laboratory mannal[M].2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:895-909.

[17]王關林,方宏筠.植物基因工程原理和方法[M].北京:科學出版社,1998:446-464.

[18]Sun X,Si L,Cao Z,et al.Immune response to plas?mid DNA encoding HPV16-L1 protein[J].Chin Med J（Engl）,2000,113（3）:277-280.

[19]Rocha-Zavaleta L,Alejandre J E,Garcia-Carranca A.Parenteral and oral immunization with a plasmid DNA expressing the human papillomavirus 16-L1 gene in?duces systemic and mucosal antibodies and cytotoxic Tlymphocyte responses[J].J Med Virol,2002,66（1）:86-95.

[20]An Na,Ou Jiquan,Jiang Daiming,et al.Expression ofa functionalrecombinanthuman basic fibroblast growth factor from transgenic rice seeds[J].Int J Mol Sci,2013,14（2）:3556-3567.

Construction and Identification of HPV31 L1 and HPV33 L1 Transgenic Rice Plants

MENG Feng-Li1,ZHANG Gai-Ping2,LIU Yun-Chao2,CHEN Yu-Mei1,WANG Ju-Cai2,QI Yan-Hua1,RAN Yun-Wei1,WANG Ai-Ping1*
1.School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001;2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002;China
*Corresponding author,E-mail:pingaw@126.com

Objective:Based on the advantages of rice endosperm bioreactor,we constructed human papillomavi?rus（HPV） 31 L1 and HPV33 L1 plant expression vectors by introducing the HPV31 L1,HPV33 L1 genes into rice,for expressing the HPV31 L1,HPV33 L1 protein in rice endosperm expression system.Methods:The encod?ing genes of HPV31 and HPV33 L1 protein were synthesized by using bioinformatics analysis and optimization,and subcloned into the intermediate vector pMP3 and expression vector pCAMBIA1300.The binary expression vec?tors pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1 and pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1 were transformated into TP309 rice seed callus via Agrobacterium-mediated method.Some hygromycin-resistance plants were obtained by antibiotic screening and calli regenerated.Results&Conclusion:The HPV31 and HPV33 L1 genes were introduced into rice via Agrobacterium-mediated transformation by using the rice mature embryo-derived callus as explants.

human papillomavirus L1 gene;Agrobacterium tumefaciens;rice endospermcells bioreactor;genetic transformation;plant expression vector

Q943.2

A

1009-0002（2017）04-0465-06

2017-01-12

河南省高校科技創新團隊和創新人才支持計劃（14HASTIT027）

孟鳳麗（1990- ），女，碩士，（E-mail）2298273675@qq.com

王愛萍，（E-mail）pingaw@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.012