骨形態發生蛋白2表達載體的構建及生物學功能鑒定

姥偉，代建寧，景調平，鄧彩霞，楊海旭

解放軍第五醫院 a.骨科中心；b.麻醉手術科；c.高壓氧；寧夏 銀川 750004

骨形態發生蛋白2表達載體的構建及生物學功能鑒定

姥偉a，代建寧a，景調平b，鄧彩霞c，楊海旭a

解放軍第五醫院 a.骨科中心；b.麻醉手術科；c.高壓氧；寧夏 銀川 750004

目的：從真核細胞中獲得骨形態發生蛋白2（BMP2）編碼基因，構建其真核表達載體并進行鑒定。方法：提取人HeLa細胞總RNA，經反轉錄后用特異性引物擴增BMP2編碼區，連接至pcDNA3.1載體，篩選陽性克隆并進行功能學鑒定。結果：反轉錄PCR獲得1100bp的片段，經分子克隆后鑒定序列與BMP2一致，并且在真核細胞中能夠誘導Smad1/5/8的磷酸化。結論：構建了真核表達載體pcDNA3.1-BMP2并驗證了其體內功能，為后續探討BMP2在骨發育中的作用機制打下基礎。

骨形態發生蛋白2；真核表達載體；Smad1/5/8

骨形態發生蛋白（bone morphogenetic pro?teins，BMP）家族成員有20種，在結構上相對保守，在骨骼的發育、再生和修復過程中發揮重要作用[1-2]。其中，對BMP2的研究較多。BMP2通過自分泌或旁分泌的方式刺激間充質干細胞向成骨細胞的分化，并進一步促進成骨細胞分化為骨細胞[3]。BMP2可以激活細胞內諸多發育相關信號通路的活化，如PI3K/Akt通路、Smad通路、WNT通路等。因此，充分明確BMP2的功能及其在骨形成中的作用機制，對于骨相關疾病的研究和治療具有重要意義[4-6]。我們利用重組DNA技術構建了BMP2真核表達載體，為后續的功能研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HeLa細胞和HepG2細胞購自中國科學院細胞庫；大腸桿菌TOP10、限制性內切酶及連接酶購自TaKaRa公司；pcDNA3.1表達質粒和脂質體2000購自Invitrogen公司；BMP2抗體和磷酸化Smad1/5/8抗體購自Cell Signaling Technology公司；β-actin購自博士德公司。

1.2 pcDNA3.1-BMP2重組質粒的構建及鑒定

提取HeLa細胞總RNA并反轉錄成cDNA，根據BMP2的編碼序列設計引物進行PCR擴增。上游引物為5'-GAATTCATGGTGGCCGGGACCCGC-3'，酶切位點為EcoRⅠ；下游引物為5'-CTCGAGC?TAGCGACACCCACAACC-3'，酶切位點為 XhoⅠ。PCR反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30個循環；72℃充分延伸10min。PCR產物經電泳、膠回收，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收酶切產物，連接至pcDNA3.1質粒反應過夜，將連接產物轉化大腸桿菌感受態TOP10，待單克隆長至肉眼可見菌落時轉接至含氨芐西林的LB培養基，擴增宿主菌并進行酶切鑒定，對陽性克隆進行測序。

1.3 細胞轉染實驗

將HeLa細胞和HepG2細胞接種至6孔板，待細胞密度長至約60％時，取4μg pcDNA3.1質粒（陰性對照）或4μg pcDNA3.1-BMP2重組質粒，分別與10μL脂質體2000混勻，轉染至細胞，24h后收取細胞，分別進行實時定量PCR實驗和Western印跡實驗。

1.4 實時定量PCR

用TRIzol試劑盒分別提取HeLa細胞和HepG2細胞pcDNA3.1、pcDNA3.1-BMP2過表達實驗組樣品的總RNA，RT-PCR反轉錄合成cDNA，通過實時定量PCR實驗分別檢測各組中BMP2（上游引物：5'-ACTACCAGAAACGAGTGGGAA-3'，下游引物：5'-GCATCTGTTCTCGGAAAACCT-3'）和內參照GAPDH（上游引物：5'-ACCCAGAA GACTGTGGATGG-3'，下游引物：5'-TCTAGACGG CAGGTCAGGTC-3'）mRNA的表達量。PCR擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性10s，55℃退火10s，72℃延伸 10s，30個循環。PCR 反應結束后，將所得循環數按照公式進行數據分析。

1.5 Western印跡

分別收取陰性對照、過表達pcDNA3.1-BMP2的HeLa細胞和HepG2細胞，用預冷的PBS溶液洗滌細胞，加入RIPA蛋白裂解液，超聲波裂解細胞提取蛋白；離心后收取蛋白上清，通過BCA定量法對各組蛋白進行定量；按照一定體積加入5×上樣緩沖液，于沸水中10min，保證蛋白充分變性；取30μg蛋白樣品進行蛋白電泳實驗（SDSPAGE），濃縮膠電壓為120 V，分離膠電壓為160 V；電泳完成后，將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用5％脫脂奶粉封閉1h；分別用BMP2抗體（1∶1000稀釋）、磷酸化Smad1/5/8抗體（1∶1000稀釋）和β-actin抗體（1∶500稀釋）與NC膜于4℃孵育過夜，次日用含0.5％Tween-20的TBST洗 3次，5min/次，再分別加入1∶5000的HRP標記的二抗，室溫搖床孵育1h，TBST洗3次，5min/次，ECL發光檢測，膠片顯色，分析結果。以β-actin為內參照。

2 結果

2.1 pcDNA3.1-BMP2重組質粒的構建及鑒定

以HeLa細胞的cDNA為模板，PCR擴增出BMP2編碼區域，將BMP2和pcDNA3.1分別經EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后進行連接，轉化大腸桿菌感受態TOP10，挑取克隆提取質粒，酶切鑒定，發現1號和2號克隆均可在1000～2000bp位置切得條帶，此為BMP2編碼區基因序列（圖1）。經測序鑒定正確后準備進行后續實驗。

2.2 BMP2 mRNA表達水平鑒定

為了驗證BMP2是否能在真核細胞中正確轉錄翻譯，將pcDNA3.1-BMP2和陰性對照pcDNA3.1空載體瞬時轉染HeLa細胞或HepG2細胞。通過實時定量PCR實驗發現，與陰性對照相比，轉染pcDNA3.1-BMP2質粒的細胞中，BMP2的mRNA水平顯著升高，提示pcDNA3.1-BMP2質粒能夠在真核細胞中表達（圖2）。

2.3 BMP2蛋白表達及Smad1/5/8磷酸化水平鑒定

Smad1/5/8復合體是BMP2下游作用的信號分子，在BMP2高表達時，Smad1/5/8的磷酸化水平顯著增加。為了驗證pcDNA3.1-BMP2重組質粒是否在細胞中發揮作用，我們通過Western印跡實驗進行了驗證。結果顯示，在HeLa和HepG2細胞中，轉染pcDNA3.1-BMP2重組質粒均可顯著誘導BMP2蛋白水平的表達，同時Smad1/5/8的磷酸化水平也顯著增加（圖3）。這表明pcDNA3.1-BMP2重組質粒在細胞內可成功表達并在體內發揮功能。

圖1 重組質粒pcDNA3.1-BMP2的EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖2 實時定量PCR檢測BMP2 mRNA表達

圖3 Western印跡檢測BMP2和磷酸化Smad1/5/8表達水平

3 討論

生長因子在誘導干細胞向骨細胞發育的過程中扮演重要角色，目前已知BMP、轉化生長因子β（transforming grouth factor β，TGF-β）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纖維素樣生長因子（fibroblast growth factor，FGF）在骨分化方面具有重要作用[7]。自1988年發現BMP2可以誘導骨和軟骨形成，BMP家族成員就已成為骨骼生物學研究的重要內容[8]。BMP是TGF-β超家族成員，包含20多種亞型，通過調控BMP信號通路，可以改善骨骼質量，治療骨生長相關疾病，修復骨和關節的損傷[9]。

BMP2作為BMP家族中的一種亞型，在調節間充質干細胞和成骨細胞向骨細胞分化的過程中具有重要意義[10]。許多研究表明，BMP2表達降低或基因突變，可導致骨折、骨密度下降等骨相關疾病的發生。細胞膜表面分布著BMP受體，包括Ⅰ型受體（BMPRIA、BMPRIB和ACVRI）和Ⅱ型受體（BMPRII、ActRIIA和 ActRIIB）[11-12]。在BMP2刺激下，Ⅱ型受體被識別和激活，進而募集Ⅰ型受體，Ⅰ型受體可活化下游R-Smad（包括Smad1、Smad5、Smad8）[13-14]。R-Smad與Smad4結合進入細胞，調控骨發育相關基因的轉錄[15]。此外，BMP2還可以通過激活WNT/β-Catenin、MAPK/ERK等非經典的通路調節關鍵轉錄因子的表達，促進成軟骨、成骨信號，如軟骨分化轉錄因子Sox9、成骨分化轉錄因子Runx2[16-17]。

本實驗構建了BMP2的真核表達載體，并利用細胞學實驗對其功能進行了初步驗證，BMP2的過表達顯著促進了R-Smad的磷酸化水平。上述結果為后續研究BMP2在骨發育中對干細胞分化的功能以及探討相關機制打下了重要基礎。

[1] Lahiri S,Roy A,Baby S M,et al.Oxygen sensing in the body[J].Prog Biophys Mol Biol,2006,91（3）:249-286.

[2] Anusuya G S,Kandasamy M,Jacob Raja S A,et al.Bone morphogenetic proteins: signaling periodontal bone regeneration and repair[J].J Pharm Bioallied Sci,2016,8（Suppl 1）:S39-S41.

[3] Salazar V S,Gamer L W,Rosen V.BMP signalling in skeletaldevelopment,disease and repair[J].Nat Rev Endocrinol,2016,12（4）:203-221.

[4] Liu D D,Zhang J C,Zhang Q,et al.TGF-β/BMP signaling pathway is involved in cerium-promoted os?teogenic differentiation of mesenchymal stem cells[J].J Cell Biochem,2013,114（5）:1105-1114.

[5] Hou X,Shen Y,Zhang C,et al.A specific oligodeoxy?nucleotide promotesthe differentiation ofosteoblasts via ERK and p38 MAPK pathways[J].Int J Mol Sci,2012,13（7）:7902-7914.

[6] Gu Y X,Du J,Si M S,et al.The roles of PI3K/Akt signaling pathway in regulating MC3T3-E1 preosteo?blastproliferation and differentiation on SLA and SLActive titanium surfaces[J].J Biomed Mater Res A,2013,101（3）:748-754.

[7] Estes B T,Diekman B O,Gimble J M,et al.Isola?tion of adipose-derived stem cells and their induction to a chondrogenic phenotype[J].Nat Protoc,2010,5（7）:1294-1311.

[8] Wozney J M,Rosen V,Celeste A J,et al.Novel regu?lators of bone formation:molecular clones and activi?ties[J].Science,1988,242（4885）:1528-1534.

[9] Lo K W,Ulery B D,Ashe K M,et al.Studies of bone morphogenetic protein-based surgicalrepair[J].Adv Drug Deliv Rev,2012,64（12）:1277-1291.

[10]Kaewsrichan J,Wongwitwichot P,Chandarajoti K,et al.Sequential induction of marrow stromal cellsby FGF2 and BMP2 improves their growth and differentia?tion potential in vivo[J].Arch Oral Biol,2011,56（1）:90-101.

[11]Greenwald J,Groppe J,Gray P,et al.The BMP7/Act?RIIextracellulardomain complex provides new in?sights into the cooperative nature of receptor assembly[J].Mol Cell,2003,11（3）:605-617.

[12]Wu H.Assembly of post-receptor signaling complexes for the tumor necrosis factor receptor superfamily[J].Adv Protein Chem,2004,68:225-279.

[13]Matsumoto Y,Otsuka F,Hino J,et al.Bone morphoge?netic protein-3b（BMP-3b）inhibits osteoblast differenti?ation via Smad2/3 pathway by counteracting Smad1/5/8 signaling[J].Mol Cell Endocrinol,2012,350（1）:78-86.

[14]Fuentealba L C,Eivers E,Ikeda A,et al.Integrating patterning signals:Wnt/GSK3 regulates the duration of the BMP/Smad1 signal[J].Cell,2007,131（5）:980-993.

[15]Chen J,Shi Z D,Ji X,et al.Enhanced osteogenesis of human mesenchymal stem cells by periodic heat shock in self-assembling peptide hydrogel[J].Tissue Eng Part A,2013,19（5-6）:716-728.

[16]Drissi M H,Li X,Sheu T J,et al.Runx2/Cbfa1 stim?ulation by retinoic acid is potentiated by BMP2 signal?ing through interaction with Smad1 on the collagen X promoter in chondrocytes[J].J Cell Biochem,2003,90（6）:1287-1298.

[17]Liao J,Hu N,Zhou N,et al.Sox9 potentiates BMP2-induced chondrogenic differentiation and inhibits BMP2-induced osteogenic differentiation[J].PLoS One,2014,9（2）:e89025.

Construction and BiologicalFunction Characterization of BMP2 Expression Plasmid

LAO Weia,DAI Jian-Ninga,JING Diao-Pingb,DENG Cai-Xiac,YANG Hai-Xua*
a.Department of Orthopedics;b.Department of Anesthesiology;c.Department of Hyperbaric Oxygen;the 5th Hos?pital of PLA,Yinchuan 750004,China
*Corresponding author,E-mail:bioyhx@126.com

Objective:To clone bone morphogenetic protein 2（BMP2） full length gene from mammal cells,and then construct and characterize the mammal expression vector.Methods:The total RNA was extracted from HeLa cells.Amplify BMP2 full length cDNA through RT-PCR with a pair of specific gene primers.Clone it into pcD?NA3.1 vector.The positive clone was selected and sequenced.Verify the biological function of BMP2 in mammal cells.Results:The 1100bp specific fragment was obtained by RT-PCR.After the molecular cloning and sequenc?ing,BMP2 over-expressed in mammal cells can induce the phosphorylation of Smad1/5/8.Conclusion:We con?stucted pcDNA3.1-BMP2 and confirmed its function.These data provide a basis of the mechanistic study of BMP2 function in bone development.

bone morphogenetic protein 2;mammal expression vector;Smad1/5/8

Q78;Q24

A

1009-0002（2017）04-0506-04

2016-12-26

姥偉（1979- ），男，碩士，主治醫師，（E-mail）mulaowei@126.com

楊海旭，（E-mail）bioyhx@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.020