離子注入突變藻株在城市污水中的產油特性

涂仁杰,金文標,韓松芳,周 旭,陳洪一

?

離子注入突變藻株在城市污水中的產油特性

涂仁杰,金文標*,韓松芳,周 旭,陳洪一

(哈爾濱工業大學深圳研究生院,深圳微藻生物能源工程實驗室,廣東深圳 518055)

考察了蛋白核小球藻出發株及其離子注入突變株在實際城市污水中的生長情況和產脂性能,以及對污染物的去除能力.結果表明,突變藻株在污水中油脂產率為32.5mg/(L·d),相比于出發株分別顯著提高了23.81%(<0.05).通過對生成的脂肪酸甲酯進行氣相色譜分析,結果顯示離子注入誘變并未改變小球藻脂肪酸成分,但提升了單不飽和脂肪酸的含量,有利于改善所得生物柴油的品質.培養結束后出水水質可達到一級A排放標準,相較于出發株,突變株對污水中污染物具有更好的降解效果.利用掃描電鏡觀察可以發現出發株和突變株藻細胞形態差異較小,元素含量分析發現突變株H/C值相比出發株有所下降,系統發育樹構建說明突變株與出發株屬于同種變異.

離子注入；城市污水；小球藻；油脂產量

隨著能源危機與環境污染的加劇,微藻生物柴油越來越受到研究者的關注[1-3].微藻培養是其中一個重要環節,在微藻培養過程中,利用淡水培養需消耗大量淡水資源,有悖于當前淡水資源緊缺的背景.同時,營養物質的投加進一步提高了微藻的培養成本[4-5].微藻生長需要消耗大量無機氮、磷等營養物質,城市生活污水中又有大量氮、磷需要去除,利用城市污水培養微藻可以將二者有機結合起來.微藻通過光合作用能夠產生較高濃度的O2,可用于污水處理廠曝氣池曝氣,為活性污泥中微生物的呼吸作用提供O2,而微生物的呼吸作用又能夠產生較高濃度的CO2,可為微藻生長提供無機碳源[6].研究表明利用微藻可以凈化污水,污水也可以用來培養微藻[7-9].

由于城市污水成分復雜,含有大量的微生物,微藻與細菌之間存在著互生、拮抗等復雜的相互關系[10].不同藻種對環境需求不同,對污水的耐受性也不同[11-12].隨著微藻生物能源的快速發展,迫切需要利用技術手段,對自然環境中篩選分離的產油藻種,進行誘變處理以獲取品質更加優良的藻種.因此,前期通過離子注入法對蛋白核小球藻進行了誘變,本研究將通過考察小球藻出發株及其離子注入突變株在實際城市污水中的生長情況和產脂性能,以及對污染物的去除效果,以確定突變藻株對實際污水的適應性,為利用城市污水規模化培養能源微藻的研究與技術開發提供實驗基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗藻種及培養

實驗所用微藻為課題組前期經離子注入法誘變篩選的蛋白核小球藻誘變株(CVM)[13],藻種采用BG11培養基[14]進行傳代培養保藏.實驗所用城市污水取自深圳大學城市政污水井,經潛污泵抽取后使用,污水水質如下:COD、NH4+-N、TN和TP的濃度分別為140~200mg/L、20~ 40mg/L、20~45mg/L和5.0~6.5mg/L.以BG11培養基培養處于對數生長期的蛋白核小球藻種子液,接種于600mL城市污水中,于氣泡柱式光生物反應器(直徑5cm、高50cm、容積約為1L)培養,以相應未加小球藻的城市污水為空白對照,使扣除空白后藻液初始吸光度680=0.1,于培養溫度為(25±1)℃,光照強度為100mmol/(m2·s).光暗比為12h:12h條件下,連續通氣培養(空氣流速為120mL/min,由底部通入).取培養達到穩定期的藻液測定藻細胞的干重和油脂產量.每組實驗各設3個平行.

1.2 微藻干重的測定

接種初期藻液的干重為0(g/L),培養一定時間(d)后,取穩定期藻液10mL經0.45μm微孔濾膜(1)過濾、洗滌,于105℃下烘至恒重(2/g),微藻干重DW (g/(L·d))的計算公式如下:

DW=[(2-1)/0.01-0]/

1.3 微藻油脂產量與脂肪酸組成的測定

微藻油脂提取采用氯仿甲醇共溶劑提取法[15].待提取結束后,收集氯仿相,轉移至預稱重的錫紙盤中,待有機溶劑揮發完全后,于80℃烘箱中烘至恒重,前后重量差即微藻油脂產量,微藻細胞油脂含量為油脂產量與微藻干重的百分比.

微藻脂肪酸分析,首先對提取的油脂進行甲酯化[16],將5mL藻液中脂肪酸轉化成相對應的脂肪酸甲酯.采用賽里安456-GC氣相色譜儀進行分析,色譜柱為BR-2560柱,100m′0.25mm(內徑)′0.20μm(膜厚),FID檢測器,分流方式進樣,分流比為30:1,進樣量為1μL.

1.4 常規水質指標測定

污水水質采用國標法[17]測定,取微藻培養結束后的藻液于8000r/min離心10min,收集上清液測定.污水中COD、NH4+-N、TN和TP的分別按照GB 11914-89、GB 7479-87、GB 11894-89和GB 11893-89進行測定[18-21].

1.5 藻細胞的掃描電鏡觀察

樣品前處理使用0.1mol/L磷酸緩沖液離心漂洗3次.1%鋨酸固定90min,0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗離心漂洗3次,0.2μm微孔濾膜過濾.酒精梯度脫水,在30%、50%、70%、80%、100%依次脫水,其中100%酒精2次,每次10min.乙酸異戊脂置換,50%1次,100%2次.Eiko公司XD-1型二氧化碳臨界點干燥器干燥,Eiko公司IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜,JEOL公司JSM-6390LV掃描電鏡觀察.

1.6 數據分析方法

數據采用統計軟件SPSS21.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD法進行統計檢驗(<0.05).

2 結果與討論

2.1 突變藻株在污水中的性能考察

2.1.1 突變藻株在污水中的生長情況 將突變株和出發株按照藻液初始吸光度680=0.1接種到城市污水中,每天取樣測定扣除空白后藻液的680以監測藻細胞生長情況(圖1).從圖1可知,小球藻出發株和突變株在城市污水中的生長符合典型的微生物生長曲線.從第1d開始進入對數生長期,第6d進入穩定期生長階段,穩定期持續4d,第9d開始呈現下降趨勢.突變株的比生長速率為0.26,680最高可達2.2,而出發株的比生長速率為0.2,680最高可達1.7.可見,通過離子注入誘變可以提高小球藻在城市污水中的生長速率.但由于實際污水水質的不穩定性,小球藻在不同批次污水中生長情況不盡相同,因此,用實際污水培養小球藻時,選擇收集培養達到穩定期的藻液進行后續實驗.

2.1.2 突變藻株在污水中的產脂情況 相同培養條件下,取穩定期的藻液測其微藻生物質和油脂產率,并計算得到油脂含量,如圖2所示.從圖2中可以看出,穩定期生物質產量和油脂產率分別為109.5mg/(L·d)和32.5mg/(L·d),相比于出發株分別顯著提高了35.47%和23.81% (<0.05),油脂含量略有降低,但無顯著性差異.更快的生長速率和更高的油脂產率,是利用微藻生產生物柴油的重要要求.結果說明離子注入誘變可以提高小球藻對污水適應性以及產油能力.

圖1 出發株和突變株在城市污水中的生長情況

圖2 出發株和突變株在城市污水中的產脂情況

微藻的油脂產量是判定藻種作為生物柴油原料優劣的重要指標,微藻的油脂產量由干重和微藻油脂含量共同決定.在適宜生長的環境條件下,微藻會大量繁殖并積累數目可觀的生物量,此時油脂積累量相對較低,僅占生物量干重的5%~ 20%.在不利或脅迫環境下,微藻的油脂含量顯著升高,可占生物量干重的20%~50%.許多微藻在受到環境條件脅迫時,會減緩甚至停止細胞分裂,同時加速油脂或其他次級代謝物的合成與積累以應對脅迫環境.在脅迫環境下,油脂的合成可能是微藻應對環境逆境的一種自我保護機制.從本質上講,微藻生物量增加和油脂合成是相互競爭光合作用所產生的能量、還原力以及中間代謝物的兩個過程[22].結果中突變藻株生物量顯著上升,雖然油脂含量略有降低,但最終油脂產量是上升的,可以為生物柴油的制備提供更多原料.此外,微藻生物量越高,藻液濃度越高,有利于藻體采收,可以降低微藻收獲成本.因此,通過離子注入誘變促進微藻產脂這一思路是可行的.

表1 出發株和突變株脂肪酸分析

注:nd-未檢測出.

利用氣相色譜儀分析污水中小球藻出發株和突變株脂肪酸甲酯的組成,以進一步確定二者的油脂品質,結果如表1所示.由表1可知,小球藻出發株和突變株的脂肪酸組成均以C16:0、C18:0、C18:2和C18:3為主,為綠藻中常見脂肪酸[23-24].研究表明,適合制備生物柴油的原料應含有較多C16~C18脂肪酸[25-26].突變株中總飽和脂肪酸的比例低于出發株,而單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量高于出發株.高品位的生物柴油應含有較多的單不飽和脂肪酸,以改善其十六烷值、低溫流動性、氧化安定性、運動粘度等性能[27-29].可見,突變藻株具備制備高品位生物柴油的潛質.

2.1.3 突變藻株對污染物去除能力考察 微藻培養結束后取適量藻液,離心后測上清液中COD、NH4+-N、TN和TP的濃度,結果如表2所示.由表2可以看出,出發株和突變株都能將污水中的COD、NH4+-N、TN和TP降解到符合 (GB18918-2002)一級A標準[30], 而且突變株對污水中污染物降解效果更好.由于培養過程中水環境呈弱堿性, 部分氨氮變成氨氣,在吹脫作用下從水中去除,導致培養結束后已檢測不到.

表2 城市污水培養微藻前后水質

2.2 突變藻株藻細胞掃描電鏡和元素分析

2.2.1 掃描電鏡觀察 利用掃描電鏡觀察藻細胞的形態差異,結果如圖3所示.

(a)出發株

(b)突變株

圖3 出發株和突變株表觀結構對比

Fig.3 Apparent structure comparison of wild strain and mutant strain

由圖3可以看出,突變株和出發株的細胞形態差異較小,但突變株藻細胞更接近球體.對比藻細胞胞外物質的情況,可以發現出發株藻細胞之間黏附著許多不定型物質,導致多個藻細胞聚集在一起.而突變株胞外的不定型物質較少,多以單個細胞形式存在,有利于細胞與環境營養物質的接觸吸收.

2.2.2 元素含量分析 相同條件下培養至穩定期后,將藻液離心烘干制成藻粉,測定微藻細胞的元素成分,結果見表3.由表3可以看出,突變株和出發株在N、C、H元素百分比含量上有顯著性差異(<0.05).突變株的氮元素含量降低,可能是由于藻體油脂積累較多導致蛋白質合成較少.另外,分析藻株的H/C值發現,出發株的H/C值為1.83,而突變株的H/C值為1.75.突變株H/C值相比出發株有所下降,且H/C值小于2,推斷是因為突變株中不飽和度增加,與前述突變株中不飽和脂肪酸增加的結果相一致.

表3 出發株和突變株元素含量分析

2.3 突變藻株的分子生物學鑒定

2.3.1 藻種DNA提取結果 用DNA試劑盒分別提取突變株和出發株的總DNA,利用Nanodrop 2000檢測DNA濃度和純度,結果如表4所示,突變株和出發株提取的DNA濃度合格.凝膠電泳結果如圖4所示,提取的DNA條帶較清晰,表明總DNA 提取質量較好,可以用于PCR 擴增.

表4 總DNA濃度和純度檢測結果

圖4 出發株和突變株的DNA凝膠電泳

2.3.2 18S rDNA基因序列的克隆 以小球藻基因組DNA 為模板,PCR 擴增18S rDNA 基因序列,得到的PCR 產物,電泳結果如圖5所示. PCR 產物只出現一條明亮主帶,表明PCR 效果較好,其大小為1 700bp 左右.

圖5 PCR擴增小球藻18S rDNA基因片段

2.3.3 系統發育樹構建 將GenBank中獲得相似度最高的序列與測序獲得序列結合,利用MEGA 5.10構建系統發育樹,構建鄰位N-J tree, Replicate設定為1000.18S克隆序列的系統發育樹如圖6所示.突變株(CVM)和出發株(CVW)在發育樹上的位置很接近,表明親緣關系很近,節點上的Bootstrap檢驗值為100(>95),說明構建進化樹的可信度很高,而且突變株與出發株屬于同種變異.

圖6 系統發育樹構建

3 結論

3.1 離子注入誘變可以提高小球藻在城市污水中的生長速率,小球藻突變株在污水中的適應性良好,油脂產率為32.5mg/(L·d),相比于出發株顯著提高了23.81% (<0.05).

3.2 突變藻株中總飽和脂肪酸的比例低于出發株,而單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量高于出發株,適宜作為制備生物柴油的原料.培養結束后污水中的COD、NH4+-N、TN和TP符合 (GB18918-2002)一級A標準, 而且突變株對污水中污染物降解效果更好.

3.3 掃描電鏡結果顯示突變株和出發株的細胞形態差異較小,但突變株藻細胞更接近球體.而且突變株藻細胞多以單個形式存在,有利于細胞與環境營養物質的接觸吸收.元素含量分析發現突變株的H/C值相比出發株有所下降,且H/C值小于2,說明藻株中不飽和碳氫鍵增加.突變株與出發株在系統發育樹上的位置很接近,表明親緣關系很近,節點上的Bootstrap檢驗值為100(>95),說明突變株與出發株屬于同種變異.

[1] Chisti Y. Constraints to commercialization of algal fuels [J]. Journal of Biotechnology, 2013,167(3):201-214.

[2] Han S F, Jin W B, Tu R J, et al. Biofuel production from microalgae as feedstock: current status and potential [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2015,35(2):255-268.

[3] Abomohra A E, Jin W B, Tu R J, et al. Microalgal biomass production as a sustainable feedstock for biodiesel: current status andperspectives [J]. Renewable & Sustainable Energy Reviews, 2016,64(64):596-606.

[4] Yang J, Xu M, Zhang M X, et al. Life-cycle analysis on biodiesel production from microalgae: water footprint and nutrients balance [J]. Bioresource Technology, 2011,102:159-165.

[5] Morales-Amaral M d M, Gómez-Serrano C, Acién F G, et al. Production of microalgae using centrate from anaerobic digestion as the nutrient source [J]. Algal Research, 2015,9:297-305.

[6] 巫小丹,阮榕生,王 輝,等.菌藻共生系統處理廢水研究現狀及發展前景[J]. 環境工程, 2014,3:35-36.

[7] Ramsundar P, Guldhe A, Singh P, et al. Assessment of municipal wastewaters at various stages of treatment process as potential growth media forunder different modes of cultivation [J]. Bioresource Technology, 2017,227:82-92.

[8] Mahapatra D M, Chanakya H N, Ramachandra T V. Bioremediation and lipid synthesis through mixotrophic algal consortia in municipal wastewater [J]. Bioresource Technology, 2014,168:142-150.

[9] Ryu B G, Kim E J, Kim H S, et al. Simultaneous treatment of municipal wastewater and biodiesel production by cultivation ofwith indigenous wastewater bacteria [J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2014,19(2):201-210.

[10] Mu?oz R, Guieysse B. Algal-bacterial processes for the treatment of hazardous contaminants: a review [J]. Water Research, 2006, 40:2799-2815.

[11] Abdelaziz A E M, Leite G B, Belhaj M A, et al. Screening microalgae native to Quebec for wastewater treatment and biodiesel production [J]. Bioresource Technology, 2014,157: 140-148.

[12] Massimi R, Kirkwood A E. Screening microalgae isolated from urban storm and wastewater systems as feedstock for biofuel [J]. PeerJ, 2016,4:e2396.

[13] Tu R J, Jin W B, Wang M, et al. Improving of lipid productivity of the biodiesel promising green microalgavia low-energy ion implantation [J]. Journal of Applied Phycology, 2016,28(4):2159-2166.

[14] Stainier R Y, Kunisawa R, Mandel M, et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order) [J]. Bacteriology Reviews, 1971,35(2):171-205.

[15] Folch J, Lees M, Stanley G H S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues [J]. Journal of Biological Chemistry, 1957,226:497-509.

[16] Kaczmarzyk D, Fulda M. Fatty acid activation in cyanobacteria mediated by acyl-acyl carrier protein synthetase enables fatty acid recycling [J]. Plant Physiology, 2010,152(3):1598-1610.

[17] 國家環?？偩?水和廢水監測分析方法 [M]. 北京:中國環境科學出版社, 2002.

[18] GB 11914-89 水質化學需氧量的測定重鉻酸鹽法[S].

[19] GB 7479-87 水質銨的測定納氏試劑比色法[S].

[20] GB 11894-89 水質總氮的測定堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[S].

[21] GB 11893-89 水質總磷的測定鉬酸銨分光光度法[S].

[22] Sharma K K, Schuhmann H, Schenk P M. High lipid induction in microalgae for biodiesel production [J]. Energies, 2012,5(5): 1532-1553.

[23] 劉林林,黃旭雄,危立坤,等.15株微藻對豬場養殖污水中氮磷的凈化及其細胞營養分析 [J]. 環境科學學報, 2014,34(8):1986- 1994.

[24] Vidyashankar S, VenuGopal K S, Swarnalatha G V, et al. Characterization of fatty acids and hydrocarbons of chlorophycean microalgae towards their use as biofuel source [J]. Biomass & Bioenergy, 2015,77:75-91.

[25] Song M, Pei H, Hu W, et al. Evaluation of the potential of 10microalgal strains for biodiesel production [J]. Bioresource Technology, 2013,141:245-251.

[26] Ma Y, Wang Z, Yu C, et al. Evaluation of the potential of 9strains for biodiesel production [J]. Bioresource Technology, 2014,167:503-509.

[27] Stansell G R, Gray V M, Sym S D. Microalgal fatty acid composition: implications for biodiesel quality [J]. Journal of Applied Phycology, 2012,24(4):791-801.

[28] 方利國,林 璟.脂肪酸甲酯對生物柴油十六烷值影響的研究[J]. 化工新型材料, 2008,36(11):94-96.

[29] Hoekman S K, Broch A, Robbins C, et al. Review of biodiesel composition, properties, and speci?cations [J]. Renewable & Sustainable Energy Reviews, 2012,16:143–169.

[30] GB18918-2002 城鎮污水處理廠污染物排放標準一級A標準 [S].

The characteristics of lipid production ofmutant by ion implantation through municipal wastewater cultivation.

TU Ren-jie, JIN Wen-biao*, HAN Song-fang, ZHOU Xu, CHEN Hong-yi

(Shenzhen Engineering Laboratory of Microalgal Bioenergy, Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, China)., 2017,37(10)：3735~3740

The growth and lipid productivity of originaland its ion implantation mutant strains were studied. The results showed that the lipid productivity of the mutant strain was 32.5mg/(L·d), 23.81% higher than that of the original strain. According to the fatty acid methyl ester analysis by gas chromatography, ion implantation did not change the composition of fatty acid, but enhanced the content of monounsaturated fatty acids, which was conducive to the enhancement of biodiesel quality. After cultivation, the effluent quality was also found to reach the emission standard of first level A, and the mutant showed better degradation ability than the original strain. Phylogenetic tree showed that the mutant and the original strains were belonged to interspecific variation.

ion implantation；municipal wastewater；；lipid production

X172

A

1000-6923(2017)10-3735-06

涂仁杰(1985-),男,湖北漢川人,哈爾濱工業大學深圳研究生院博士研究生,主要從事微藻生物質能源與污水資源化研究.發表論文8篇.

2017-03-29

深圳市科技計劃資助項目(JCYJ20150529114024234)

* 責任作者, 教授, jinwb@hit.edu.cn