高通量測序分析腸易激綜合征患者和健康人腸道菌群差異*

1.汕頭大學醫學院 （廣東 汕頭 515041）

2.北京大學深圳醫院消化內科 （廣東 深圳 518036）

楊莉麗1,2 王成文2 鄒 傲2

高通量測序分析腸易激綜合征患者和健康人腸道菌群差異*

1.汕頭大學醫學院 （廣東 汕頭 515041）

2.北京大學深圳醫院消化內科 （廣東 深圳 518036）

楊莉麗1,2王成文2鄒 傲2

目的通過高通量測序方法分析腸易激綜合征患者(Irritable Bowel Syndrome,IBS)和健康人腸道菌群差異。方法采用Illumima系統MiSeq平臺對正常組和IBS組糞便進行16S rRNA測序。結果IBS患者的腸道菌群多樣性無顯著變化。在門水平上，Firmicutes豐度顯著增加(P＜0.01)，Bacteroidete的豐度和Bacteroidetes/Firmicutes的比值下降。在科水平上，正常組和IBS組糞便腸道菌群中檢測到Cryomorphaceae、Erysipelotrichaceae、Campylobacteraceae和Fibrobacteraceae，且豐度變化具有顯著差異(P＜0.05)。結論IBS患者和健康人相比，腸道菌群多樣性未見明顯差異。但某些細菌菌種存在顯著差異。

腸易激綜合征；腸道菌群；高通量測序；16S rRNA

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一組以腹痛、腹脹、排便習慣和糞便性狀改變為主要臨床表現，癥狀可持續存在或間歇發作，是最常見的腸道功能紊亂性疾病[1]。近年來，許多研究發現IBS患者存在腸道菌群的變化，并認為IBS的發生發展與腸道菌群變化有關。本文通過高通量測序細菌16SrRNA基因序列技術對IBS患者腸道菌群分布進行分析并觀察其變化情況。

1 資料和方法

1.1 對象2015年10月至2016年10月在北京大學深圳醫院消化科門診就診的IBS患者10例，采用羅馬Ⅲ診斷標準[2]，排除消化道器質性病變。其中男5例，女5例，年齡18～61歲。正常組為10例北京大學深圳醫院體檢健康者。全部病例無畏寒發熱史、胃腸道手術史，無慢性小腸或結腸感染史、慢性肝病、糖尿病、甲亢病史，近3月來未使用過抗生素。

1.2 方法

1.2.1 腸道菌群DNA的提?。菏褂脽o菌的離心管收集糞便樣本50g，并用腸道菌群細菌基因組提取試劑盒提取制備糞便樣本中微生物總DNA，具體方法按說明書進行。

1.2.2 16S rDNA的擴增與測序：用分光光度計對提取的全基因組DNA進行質檢，質檢合格的細菌進行16S rDNA的V4可變區進行擴增，擴增條件為：94℃變性，30s；50℃退火，30s；72℃延伸，30s。引物為：正向5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'，反向5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'，PCR產物經均一化處理后建庫，PCR體系為25μL，測序平臺為Illumima系統MiSeq。

1.3 統計學分析使用SPSS16.0軟件對菌群多樣性進行t檢驗，使用mothur軟件中metastats命令進行組間統計學差異分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 16S rRNA基因測序分析對測序后的結果進行分析，正常組和IBS組的有效序列分別為(67246±19467)和(55564±9892)，優化后分別得到(67457±19497)和(55742±9888)條優質序列。在相似度為97%條件下，應用生物信息學軟件對序列進行操作單元聚類，共獲得47656個OTU代表序列，其中綱水平4763個，科水平47038個，屬水平46201個。經繪制Observed species指數稀釋曲線、Chao指數稀釋曲線，大部分測序的樣品接近平臺期。分析兩組樣品的測序結果，發現它們的覆蓋率均＞97%(P＞0.05)，表示測序深度已基本覆蓋到糞便樣本中絕大多數物種，見表1。

表1 正常組和IBS組測得的序列數及覆蓋率

表2 FPE作用前后腸道菌科水平變化

表2 FPE作用前后腸道菌科水平變化

科水平 正常組 IBS組 P值Cryomorphaceae 0.06±0.05 0.01±0.01 0.00 Erysipelotrichaceae 0.04±0.02 0.01±0.01 0.02 Campylobacteraceae 0.06±0.05 0.01±0.01 0.00 Fibrobacteraceae 0.07±0.07 0.01±0.02 0.00

2.2 腸道菌群結構分析對測序序列與16S rDNA數據庫進行比對，分析結果發現樣本中細菌絕大多數由Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria組成，正常組和IBS組Firmicutes序列分別為30467條和39850條，占總菌的比例為67%和73%；Bacteroidetes序列分別為7675條和6203條，占總菌的比例為18%和13%；Proteobacteria序列分別為5462條和6492條，占總菌的比例為11%和13%。統計分析發現與正常組相比，IBS組樣品的Firmicutes豐度顯著增加(P＜0.01)，Bacteroidete的豐度和Bacteroidetes/Firmicutes的比值也明顯下降(P＞0.01)，見圖1。

對高通量測序數據進一步深入分析，分析結果發現正常組和IBS組腸道菌群主要的科均為Alcaligenaceae、Lachnospiraceae、Rikenellaceae和Ruminococcaceae，分別占總數的8.5%、41.1.1%、8.1%、23.8%和8.1%、42.4%、7.0%、25.1%。統計分析發現正常組和IBS組有4個科Cryomorphaceae、Erysipelotrichaceae、Campylobacteraceae、和Fibrobacteraceae的豐度發生顯著變化，具有統計學意義，見表3。

3 討 論

近年來，國內外大量研究發現IBS與腸道菌群紊亂密切相關，很多研究結果指出腸道菌群失調可能是IBS發病的重要機制。與正常人相比，IBS患者腸道內擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌等組成異常,其厚壁門與擬桿菌門比值比正常組高2倍之多[3]。Jalanka-Tuovinen等通過phylogenetic microarray和qPCR實驗研究了IBS和正常人的糞便菌群組成，發現患者糞便中的擬桿菌門是正常人的12倍，而對于非培養的梭狀芽孢桿菌，正常組則是處理組的35倍[4]。這些研究結果提示IBS患者腸道內菌群與正常人相比具有較大差異。

本研究通過高通量測序方法，取得正常組和IBS患者的糞便樣品中微生物的結構和豐度，并分析IBS患者腸道菌種的變化。結果顯示，腸道微生物主要由Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacterias構成。在IBS患者中，Firmicutes豐度顯著增加(P＜0.01)，Bacteroidete的豐度和Bacteroidetes/Firmicutes的比值也明顯下降(P＞0.01)。Bacteroidetes與Firmicutes比值是腸道微生態平衡、腸道健康的重要指標，與國外Rajilic-Stojanovic M等的研究結果一致[5]。此外，對腸道菌群科水平進一步的研究，分析發現正常人組和IBS組在Cryomorphaceae、Erysipelotrichaceae、Campylobacteraceae、和Fibrobacteraceae4個科的豐度變化明顯差異，具有統計學意義。Cryomorphaceae屬于擬桿菌門，在人體腸道內的豐富程度與高脂飲食、體育鍛煉等生活有關[6]。本研究在IBS組中Erysipelotrichaceae明顯下降，Erysipelotrichaceae減少可導致IBS的發生[7]。Campylobacteraceae屬于變形菌門，與飲食習慣和身體營養狀況有關[8]，Fibrobacteraceae常在等多種動物的腸道中檢出，如食草類動物：牛、羊，Fibrobacteraceae與內臟神經高敏感性有關[9]。本研究結果提示IBS患者和健康人相比，菌群多樣性未見明顯差異。但某些細菌菌種存在顯著差異。Campylobacteraceae、Cryomorphaceae、Erysipelotrichaceae和Fibrobacteraceae這4科，可能在IBS的診斷和治療中具有積極作用。

因本研究樣本量相對較少，故未對IBS亞型進行分組研究，IBS亞型對腸道微生物也有一定影響，因此腸道菌群對IBS發病影響的具體機制仍需進一步研究。

[1] DrossmanDA.The functional gastrointestinal disorders and the Rome III process[J].Gastroenterology,2006,130(5)∶377-390.

[2] Drossman DA,Corrazziari E,Delvaux M,et a1.Rome Ⅲ∶The functional gastrointestinal disorders[J].Gastroenterology,2006,130(130)∶1466-1479.

[3] Dai, C.Z., C. Q.Jiang, M.Ma, X. Y.Jiang, L. J., Probiotics and irritable bowel syndrome[J].World J Gastroenterol,2013,19(36)∶5973-5980.

[4] Jalanka-Tuovinen J, S.J., Salonen A, Immonen O, Garsed K,Kelly FM, Zaitoun A, Palva A, Spiller RC, de Vos WM., Faecal microbiota composition and host-microbe cross-talk following gastroenteritis and in postinfectious irritable bowel syndrome[J].Gut,2013∶ p. Epub ahead of print.

[5] Rajilic-Stojanovic M, Biagi E, HeiligHG,etal.Global and deep molecular analysis of microbiota signatures in fecal samples from patients with irritable bowel syndrome[J].Gastroenterology.2011,141(5)∶1792-1801.

[6] Dai C, Zheng CQ, Jiang M, et al.Probiotics and irritable bowel syndrome[J].World J Gastroenterol,2013,19(36)∶5973-5980.

[7] 陳宏運,崔紅燕,吳彬彬,等.植物發酵液對D-半乳糖致衰老模型小鼠的抗氧化活性研究[J].現代食品科技,2015,31(8)∶7-11,17.

[8] Roberts LM, McCahon D, Holder R, et al.Arandomised controlled trial of a probiotic 'functional food' in the management of irritable bowel syndrome[J].BMC Gastroenterol,2013,13(1)∶45

[9] Zhou XY, Li M, Li X, et al.Visceral hypersensitive rats share common dysbiosis features with irritable bowel syndrome patients[J].World J Gastroenterol,2016,22(22)∶5211-5227.

High-throughput Sequencing Analysis of Intestinal Microbiota in Patients with Irritable Bowel Syndrome and Healthy Individuals*

YANG Li-li, WANG Cheng-wen,ZOU Ao. Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong Province, China

ObjectiveTo compare differences of intestinal microbiotabetween IBS patients andhealthy by using high-throughput sequencing technology.MethodsThe feces were collected IBS group andhealthy group. The community structure and abundance of intestinal microbiota were examined via analyzing 16S rRNA high throughput sequencing using Illumima System.ResultsThe diversities of intestinal bacteria were no significant differences in IBS group. In phyla level, the abundance of Firmicutes was significantlyincreased (P＜0.01), while the abundance of Bacteroidetesand the ratio ofBacteroidetes/Firmicutes were decreased (P＜0.01). Besides, in family level, cryomorphaceae,erysipelotrichac eae. Campylobacteraceae and fibrobacteraceae were detected in IBS group and healthy group.Their abundance were significantly difference, respectively (P＜0.05).ConclusionNo significantdifferences in the bacterial diversity indices are found, but some bacterial species significantly differbetween the patients with IBS and healthy controls.

Irritable Bowel Syndrome; Intestinal Microbiota; High-throughput Sequencing; 16S rRNA

R378.2

A

深圳市科技計劃項目：No.JCYJ201404151625429

10.3969/j.issn.1009-3257.2017.05.015

楊莉麗，女，消化內科專業，副主任醫生，主要研究方向：胃腸功能性疾病

王成文

2017-09-21