石油降解菌群的篩選、構建及其降解特性研究*

詹亞斌 張 橋 陳凱倫 李方敏 馬立安#

(1. 長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；2.長江大學化學與環境工程學院，湖北 荊州 434025)

石油降解菌群的篩選、構建及其降解特性研究*

詹亞斌1張 橋1陳凱倫2李方敏2馬立安1#

(1. 長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；2.長江大學化學與環境工程學院，湖北 荊州 434025)

為了構建高效石油降解混合菌群，從潛江某油田采集8個石油污染土樣(分別記為S1～S8)和2個石油污染水樣(分別記為W3、W4)，以石油為唯一碳源進行富集馴化培養；采用外觀評分、石油降解率、石油3組分降解率、飽和烴中正構烷烴色譜分析等方法篩選石油降解優勢菌群，構建石油降解混合菌群；采用正交試驗研究混合菌群最佳降解條件。結果表明，富集的10個石油降解菌群中S3、S4、S5、S6、S8為優勢菌群，培養30d后的石油降解率分別為21.67%、22.34%、27.23%、20.46%、19.99%；菌群W3、W4對石油乳化效果較好；混合菌群M3(S3+S4+S5+S8+W3+W4)為石油降解優勢混合菌群，其最佳降解條件為35 ℃、pH7.60、含油率1.70%，在最佳條件下培養30d后，混合菌群M3對石油降解率達30.71%，比最優菌群S5的石油降解率提高了12.78%。

石油 污染土壤 石油降解菌群 土壤修復

Abstract: In order to construct high efficient petroleum-degrading flora,eight oil-contaminated soil samples (signed S1-S8) and two oil-contaminated water samples (signed W3 and W4) were collected from an oil field in Qian Jiang. Taking petroleum as the sole carbon source,the enrichment and domestication were carried out to obtain the flora,and finally the flora with good petroleum-degrading performance were screen by scoring criteria of appearance,petroleum removal rate and gas chromatographic. The predominant petroleum-degrading flora were applied to constructed mixed flora. The oil degradation characteristics of mixed flora were studied by orthogonal experiment. The results showed that five bacteria of S3,S4,S5,S6,S8 displayed the perfect petroleum removal efficiency,the petroleum degrading rate was 21.67%,22.34%,27.23%,20.46% and 19.99% respectively after 30 d of culture. The mixed bacteria M3 (S3+S4+S5+S8+W3+W4) was the superior mix flora for petroleum degrading,the oil removal rate reached 30.71% in 30 days at optimal growth conditions of 35 ℃,pH 7.60,oil content 1.70%. It was 12.78% higher than that of superior flora S5.

Keywords: petroleum; contaminated soil; petroleum-degrading flora; soil remediation

隨著社會經濟的發展，人們對石油資源的需求量越來越大，然而石油在勘探、開采、運輸以及儲存過程中存在不同程度的泄露，對環境造成了嚴重的污染。石油進入土壤和水體中會破壞生態環境，危害人類健康[1]。隨著石油污染情況日益嚴重，對其進行治理已經刻不容緩[2]。

微生物修復技術是石油污染土壤治理的重要途徑之一[3-4]，大量研究表明微生物對降解土壤中的石油起著重要作用[5-8]。微生物修復技術具有成本低、操作簡單、處理效果好、不破壞生態環境等優點，是最有前景的修復技術之一。石油組成十分復雜，一種微生物不可能實現石油污染物的完全降解，混合菌群降解石油效果較好。陳立等[9]從陜北某油田的石油污染土壤中篩選石油降解單菌，并將其組成菌群進行石油污染土壤的修復，經過11～32 d的修復，土壤中石油污染物降解率可達69.52%～88.11%；而未添加降解菌的土壤中，石油污染物降解率基本在10%以內。韓慧龍等[10]將1株細菌和1株真菌互作，證實了真菌和細菌協同修復石油污染耕地的可行性及其良好的應用前景。

本研究從潛江某油田石油污染土壤和水樣中篩選出石油降解優勢菌群，構建混合菌群并研究其對石油的降解特性，以期實現微生物混合菌群對石油中不同烴類的高效降解，從而為微生物修復石油污染研究提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 石油污染樣品

石油污染樣品采自潛江某油田作業油井及廢棄老井附近，共采集8個污染土樣，分別記為S1～S8，土樣采集深度為地表20～25 cm，另采集2個污染水樣，分別記為W3、W4，所有樣品無菌密閉保存，樣品基本信息見表1。

表1 樣品基本信息

1.1.2 培養基

富集馴化培養基[11]：NaNO31.5 g、(NH4)2SO41.5 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、NaCl 5.0 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、CaCl20.02 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0、石油質量分數2%。

1.1.3 主要儀器

索式提取器、旋轉蒸發儀、層析柱、氮吹儀、紫外分光光度計、搖床、恒溫培養箱等。

1.2 分析方法

土壤pH測定參照《森林土壤pH值的測定》(LY/T 1239—1999)；土壤含油量采用重量法測定[12]，將S1～S8土樣過2 mm篩后，稱取5.0 g置于索氏提取器的樣品槽中，在蒸餾瓶中加入100 mL二氯甲烷/丙酮(體積比80∶20)混合溶液，于54 ℃恒溫水浴鍋下萃取8 h，54 ℃旋轉蒸發器中濃縮，將濃縮液用玻璃棒傾斜倒入下層裝有無水硫酸鈉的特制漏斗中，最終流入已稱重的25 mL干燥燒杯中，在通風廚中揮發至近干，放于真空干燥箱中40 ℃、0.04 MPa干燥30 min，取出置于干燥器中冷卻至室溫稱重，根據土壤含油量計算含油率。

水樣含油量測定：在培養瓶中加入100 mL水樣，滴入1 mL鹽酸破乳，將破乳后水樣無損轉移至分液漏斗中，分4次一共加入80 mL二氯甲烷萃取出石油，用無水硫酸鈉除水后，室溫晾干至有機溶劑揮發完全，分液下來的石油放置真空干燥箱40 ℃、0.04 MPa下干燥30 min后，取出置于干燥器中冷卻至室溫稱重，根據水樣含油量計算含油率。

1.3 石油降解菌群的富集、馴化

分別將石油污染土樣5.0 g或污染水樣5.0 mL轉接到石油質量濃度為20 g/L的富集馴化培養基中，于28 ℃、150 r/min恒溫搖床振蕩培養7 d，將獲得的菌液按照5%(質量分數)的接種量重新轉接到新鮮的含20 g/L石油的富集馴化培養基中，以7 d為1個周期，連續培養3個周期，取第3個周期菌懸液中的菌群作為實驗用菌群，將富集馴化的得到菌群與石油污染土樣或水樣對應編號。

1.4 石油降解菌群的篩選

1.4.1 外觀評分

取100 mL富集馴化培養基加入到250 mL的三角瓶中，將1.3節富集馴化3個周期的菌懸液以1%(質量分數，下同)的接種量接入到三角瓶中，于28 ℃、150 r/min恒溫搖床振蕩培養30 d，同時設置不加菌群的富集馴化培養基作為空白對照組(CK組)，培養結束后根據培養基中石油降解后顆粒大小、培養基渾濁程度和乳化情況進行外觀評分，總分10分，評分細則見表2。

參考水樣含油量測定方法，分別測量各菌群培養30 d后富集馴化培養基中石油的質量濃度，根據式(1)計算各菌群的石油降解率。

D=(c0-cs)/c0×100%

(1)

式中：D為石油降解率，%；c0為CK組富集馴化培養基中石油的質量濃度，mg/L;cs為接菌組富集馴化培養基中石油的質量濃度，mg/L。

1.4.2 石油3組分降解率的測定

石油的組成十分復雜，通常含有飽和烴、芳香烴、非烴、瀝青質等4種組分，其中瀝青質中含有膠質，密度高，黏度大，微生物降解效果不明顯，因此本研究主要分析各菌群對石油中飽和烴、芳香烴及非烴的降解效果。本研究采用的石油樣品中飽和烴∶芳烴∶非烴的質量比為4.78∶1.00∶1.50。利用柱層析的方法分離出各富集馴化培養基中的飽和烴、芳香烴、非烴，參考《巖石中可溶有機物及石油族組分分析》(SY/T 5119—2008)測定各組分的質量濃度，參考式(1)分別計算菌群培養30 d后3種組分的降解率。

表2 外觀評分細則

1.4.3 飽和烴組成的氣相色譜分析

向廷生等[13]在用本源微生物降解遼河石油污染土壤時發現，經微生物培養30 d后，石油飽和烴中的正構烷烴降解明顯，培養60 d后正構烷烴幾乎被完全降解，而芳烴和非烴降效果不明顯，考慮到本研究所用的石油樣品主要成分為飽和烴，故氣相色譜只用于分析飽和烴中正構烷烴含量變化。分析方法如下：提取上述柱層析分離得到的飽和烴，經干燥后準確稱取約10 mg，加入0.25 mL二氯甲烷溶解，然后在各樣品中分別加入0.960 6 μg/μL氘代正二十四烷(C24D50)標樣(美國Sigma公司)100 μL，使用氣相色譜儀測定飽和烴中各組分含量。

色譜分析條件為:7890A型氣相色譜儀(美國Agilent)，色譜柱:HP-5型苯基-甲基聚硅氧烷柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣(N2)流速:1 mL/min，空氣流速：400 mL/min，H2流速：30 mL/min，尾吹氣流速:45 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL。升溫程序:50 ℃保持1 min，以15 ℃/min的速率升至100 ℃，然后以4 ℃/min的速率升至310 ℃，保持20 min，進樣口溫度315 ℃，檢測器溫度320 ℃。

1.4.4 生物量的測定

在波長600 nm下測富集馴化培養基的吸光度(OD600)，OD600可用于表征培養基中菌群生物量，一般菌群生物量與石油降解率成正比，因此可以通過測生物量篩選優勢石油降解菌群[14]。

1.5 混合菌群的構建與篩選

從石油污染土樣及水樣中培養出的石油降解菌群中篩選優秀菌群，按各菌群的石油降解特性構建3個混合菌群，將3個混合菌群以1%的接種量接入富集馴化培養基中，于28 ℃、150 r/min恒溫搖床振蕩培養10 d，考察3個混合菌群對石油3組分降解率及OD600，篩選出優勢混合菌群。

1.6 優勢混合菌群的降解特性研究

溫度、pH、含油率是影響石油降解菌群生長的重要因素，各因素水平過高或過低都不利于微生物對石油的降解[15]。前期單因素實驗表明，各菌群降解石油的最適pH為8.00，這與污染土樣的pH相近。含油率為0.50%、2.00%時微生物生長都較好，考慮到污染土樣含油率平均值為2.21%，選取含油率水平在2.00%上下，結合微生物最適溫度，本研究設置優勢混合菌群石油降解正交實驗(見表3)，在不同條件下恒溫搖床振蕩(150 r/min)培養10 d，測定OD600獲取最佳反應條件，在最佳條件下設置5組平行，培養30 d后測石油降解率，結果取平均值。

表3 正交實驗因素水平

2 結果與分析

2.1 石油污染土樣pH和含油率分析

石油污染土樣的pH和含油率測定結果見表4。由表4可見，石油污染土壤的pH為7.92～8.82，平均值為8.23。8個土樣中含油率最低為0.63%，最高為6.64%，平均值為2.22%。

2.2 石油降解菌群的富集、馴化與篩選結果

2.2.1 外觀評分與石油降解率分析

將菌群培養30 d后的富集馴化培養基進行外觀評分和石油降解率分析，結果如表5所示。由表5可見，各菌群外觀評分排序為S3>S8>S5>S4>W3>W4>S6=S2>S7>S1；石油降解率排序為S5>S4>S3>S6>S8>W4>S1>S7>W3>S2；菌群S3、S4、S5、S8、W3和W4能使培養液變混濁，肉眼觀察具有較好的降油效果；菌群S3、S4、S5、S6、S8對石油具有較高的降解效果，石油降解率分別為21.67%、22.34%、27.23%、20.46%、19.99%。其中菌群S2并不降解石油，但肉眼觀察對石油具有一定的乳化效果。

表4 污染土樣pH和含油量

表5 菌群外觀評分及石油降解率

圖1 各菌群對石油3組分的降解率Fig.1 The removal rate of three componets of oil by microbial flora

圖2 色譜檢測結果Fig.2 The result of gas chromatographic

2.2.2 石油3組分降解率分析

各菌群培養30 d后，富集馴化培養基中的飽和烴、芳香烴、非烴的降解率如圖1所示。

由圖1可見，菌群S4、S5對飽和烴具有較好的降解效率，飽和烴降解率分別為15.77%、18.80%；菌群S3、S4、S5對芳香烴具有較好的降解效率，芳香烴降解率分別為37.07%、40.54%、46.62%；S4、S5對非烴降解效果最好，非烴降解率分別為29.46%、30.85%。

2.2.3 正構烷烴降解率分析

各菌群培養30 d后，富集馴化培養基中正構烷烴的氣相色譜分析結果見圖2。

從CK組色譜分析結果可知，本研究采用的石油樣品正構烷烴的主要組分為C22～C28，質量分數均在5%以上。10個菌群對C16～C28具有好的降解效果，各組分質量分數與CK組相差明顯，菌群對C14、C15以及C29～C35降解效果不明顯。其中菌群S3、S8培養30 d后，各組分質量分數相對最低，說明S3、S8對正構烷烴降解效果最好，可以初步確定具有高效降解石油的潛質。

2.3 混合菌群的構建與篩選

根據2.2節中石油降解菌群的富集馴化與篩選結果，初步篩選出6個石油降解菌群S3、S4、S5、S8、W3、W4構建混合菌群，其中菌群S3、S4、S5、S8的石油降解率較高，菌群W3、W4對石油乳化效果較好，3個石油降解混合菌群M1(S3+S5+S8)、M2(S4+W3+W4)和M3(S3+S4+S5+S8+W3+W4)在富集馴化培養基中培養10 d后的外觀評分和OD600測定結果如表6所示。由表6可見，混合菌群M3的外觀評分最高、OD600最大，為石油降解優勢混合菌群。

表6 混合菌群外觀評分及OD600測定

2.4 優勢混合菌群降解特性

混合菌群M3的石油降解正交試驗結果見表7。由表7可見，各影響因素中溫度的極差R最大，是影響混合菌群M3降解石油的關鍵因子，其次是pH，而含油率的影響最小。此外，混合菌群M3降解石油的最適培養條件為A2B1C1，即溫度35 ℃、pH 7.6、含油率1.7%，經過進一步驗證，混合菌群M3在最適條件下對石油的降解率為30.71%，比最優菌群S5的石油降解率提高了12.78%。

表7 正交試驗結果

3 討 論

由于本研究采集的石油污染土壤含油量平均值為2.22%，因此在后續的富集馴化及培養實驗中，均將培養基中的含油量設定為2.00%進行石油降解菌群的富集、馴化以及降解特性研究。單一的石油降解菌群篩選方法均存在一定缺陷，如外觀評分法簡單快捷，但受人為主管因素干擾太大；重量法測定石油降解率、石油3組分降解率和飽和烴組成成分能準確反映菌群對石油的降解效果，但實驗過程繁瑣、周期長、成本較高；生物量可以間接反應石油降解效率，且測定方法簡單快捷，為此本研究首先采用多種方法篩選獲得石油降解優勢菌群，綜合分析菌群的石油降解能力，篩選優勢石油降解菌群，構建石油降解混合菌群，采用外觀評分法以及生物量測定方法篩選優勢混合菌群，用生物量測定方法研究其降解特性，在確定石油降解優勢混合菌群最佳降解條件后，采用重量法測定其石油降解率，在確保篩選結果的同時簡化篩選流程。

4 結 論

潛江某油田8個土樣含油量平均值為2.22%，pH平均值為8.23；富集的10個菌群中S3、S4、S5、S6、S8為優勢石油降解菌群，培養30 d后的石油降解率分別為21.67%、22.34%、27.23%、20.46%、19.99%；菌群W3、W4對石油乳化效果較好；利用菌群S3、S4、S5、S8、W3、W4構建3個石油降解混合菌群M1(S3+S5+S8)、M2(S4+W3+W4)和M3(S3+S4+S5+S8+W3+W4)，其中混合菌群M3對石油降解效果最好，其對石油降解的最佳條件為溫度35 ℃、pH 7.60、含油率1.70%，在此條件下培養30 d的石油降解率30.71%，比最優菌群S5的石油降解率(27.23%)提高了12.78%。

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Isolationandconstructionofpetroleum-degradingfloraandtheirdegradingcharacteristics

ZHANYabin1,ZHANGQiao1,CHENKailun2,LIFangmin2,MALi’an1.

(1.SchoolofLifeScience,YangtzeUniversity,JingzhouHubei434025；2.SchoolofChemicalandEnvironmentalEngineering,YangtzeUniversity,JingzhouHubei434025)

2016-12-26)

詹亞斌，男，1991年生，碩士研究生，主要從事環境微生物研究。#

。

*國家自然科學基金資助項目(No.41271482)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.08.010