花生中白藜蘆醇含量測定的前處理方法優化

劉 煒 ，丁小霞 ，李培武 ，喻 理 ，雷紹榮 ，楊小鳳

（1.中國農業科學院油料作物研究所，湖北武漢430062；2.農業部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，湖北武漢430062；3.農業部油料產品質量安全風險評估實驗室（武漢），湖北武漢430062；4.四川省農業科學院分析測試中心，四川成都610066）

花生中白藜蘆醇含量測定的前處理方法優化

劉 煒1，2，3，4，丁小霞1，2，3，李培武1，2，3，喻 理1，2，3，雷紹榮4，楊小鳳4

（1.中國農業科學院油料作物研究所，湖北武漢430062；2.農業部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，湖北武漢430062；3.農業部油料產品質量安全風險評估實驗室（武漢），湖北武漢430062；4.四川省農業科學院分析測試中心，四川成都610066）

通過比較溶劑直接提取法、高速離心提取法和固相萃取柱提取法3種不同的前處理方法對花生樣品進行處理，采用高效液相色譜法（HPLC）對處理后樣品中的白藜蘆醇含量進行測定，研究并優化花生中白藜蘆醇含量測定的前處理方法。結果表明，固相萃取柱提取法效果好，回收率高，該方法的檢出限為0.08 mg/kg，加標回收率在96.9%～101.0%，相對標準偏差（RSD）在1.5%～2.1%。

花生；白藜蘆醇；前處理方法；高效液相色譜法

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為純度≥98%的白藜蘆醇標準品，由德國Dr.Ehrenstorfer公司生產。

1.2 試劑

Waters-2695高效液相色譜儀，儀器配Waters-2998光電二極管陣列檢測器；德國IKA T18 basic勻漿機；湘儀TDZ5-WS離心機；美國N-EVAP-111氮吹濃縮儀；乙腈（色譜純）；無水乙醇（分析純）；氧化鋁分層柱（0.074～0.149 mm）：國藥集團化學試劑有限公司）；純凈水；0.45 μm有機濾膜。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制 稱取白藜蘆醇標準品50.0 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度,制成質量濃度為1 000 mg/L的白藜蘆醇標準貯備液，保存于4℃。臨用時，用甲醇稀釋成不同濃度的標準使用液。

標準工作液系列的配制：甲醇稀釋白藜蘆醇標準貯備液得到 0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，7.0，10.0 mg/L的混合標準溶液。

1.3.2 樣品前處理 方法一（國標法）：溶劑直接提取。稱取5.0 g花生粉狀樣品于100 mL離心管中，加入85%乙醇水溶液60 mL，再置于80℃水浴45 min，不時振搖。冷卻后用濾紙過濾，殘渣用少量85%乙醇水溶液洗滌后合并提取液，并定容至100 mL。吸取2 mL濾液，于5 000 r/min離心5 min，上清液待用[16]。

方法二：高速離心提取。稱取5.0 g花生粉狀樣品于100 mL離心管中，加入85%乙醇水溶液10 mL高速勻漿2 min后，于4 000 r/min離心10 min。將上清液轉入50 mL容量瓶中。殘渣分別用5 mL 85%乙醇水溶液提取2次后合并提取液，并定容至50 mL。搖勻后用0.45 μm濾膜過濾，待用[17]。

方法三：固相萃取柱提取。稱取5.0 g花生粉狀樣品于50mL離心管中，加入85%乙醇水溶液40mL置于80℃水浴45 min，不時振搖。放置過夜后吸取8 mL上清液過氧化鋁層析柱，收集濾液到10 mL刻度管。40℃氮吹濾液至1 mL，用0.45 μm濾膜過濾，待用。

1.3.3 高效液相色譜條件 色譜柱條件為Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫為40℃；檢測波長為306 nm；流動相A為乙腈；流動相B為水；進樣量為10 μL；檢測器為二極管陣列檢測器。梯度洗脫條件列于表1。

表1 梯度洗脫條件

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸方程的建立

在試驗條件下，采集甲醇配制的7個不同濃度標準品信號繪制其標準曲線。結果表明，白藜蘆醇在質量濃度為0.1～10 mg/L時，質量濃度（C，mg/L）與其峰面積（A）呈良好的線性關系，相關系數大于0.999。白藜蘆醇的相關系數和檢出限列于表2。

表2 線性關系試驗結果

2.2 方法檢出限（LOD）與定量限（LOQ）比較

按“步驟 1.2.1，1.2.2，1.2.3”3 種前處理方法得出的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）列于表3。三者比較，固相萃取柱提取法的檢出限和定量限最低，可以更好地測定花生中的白藜蘆醇。

表3 檢出限和定量限數據

2.3 方法重復性和準確度比較

在花生粉碎樣品中添加混合標準溶液，使添加質量分數分別為1.0，5.0，10.0 mg/kg。每個濃度水平重復 5 次，分別按照“按步驟 1.2.1，1.2.2，1.2.3”3 種前處理方法處理樣品，進行精密度與準確度的測定，3種添加濃度的方法重復性及回收率列于表4，3種前處理方法兩兩之間的加標回收率差異均較大，且回收率溶劑直接提取法一＜高速離心提取法二＜固相萃取柱提取法，固相萃取柱提取法的加標回收率高于其余2種方法，重復性好于其余2種方法。

表4 樣品添加回收和重復性試驗（n＝5）

3 討論與結論

本研究通過比較3種前處理方法的檢出限、定量限、回收率和精密度發現，固相萃取柱提取法在獲得最佳凈化效果的同時可得到最佳的回收率，綜合考慮，固相萃取柱提取法優于高速離心法，而高速離心法優于溶劑直接提取法。因為白藜蘆醇難溶于水[18]，易溶于乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑[19]，對白藜蘆醇的提取率由低到高依次為丙酮＜無水乙醇＜甲醇＜乙醚＜乙酸乙酯，因為乙醇具有無毒、安全、價格低廉、易得、易回收的特點[20]，選擇乙醇作為提取白藜蘆醇的試劑較適宜。溶劑直接提取法提取試劑消耗量大，且提取效率不高。高速離心法乙醇提取白黎蘆醇的提取率略低于固相萃取柱提取法，但提取試劑消耗較高，提取不完全。固相萃取柱提取法用85%乙醇作為提取劑，經過80℃高溫提取，靜置過夜，可以讓白藜蘆醇與萃取劑充分接觸，提高萃取效率。由于白藜蘆醇在植物組織中含量很低，并且粗提物中含有大量的雜質，如大黃素等蒽醌類化合物，必須對其進行分離純化，以得到高純度的白藜蘆醇，中性氧化鋁作為分離介質，利用其特有的吸附層析作用，可以將白藜蘆醇與花生樣品中的其他雜質實現有效分離，且對白藜蘆醇不會造成死吸附，樣品損失少且提取率高。花生樣品經過提取凈化后，采用氮吹濃縮儀對提取劑進行濃縮，可達到良好的富集效果。

通過比較溶劑直接提取、高速離心提取、固相萃取柱提取法3種不同的前處理方法對花生樣品進行處理，采用高效液相色譜法（HPLC）對處理后樣品中的白藜蘆醇含量進行測定，最終證明固相萃取柱提取法效果好，回收率高，方法的的檢出限為0.08 mg/kg，加標回收率在96.9%～101.0%，相對標準偏差（RSD）在1.5%～2.1%。

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Optimization of Pretreatment Methods for Determination of Resveratrol in Peanut

LIUWei1，2，3，4，DINGXiaoxia1，2，3，LI Peiwu1，2，3，YULi1，2，3，LEI Shaorong4，YANG Xiaofeng4
（1.Institute of Oil Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430062，China；2.Key Laboratory of Biology and Genetic Breeding of Oil Crops，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；3.Laboratory of Risk Assessment for Oilseeds Products（Wuhan），Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；4.Analysis and Testing Center，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China）

After comparing the recoveries of 3 different sample pretreatment methods,the levels of resveratrol content in samples were detected by High Performance Liquid Chromatography,and studied and optimized the pretreatment method for the determination of resveratrol contents of in peanuts.The results showed that the solid phase extraction method gave the best recovery data,the method detection limit was 0.08 mg/kg,the recovery was 96.9%-101.0%and the relative standard deviation was 1.5%-2.1%.

peanut；resveratrol;pretreatment method;high performance liquid chromatography

O65

A

1002-2481（2017）10-1695-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.10.29

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是非黃酮類的多酚化合物，是許多植物受到生物或非生物脅迫時產生的一種植物抗毒素[1]。1939年人類首次發現白藜蘆醇，1940年日本人Tokaoka首次從毛葉藜蘆（Veratrum grangiflorum）的根部分離得到白藜蘆醇[2]。白藜蘆醇有順式和反式2種結構，其中，反式白藜蘆醇的生理活性強于順式白藜蘆醇，在植物中主要以反式白藜蘆醇存在，紫外照射可使反式白藜蘆醇轉換為順式白藜蘆醇[3]。近年來的研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗氧化[4]、抗自由基[5]、保護肝臟、保護心血管等功能，其中，最令人矚目和最有發展前景的是能夠抑制某些癌細胞的生長、發生和增殖，因此，被譽為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物。此外，白黎蘆醇具有調節免疫、抗病毒、抗細菌及真菌、抗變態反應、輻射防護、預防急性傳染性非典型肺炎（非典）等藥用價值[6]。因此，研究和提取植物中的白藜蘆醇至關重要。目前，國內外有關植物中白藜蘆醇提取分析的研究報道很多，涉及到的前處理和檢測方法也越來越多、越來越先進[7-10]。高效液相色譜法具有高靈敏度、高效能和高速度的特點，廣泛應用于葡萄酒、虎杖、花生等樣品中白藜蘆醇的檢測[11-14]。HPLC法測定白藜蘆醇的含量，樣品前處理方法的不同將直接影響測定結果[15]。目前，對花生中白藜蘆醇的檢測方法基本采用GB/T 24903—2010《糧油檢驗花生中白藜蘆醇的測定高效液相色譜法》，該法采用乙醇水溶液直接提取白藜蘆醇后上機測定，未考慮花生中油脂類雜質在乙醇水溶液中溶解性好的特點對檢測結果的影響。

本試驗結合GB/T 24903—2010標準優化前處理方法，對花生中含有大量油脂類物質和白藜蘆醇含量較低等因素進行研究，以建立提取效果好、回收率高、重復性好的檢測方法。

2017-05-18

國家自然科學基金項目（31601573）；四川省財政創新能力提升工程項目（2017QNJJ-022，2015QNJJ-037）

劉 煒（1988-），女，重慶開縣人，研究實習員，主要從事食品安全分析研究工作。丁小霞為通信作者。