一例人感染帶絳蟲PCR鑒定

蔡亞南 ， 趙麗娟 ， 王 丞 ， 祝學珍 ， 唐 磊 ， 楊桂連 ， 錢愛東 ， 趙 權

(吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118)

一例人感染帶絳蟲PCR鑒定

蔡亞南 ， 趙麗娟 ， 王 丞 ， 祝學珍 ， 唐 磊 ， 楊桂連 ， 錢愛東 ， 趙 權

(吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118)

為了快速鑒別診斷一例人絳蟲感染病例，采用聚合酶鏈式法(PCR)擴增線粒體cox1和Cytb基因片段，對PCR 擴增的產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測和基因序列測序。分別與NCBI 數據庫中帶絳蟲cox1 和Cytb基因序列進行比對，同時選用MEGA 構建系統進化樹。結果：核酸序列與NCBI 數據庫中牛帶絳蟲同源性均為99%，進化分析表明與牛帶絳蟲的親緣性最近。表明該病例屬于牛帶絳蟲感染。

牛帶絳蟲 ；cox1 ；Cytb； 鑒定

牛帶絳蟲(Taeniasaginata.Tsa)、亞洲帶絳蟲(Taeniaasiatica.Tas)和豬帶絳蟲(Taeniasolium.Ts)均可感染人，且從臨床癥狀和蟲體形態上難以區分。為了鑒定該病人所患蟲種，本文通過PCR方法擴增cox1和Cytb基因片段，并對擴增序列進行分析及構建進化樹，從而確定該絳蟲種屬，進而確定該例患者的病源。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2016年8月廣西某地一位患者，常常表現腹痛、腹部不適現象，并且伴有體重下降，肛門瘙癢癥狀，糞便中偶見乳黃色的的絳蟲節片，患病前常吃生肉片和燒烤，疑似患有囊蟲病，來吉林農業大學囊蟲病醫院就診。給病人口服中藥合劑(新鮮南瓜子和檳榔提取物)，30 min后口服30%水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O)。經過3～6 h排出大約1m長近乎完整的絳蟲。置于0.9%生理鹽水中保存，檢測。

1.2 絳蟲基因組提取 取0.5g絳蟲孕卵節片，經液氮充分研磨，采用TaKaRa基因組DNA廣譜型小量純化試劑盒，按照說明書，提取絳蟲基因組。

1.3 引物設計及克隆 根據GenBank上cox1和Cytb基因序列，設計特異性引物，見表1。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 cox1和Cytb引物

PCR反應體系 2X PremixTaq(TaKaRa, Japan)25 μL,去離子水20 μL, Primer-F(10 μmol/L)1.5 μl,Primer-R(10 μmol/L)1.5 μL,模板(gDNA)2 μL,總體積50 μL。PCR 反應條件：預變性95 ℃，5 min；變性94 ℃，40 s；退火55 ℃，40 s；延伸72 ℃，1 min；再延伸72 ℃，10 min。循環數：35 cycles。取2 μL PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測，若條帶正確，將剩余PCR產物回收。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化(TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)，取4 μL純化產物連接到1 μL的PMD-18T(pMDTM18-T Vector Cloning Kit)載體中。轉化到DH5α(Tiangen)感受態中，在含有Amp+抗性的LB固體培養基上，37 ℃培養12～16 h。挑取單克隆菌落在含有抗性的液體LB培養基內，37 ℃，180 r/min振蕩培養12～16 h，取5 ml菌液提取質粒。以質粒作為模板按以上PCR條件驗證，由上海生工生物工程技術服務有限公司完成測序。

1.4 測序結果比對 對該絳蟲所測核苷酸序列通過NCBI(National Center for Biotechnology Information) Blast(Basic Local Alignment Search Tool)工具比對其同源性。

1.5 構建進化樹 GenBank上分別下載牛帶絳蟲、豬帶絳蟲、亞洲帶絳蟲的cox1和Cytb序列。cox1共15條核苷酸序列，Cytb共10條核苷酸序列。將測序成功的基因片段分別與GenBank上絳蟲線粒體cox1和Cytb核苷酸序列對比，并使用MEGA(Version6)軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining NJ)、選用Kimura 2-parameter模式，Bootstrap值設定為 1 000 bp 構建絳蟲系統進化樹。

2 試驗結果

2.1 蟲體有絳蟲孕節。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠檢測，如圖1可見，cox1在接近2 000 bp的位置、Cytb在靠近1 000 bp的位置有明顯單一的條帶。

圖1 cox1和Cytb序列PCR結果

M：DL-2 000 DNA Marker； 1：cox1； 2：cox1陰性對照； 3：Cytb； 4：Cytb陰性對照

2.3 核酸序列比對結果cox1 核苷酸序列長度為1 620 bp，通過NCBI Blast 顯示分別與牛帶絳蟲(GenBank: AB107244)同源性為99%，突變堿基3個，見表2；亞洲帶絳蟲(GenBank: AB107235.1)同源性為96%，突變基因66個；豬帶絳蟲(GenBank: JX535570.1)同源性為92%。Cytb核苷酸序列長度為1 068 bp，NCBI Blast 顯示分別與牛帶絳蟲(GenBank: AB274525.1)同源性為99%，不同堿基8個，見表2；亞洲帶絳蟲(GenBank:AB066580.1)同源性為97%，不同和缺失堿基共35個；豬帶絳蟲(GenBank: FN995661.1)同源性為87%。

2.4 核苷酸序列比對并構建系統進化樹 采用MEGA 構建的絳蟲cox1 和Cytb進化樹見圖3和圖4，待測絳蟲(Tapeworm)與牛帶絳蟲形成一個單系，親緣關系最近。

表2 基因cox1和Cytb突變堿基

圖2 cox1基因核苷酸序列進化樹

圖3 Cytb基因序列進化樹

3 討論

絳蟲病是世界衛生組織(WHO)公認的熱帶病，常用的診斷方法有：蟲體形態學檢查、血清抗體ELISA檢測、分子生物學鑒定。傳統的蟲種鑒定主要依據蟲體的形態，比如頭節上有無頂圖和鉤，鏈體長度，卵巢形態和睪丸長度等。但牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲形態極其相似，并且部分地區還有絳蟲與蟯蟲混合感染的現象，所表現的癥狀與急性闌尾炎相似[1]。常用的分子生物學技術有多重PCR、RFLP-PCR、隨機引物DNA擴增等[3]。寄生蟲分子學特征的研究是學習和控制寄生蟲的流行病學和傳染的關鍵因素。近幾年對寄生蟲基因的研究頗多，例如全基因組測序[2]、線粒體遺傳變異[3]等。

線粒體基因組作為分子標記被廣泛應用于物種鑒定[4-6]，為流行病學的研究提供來源。Cytb與cox1在不同種屬之間具有較高的保守性和特異性，可準確、高效地評估種間或種內的遺傳變異及其親緣關系[7]。cox1和Cytb完整序列的分析顯示,全世界存在兩個絳蟲系譜：亞洲組和非洲或拉丁美洲組，即使絳蟲因不同地理位置的改變而發生的遺傳變異也可準確鑒定絳蟲病[4]，結合系統發育樹可描述物種間的進化關系，并推斷出物種之間的遺傳距離[5]。陳錚宏等[6]、張晨昊等[7]和羅浪等[8]以cox1和mtDNA-Cytb作為基因標記，采集大理、怒江和臺灣等部分地區帶絳蟲標本，并成功鑒定了其種屬。本文早在20世紀末，就有學者[9; 10]針對采集臺灣地區的絳蟲進行了基因分析，提出并驗證了亞洲帶絳蟲可能是牛帶絳蟲的一個亞種，王正蓉[11]并對此提議進行了驗證，認為將亞洲帶絳蟲劃分為牛帶絳蟲亞種較為合適。

本文選用線粒體cox1和Cytb基因序列作為分子遺傳標記， PCR擴增陽性結果經測序發現序列長度與GenBank數據庫上記錄的cox1和Cytb序列長度一致，分別是為1 620 bp和1 068 bp。Blast比對顯示：與牛帶絳蟲同源性最高99%。進化樹分析可知，序列分別與牛帶絳蟲cox1和Cytb基因同屬于一個分支，并且Cytb序列與蒙古Cytb序列并為一支，同為亞洲地區。經以上分子生物學信息分析，證明該蟲種與牛帶絳蟲為一個種，屬于亞洲組。

本文絳蟲線粒體基因組系統拓撲結構顯示，被檢絳蟲與亞洲帶絳蟲構成姊妹支,與牛帶絳蟲隸屬于一個分支，與牛帶絳蟲親緣關系最近。與以往試驗數據相一致，進一步證實該絳蟲屬牛帶絳蟲。在我國一些貧困地區由于衛生條件差、設施缺乏，仍然存在人畜廁所不分的現象，且部分少數民族地區依然保留著吃生肉片和燒烤的習俗，給囊尾蚴病的傳播創造了有利條件[12]。及時控制和預防絳蟲病的傳播有利于各地區畜牧業的發展和經濟的提高，建議加強公共衛生知識的學習、改正不良飲食習慣、切斷中間宿主的傳播，來控制和預防絳蟲的傳播。

[1] Hassanjani S K, Fakhar M, Nematian J,etal. Co-infection with Enterobius vermicularis and Taenia saginata mimicking acute appendicitis[J]. Journal of Infection & Public Health, 2016, 9(4): 519-522.

[2] Wang S, Wang S, Luo Y,etal. Comparative genomics reveals adaptive evolution of Asian tapeworm in switching to a new intermediate host[J]. Nature Communications, 2016, 7: 12 845.

[3] Rostami S, Salavati R, Beech R N,etal. Genetic variability of Taenia saginata inferred from mitochondrial DNA sequences[J]. Parasitology Research, 2015, 114(4): 1 365-1 376.

[4] Solano D, Navarro J C, Leónreyes A,etal. Molecular analyses reveal two geographic and genetic lineages for tapeworms, Taenia solium and Taenia saginata, from Ecuador using mitochondrial DNA[J]. Experimental Parasitology, 2016, 171: 49-56.

[5] Erickson D L, Driskell A C. Construction and analysis of phylogenetic trees using DNA barcode data[J]. Methods Mol Biol, 2012, 858: 395-408.

[6] 陳崢宏,包懷恩,牟榮,等. 云南、貴州兩省38條人體帶絳蟲的分子鑒別[J]. 中國病原生物學雜志,2010,5(04):263-265.

[7] 張晨昊, 楊毅梅. 云南西部三地帶絳蟲生物多態性分子遺傳學標記的研究[J]. 中國病原生物學雜志, 2009,4 (4): 283-286.

[8] 羅浪,楊毅梅. 云南大理白族帶絳蟲mtDNA-Cytb序列測定及分析[J]. 中國人獸共患病學報,2010,26(05):425-428.

[9] Zarlenga D S, Mcmanus D. Characterization and detection of a newly described Asian taeniid using cloned ribosomal DNA fragments and sequence amplification by the polymerase chain reaction[J]. 1991, 72(2): 174-183.

[10] Zarlenga D S, George M. Taenia crassiceps: cloning and mapping of mitochondrial DNA and its application to the phenetic analysis of a new species of Taenia from Southeast Asia[J].1996, 81(4): 604-607.

[11] 王正蓉,包懷恩. 用mtCO技術測定云南及貴州四地區的牛帶絳蟲[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2003,21(01):22-25.

[12] Cho J, Jung B K, Lim H,etal. Four cases of Taenia saginata infection with an analysis of COX1 gene[J]. Korean Journal of Parasitology, 2014, 52(1): 79-83.

B

0529-6005(2017)09-0097-03

2017-04-06

中國博士后科學基金面上項目(2014M561308)；吉林省科技廳項目(20160520180JH，20170307016NY)；吉林省教育廳項目(2016193)

蔡亞南(1980-)，男，講師，博士，主要研究方向為中草藥抗寄生蟲病研究， E-mail：caiyanan@jlau.edu.cn

趙麗娟(1992-)，女，碩士生，主要研究方向為動物寄生蟲病學， E-mail：1005676023@qq.com

注：趙麗娟和蔡亞南對本文具有同等貢獻

趙權， E-mail：zhaoquan0825@163.com