豬不同泌乳期母乳外泌體中let-7a和let-7f的差異表達研究

顧以韌, 梁 艷, 楊雪梅, 陶 璇, 鐘志君, 楊躍奎, 曾 凱, 陳曉暉, 呂學斌

(四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066)

豬不同泌乳期母乳外泌體中let-7a和let-7f的差異表達研究

顧以韌, 梁 艷*, 楊雪梅, 陶 璇, 鐘志君, 楊躍奎, 曾 凱, 陳曉暉, 呂學斌**

(四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066)

【目的】為研究miRNAs在仔豬免疫系統發育過程中的調控作用。【方法】本研究采用熒光定量PCR技術(Q-PCR)研究了不同泌乳期(0、3、7、14、21和28 d)的梅山豬和大約克夏豬母乳外泌體中let-7a和let-7f的差異表達。【結果】let-7a和let-7f在泌乳早期(0～3 d)的表達豐度明顯高于泌乳后期(7～28 d)；品種間分析顯示梅山豬母乳外泌體中let-7a和let-7f在整個泌乳期(0～28 d)的表達水平均明顯高于大約克夏豬。【結論】研究表明，let-7a 和 let-7f能夠正向調控仔豬免疫系統發育。本研究可為闡明母乳外泌體包被的miRNA在幼畜免疫系統發育過程中的具體調控機制提供基礎數據。

豬; let-7; 母乳; 外泌體

【研究意義】母乳是幼畜的主要營養來源，并含有多種與免疫相關的物質，如免疫球蛋白和乳鐵蛋白等，其在幼畜生長和免疫系統發育方面起著至關重要的作用[1-2]。【前人研究進展】miRNA是一類內源性、高度保守、長度在18～25 nt的，并通過結合到靶mRNA上參與基因轉錄后水平調控的非編碼小分子RNA，其參與細胞凋亡和脂肪代謝等多種生物學和病理學過程，并調控免疫細胞的發育[3-4]。Let-7是人類最先發現的miRNA家族，由于在疾病的發生和發展過程中起著重要作用，其被認為是脊椎動物的癌癥標記因子[5-6]。外泌體是由細胞衍生的直徑約30～100 nm的小囊泡體，其廣泛存在于動物的各種體液中，可以保護其中包被的miRNA，mRNA 和蛋白質，還能參與細胞之間信息的傳遞和遺傳物質交換[7-8]。先前研究顯示，血清、血漿、唾液和尿液等體液中外泌體包被的miRNA與不同的生理和病理狀態密切相關[9-11]，而人、牛和豬母乳外泌體包被的miRNA對新生兒免疫系統的發育具有重要調控功能[10,12-13]。【本研究切入點】本研究采用q-PCR技術對梅山豬和大約克夏豬不同泌乳階段(0、3、7、14、21和28 d)母乳外泌體中let-7a和let-7f的發育表達模式進行了系統研究。【擬解決的關鍵問題】以期闡明母乳外泌體中let-7a和let-7f在仔豬免疫系統建立過程中的調控機制。該研究將為探明外泌體包被的miRNA在免疫系統發育過程中的具體調控機制提供基礎數據，并有助于進一步闡明乳質量形成的分子機制。

表1 引物信息

注：5S, 18S和U6 snRNA為內參基因。

Note：5Sribosomal RNA, 18Sribosomal RNA, andU6 snRNA were used as endogenous control genes.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗豬只采用健康狀況良好的，分娩期相近的經產梅山母豬和大約克夏母豬各3頭，所有豬只均由四川省畜牧科學研究院科研實驗豬場提供。

1.2 樣本采集

在母豬分娩后的0(1 h內)、3、7、14、21和28 d分別采集實驗所需的豬乳樣本各2管(每管3～5 mL)，并保存在液氮中用于后續實驗。

1.3 免疫球蛋白含量的ELISA檢測

不同泌乳期的母乳樣本中IgA, IgG和IgM水平采用ELISA商業試劑盒(R&D Systems, USA)由上海恒遠生物科技有限公司檢測完成。

1.4 熒光定量PCR

1.4.1 外泌體中RNA提取 取母乳1.5 mL用2000 r/min離心10 min除去乳中的脂肪球，對上清液再次12 000 r/min離心30 min，并通過0.45 μm PVDF過濾去除細胞碎屑。吸取1 mL上清液加入500 μl ExoQuick Exosome Precipitation Solution (SBI, CA, USA)在4 條件下孵育12 h。將混合液以1500 r/min 離心30 min 獲得外泌體沉淀，將沉淀溶于250 μl nuclease-free水中。采用TRIzol-LS (Invitrogen, CA, USA)根據操作說明抽提外泌體中RNA，并通過Agilent Bioanalyzer 2100 和RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA)對抽提的RNA進行質檢。

1.4.2 QRT-PCR 采用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, China)根據操作說明將等量RNA轉錄成cDNA，采用SsoFast EvaGreen Supermix Kit (Bio-Rad, USA) 在CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad，USA)儀器上進行熒光定量檢測。每個反應體系20 μl，由10 μl SsoFast EvaGreen 混合液, 2 μl cDNA, 1 μl上下游引物和7 μl RNA-free water (Ambion, USA) 組成。5S、18S和U6作為miRNA定量的內參基因，引物信息見表1。所有目的miRNA定量結果均通過溶解曲線分析驗證PCR產物的特異性，確保產物無引物二聚體，每個樣本重復3次。采用2-ΔΔCt法計算目的miRNA的相對表達量。

1.5 統計方法

實驗數據采用Sigmaplot12.0對性狀指標和基因表達量進行ANOVA和T-test分析，相關性采用Pearson Correlation程序分析。

2 結果與分析

本研究采用ELISA 方法測定了2個豬種不同泌乳階段母乳中IgA, IgG和 IgM含量， 如圖1所示，兩豬種的母乳中富含IgA, IgG和 IgM，且發育模式相似，整體趨勢均表現為隨泌乳時間的增加而下降，且含量在3～7 d時均呈極顯著下降(P<0.01)，表明免疫球蛋白在幼畜早期免疫系統建立過程中起著更重要的作用。品種間比較顯示，梅山豬母豬中3種免疫球蛋白含量在整個泌乳階段均顯著或極顯著高于大約克夏豬 (P<0.01 或P<0.05)，這和我國地方豬種梅山豬的抗病能力強于引進豬種大約克夏豬的種質特性相一致[14]。

本研究采用Q-PCR技術對不同泌乳期母乳外泌體中let-7a和let-7f的發育性表達模式進行了研究，結果顯示，let-7a和let-7f在兩豬種母乳外泌體中的發育表達模式呈現明顯的泌乳階段特異性(圖2)，均表現為在泌乳前期(0～3 d)的表達量極顯著高于泌乳后期(7, 14, 21和28 d) (P<0.01)，其表達模式與母乳中免疫球蛋白水平的發育性變化模式一致。品種間比較顯示，整個泌乳期(0～28 d)let-7a 和 let-7f在母乳外泌體中的表達水平均表現為梅山豬高于大約克夏豬(let-7a:P0,3,7,14 d<0.01,P28 d<0.05;let-7f:P0 d<0.05,P3,7,14,21,28 d<0.01)。與之相對應的是梅山豬母乳中免疫球蛋白水平(IgA, IgG和IgM)也顯著或極顯著高于大約克夏豬。相關性分析顯示，let-7a 和let-7f在兩豬種母乳外泌體中的表達水平與免疫球蛋白含量均呈極顯著的正相關(rlet-7a>0.86,P<0.01)。

*和**分別表示同一泌乳階段不同品種間差異達顯著水平(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)；同一品種不同泌乳階段間字母相同者表示差異不顯著, 字母不同者表示差異達顯著水平(P<0.05)(小寫字母)或極顯著水平(P<0.01)(大寫字母)* P<0.05, ** P<0.01 between breeds at the same age. Different letters indicate a significant difference at P<0.05 (lowercase letter) or P<0.01 (capital letter) levels between days of the same breed圖1 兩豬種不同泌乳階段免疫球蛋白含量差異Fig.1 Immunoglobulin differences between pig breeds and age of pigs

圖2 let-7a(A) 和let-7f(B) 在不同豬種母乳外泌體中發育性表達模式Fig.2 Breed- and day-specific expression patterns of let-7a(A) and let-7f(B)

3 討 論

先前研究表明let-7a能調控炎癥相關誘導因子IL-6的信號傳導，并激活SAT3信號通路[15]；let-7f可通過靶基因A20調控機體對結核病(Mtb)的抵抗能力，并通過影響體內腫瘤壞死因子和IL-1β的含量，調控機體的免疫能力[16]。此外，let-7a和let-7f還具有調控體內B細胞和T細胞分化和影響其活性的功能，進而影響機體的免疫能力[17-18]，而母乳外泌體中的miRNAs可通過消化道進入幼畜體內發揮其對機體的免疫調控作用。本研究中不同豬種母乳中免疫球蛋白(IgA, IgG和 IgM)含量與let-7a和let-7f的表達變化呈極顯著的正相關，暗示let-7a和let-7f可影響乳質量的形成，其在外泌體的保護下進入幼畜體內，作用于靶mRNA，發揮其在新生幼畜機體免疫系統建立和完善過程中的正向調控作用。母乳外泌體中let-7a和let-7f表達水平在梅山豬整個泌乳期均高于大約克夏豬，表明梅山豬新生幼畜能夠在母乳中miRNAs的調控下更快建立起完善的機體免疫系統，這可能也是梅山豬的抗病能力強于大約克夏豬的重要原因之一。母乳外泌體中let-7a和let-7f的發育性表達模式表明初乳在初生仔豬免疫系統的建立和完善過程中比常乳起著更加重要的作用，常乳更主要作用是提供仔豬機體生長發育所需的營養物質。值得注意的是本研究中的miRNAs和免疫球蛋白水平在大約克夏豬泌乳期21 d時均出現輕微上升，推測可能是由于仔豬斷奶應急引起的。鑒于外泌體中miRNA對機體免疫系統的發育和完善具有重要的調控功能，有必要對其具體調控機制進行系統深入的研究。

4 結 論

本研究表明let-7a和let-7f能夠正向調控仔豬免疫系統發育，其在梅山豬母乳外泌體中的高表達能夠增強仔豬對疾病的抵抗能力。本研究結果可為闡明乳質量形成的分子基礎提供基礎數據，并為畜牧業中的抗病育種研究提供新的研究思路。

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ExpressionChangesofmicroRNAslet-7aandlet-7finPigMilkExosomesduringDifferentLactationPeriods

GU Yi-ren, LIANG Yan*, YANG Xue-mei, TAO Xuan, ZHONG Zhi-jun, YANG Yue-kui, ZENG Kai, CHEN Xiao-hui, LV Xue-bin**

(Sichuan Animal Science Academy, Sichuan Chengdu 610066, China)

【Objective】It is of great interest to understand the mechanism underlying breast milk quality for immune disease research.【Method】The expression changes oflet-7aandlet-7fmiRNAs were analyzed in porcine milk exosomes across the entire lactation period (newborn to 28 days after birth) by quantitative real-time PCR. 【Result】let-7aandlet-7fwere more abundant in the early lactation period (0 and 3days) than in the later lactation period (7, 14, 21 and 28 days), and were expressed at higher levels in Meishan pigs compared with Yorkshire pigs throughout the entire lactation period. 【Conclusion】This study is a preludetoin-depth investigations of the essential roles of breast milk exosome-packaged miRNAs in the development of the infant’s immune system.

Pig; let-7; miRNA; Milk; Exosomes

1001-4829(2017)5-1218-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.040

2016-06-15

國家自然科學基金(31301942)；四川省畜牧科學研究院基本科研業務費(SASA2014A08；SASA2015A01)；四川省科技支撐計劃(2014NZ0092)

顧以韌(1980-)，男，江蘇響水人，博士，研究方向為豬遺傳育種，*為共同第一作者，**為通訊作者：呂學斌，E-mail: guyiren1128@163.com。

S828

A

(責任編輯 李 潔)