參知健腦方對缺氧致認知功能障礙大鼠腦線粒體損傷的保護機制研究

吳 瓊 張淑靜 張宇晨 邢恩龍 楊傲然 胡京紅 葛東宇 黃 翔 田 昕

(1 北京中醫藥大學，北京，100029； 2 首都醫科大學附屬北京康復醫院，北京，100144)

實驗研究

參知健腦方對缺氧致認知功能障礙大鼠腦線粒體損傷的保護機制研究

吳 瓊1張淑靜1張宇晨1邢恩龍1楊傲然2胡京紅1葛東宇1黃 翔1田 昕1

(1 北京中醫藥大學，北京，100029； 2 首都醫科大學附屬北京康復醫院，北京，100144)

目的：從線粒體角度觀察參知健腦方對缺氧致認知功能障礙大鼠線粒體損傷的保護機制的研究。方法：將老年大鼠隨機分為3組，建立缺氧致線粒體損傷的認知功能障礙模型組以及參知健腦方(SZJ)干預組，并用Morris水迷宮對大鼠的學習記憶能力進行檢測。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測線粒體細胞色素氧化酶(COX)的活性、8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、β-淀粉樣前體蛋白(βAPP)及β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)的含量，觀察4個指標與認知功能障礙之間的關聯性，進而觀察缺氧對模型組腦線粒體的影響及SZJ干預組對腦線粒體的保護作用。結果：持續低壓缺氧造模腦組織中APP、Aβ1-42含量模型組與正常組、SZJ干預組間均有統計學意義(P<0.01)，8-OHdG含量模型組與正常組、SZJ干預組間比較有統計學意義(P<0.01)，SZJ干預組與正常組間比較有統計學意義(P<0.05)，COX含量正常組與模型組間比較有統計學意義(P<0.01)、模型組與SZJ干預組比較有統計學意義(P<0.05)。結論：參知健腦方可以抑制APP、Aβ1-42的積累、DNA氧化損傷、增強腦線粒體COX的活性，從而保護線粒體發揮神經保護作用，進一步改善缺氧對認知功能障礙學習記憶能力的影響為參知健腦方的臨床應用提供實驗支持。

認知功能障礙；缺氧；線粒體；參知健腦方

認知功能障礙(Cognitive Impairment，CI)是指認知功能受到不同程度的損害狀態，重者如各種類型癡呆，輕者如輕度CI等。CI在中醫文獻中無專門記載，但依據其臨床表現如記憶力下降等，可歸屬于中醫學的“癡呆”“健忘”“善忘”“呆病”等病癥范疇。癡呆病位在腦，毒邪內停為標，正氣虧虛為本，其基本病機是本虛標實、虛實夾雜。治療上應以“未病先防，既病防變”的觀點為指導，采用扶正解毒的治則，應用具有益氣養血、滋陰清熱功效的中藥復方參知健腦方(SZJ)[1]。

缺氧時，線粒體呼吸鏈電子傳遞及氧化磷酸化發生障礙，進而導致電子傳遞鏈上酶活性抑制，ATP合成減少、自由基產生增多等多種途徑損害細胞，致神經元壞死或凋亡而出現臨床認知功能下降表現[2]。前期實驗研究表明參知健腦方可明顯改善Aβ所誘導的人神經母細胞瘤細胞株的神經毒性[3]，并能有效的改善AD大鼠模型的行為學。本研究將在既往研究基礎上通過缺氧建立CI大鼠模型，觀察SZJ對缺氧致CI模型大鼠學習記憶能力、線粒體細胞色素氧化酶(COX)的活性、β-淀粉樣前體蛋白(βAPP)、β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)的含量以及8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)為標記物檢測線粒體DNA損傷。本實驗將從線粒體角度進一步觀察參知健腦方對缺氧致CI大鼠線粒體損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康老年雌性SD大鼠，11～13月齡，購自軍事科學院，許可證書號：SCXK(軍)2012-0004。本實驗過程均遵守美國國立衛生院倡導的實驗動物關懷和使用指導原則，即以減少(Reduction)、替代(Replacement)和優化(Refinement)為核心的動物實驗“3R”原則。動物飼養于北京中醫藥大學實驗動物室，溫度22 ℃，相對濕度55%～70%，自由進食飲水。

1.1.2 藥物 參知健腦方(SZJ)組分：人參、知母、赤芍，以上生藥均由北京同仁堂醫藥有限責任公司提供。全方由人參、知母、赤芍3味中藥組成，根據課題前期細胞部分[4]通過正交設計實驗篩選出的最佳配比為人參：知母：赤芍=2∶2∶1。

1.1.3 試劑與儀器 組織線粒體分離試劑盒C3606(碧云天，中國)、蛋白質定量試劑盒(BCA法)購自北京普利萊基因技術有限公司。大鼠β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)、大鼠淀粉樣前體蛋白(βAPP)、大鼠8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、大鼠細胞色素氧化酶(COX)ELISA Kit均購自CUSABIO，中國。普通氮氣由北京市氧利來科技發展有限公司提供。小白鼠缺氧裝置XBS-02改裝版由杭州艾普儀器設備有限公司提供，Morris水迷宮行為學自動觀察析系統(淮北正華生物儀器設備有限公司)。電動玻璃均漿機DY89-Ⅱ(寧波新芝生物科技股份有限公司)；高速冷凍離心機(Thermo，美國)，MK3型酶標儀(Thermo，美國)，臺式恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠)；小功率超聲破碎儀(Sonics，美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將36只健康老年雌性SD大鼠隨機分為3組，每組12只，分別是正常組、模型組、SZJ干預組。正常組(n=12)，在正常環境中以普通飼料、飲水飼養8周，每天加與SZJ干預組等體積的生理鹽水灌胃；模型組(n=12)，每日持續低壓缺氧7 h，以普通飼料、飲水飼養8周，加與SZJ干預組等體積的生理鹽水。實驗期間模型組每天進入持續低壓缺氧艙7 h，向缺氧艙內循環充入氮氣，每次循環為8 min，通過控氧儀監測缺氧艙內的氧濃度以控制輸氣和排氣裝置，使每一次循環缺氧倉內氧濃度控制在8%～10%之間進行直接缺氧造模[5]。SZJ干預組(n=12)，每日在造模前按體重灌胃中藥液(SZJ)，其余同模型組。干預組(n=12)，每日在造模前按體重灌胃中藥液(SZJ)，其余同模型組。

1.2.2 給藥方法 SZJ全方由人參、知母、赤芍3味中藥組成，根據課題前期細胞部分[4]通過正交設計實驗篩選出的最佳配比為人參：知母：赤芍=2∶2∶1，即人參24 g、知母24 g、赤芍12 g，相當于生藥2.45 g/(kg·d)據此計算出大鼠每天的灌胃量。

1.2.3 檢測指標與方法 用Morris水迷宮對大鼠的學習記憶能力進行檢測。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測線粒體細胞色素氧化酶(COX)的活性、8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、β-淀粉樣前體蛋白(βAPP)及β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)的含量，觀察4個指標與CI之間的關聯性，進而觀察缺氧對模型組腦線粒體的影響及SZJ干預組對腦線粒體的保護作用。

1.2.4 大鼠體質量及學習記憶能力的檢測 造模周期為8周，每天測量1次體重，觀察大鼠體重的變化。分別在造模的第2、4、6、8周進行Morris水迷宮檢測大鼠的認知功能，評價其學習記憶能力。Morris水迷宮裝置為一直徑為120 cm，高約70 cm的圓形桶，將第3象限設置為目標象限(Target Quadrant)在距離圓心15 cm處放置一直徑10 cm高30 cm的圓柱，此處為逃生目標區，液面在圓柱上2 cm。在整個實驗期間其位置保持不變。訓練時水溫保持在(21±1)°C左右[6]。實驗過程中水池及周圍環境保持不變。圓形桶上方150 cm處固定一攝像機全程記錄動物運動軌跡。定位航行實驗(Place Navigation)大鼠連續訓練5 d，每次實驗大鼠在4個不同象限中將頭朝池壁放入水池，每天次序不同，任其游泳，直至找到平臺。空間探索實驗(Spatial Probe)實驗第6天進行空間探索實驗，撤去平臺，將大鼠從任意一個入水點放入水中，記錄其在2 min內游泳的軌跡，計算其跨越目標象限內的“原平臺象限游泳時間/總時間、穿越平臺次數”此實驗反映大鼠的空間定向能力。

1.2.5 大鼠腦組織中線粒體提取 采用組織線粒體分離試劑盒C3606(碧云天，中國)分離出組織線粒體，嚴格按照說明書操作。第八周行為學實驗結束后迅速斷頭取腦，在預先紫外滅菌、消毒的超凈臺內，冰上取腦，完整剝離腦組織后，將雙側海馬、皮質取出稱重。用PBS洗滌組織1次，加入分離試劑A(1 mg/10 μg)，在冰浴上進行勻漿，勻漿10次左右，把勻漿在1 000 g、4 ℃離心5 min，小心把上清轉移到另一離心管中，在3 500 g，4 ℃離心10 min，小心去除上清，沉淀即為分離得到的線粒體，加入適量線粒體儲存液重懸線粒體，通常每100 mg組織獲得的線粒體可以用40 μL相應的線粒體儲存液重懸。將分離好的組織線粒體放入-80 ℃冰箱保存，待測。

1.2.6 裂解組織提取蛋白及該蛋白濃度的測定 取出分離了好的線粒體進行組織裂解提取蛋白，11 000 r/min，4 ℃離心10 min，取沉淀去上清，加入Nacl重懸，超聲破碎5次，10 s/次，計時30 min每隔5 min震蕩1次，10 000 r/min，4 ℃離心10 min取上清待用。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定線粒體中的蛋白濃度，嚴格按照說明書操作并計算濃度。

1.2.7 大鼠腦線粒體APP、Aβ1-42、COX的含量和8-OHdG損傷的檢測 將組織裂解提取出來的線粒體蛋白用酶聯免疫吸附實驗雙抗體夾心法測定COX、8-OHdG的含量。在大鼠APP、Aβ1-42、COX、8-OHdG抗體包被的微孔中分別加入含APP、Aβ1-42、COX、8-OHdG的標準品和樣品，與辣根過氧化物酶標記的APP、Aβ1-42、COX、8-OHdG抗體結合形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，溫育、洗滌、徹底洗滌后甲基聯苯胺(TMB)顯色，在反應終止前5 min內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。使用專業制作曲線軟件Curve Expert1.3進行分析，計算出樣本濃度。

2 結果

2.1 大鼠體質量變化 如圖1所示，在偶數周時進行水迷宮測試，故正常組大鼠的體重程現上下波動周期規律。模型組、SZJ干預組大鼠體重在偶數周時下降的明顯，與偶數周進行行為學檢測體力消耗有關。進行缺氧造模的模型組、SZJ干預組組大鼠的體重整體呈現降低的趨勢，但SZJ干預組下降趨勢較模型組緩和。在第七周時SZJ干預組組大鼠體重明顯回升，而模型組大鼠體重在缺氧狀態下持續降低。

圖1 大鼠體重監測趨勢

2.2 大鼠學習記憶能力的檢測 持續低壓缺氧造模第八周時空間探索環節中原平臺象限游泳時間/總時間與穿越平臺次數比較來測評大鼠的空間記憶能力。見表1。模型組與正常組、SZJ干預組間均有統計學意義(P<0.05)，可作為缺氧致大鼠CI的模型，SZJ干預組與正常組組間比較均無統計學意義。

表1 空間探索原平臺象限游泳時間/總時間、穿越平臺次數比較

注：與正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，△P<0.05

2.3 大鼠APP、Aβ1-42、COX、8-OHdG的表達檢測 持續低壓缺氧造模腦組織中APP、Aβ1-42含量濃度/腦組織蛋白濃度比較，模型組與正常組、SZJ干預組間均有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 腦組織中Aβ1-42含量濃度/腦組織蛋白濃度腦組織中APP含量濃度/腦組織蛋白濃度

注：與正常組比較**P<0.01，與模型組比較，△△P<0.01

持續低壓缺氧造模腦組織中8-OHDG含量濃度/腦組織蛋白濃度模型組與正常組、SZJ干預組間比較有統計學意義(P<0.01)，SZJ干預組與正常組間比較有統計學意義(P<0.05)，COX含量濃度/腦組織蛋白濃度正常組與模型組間比較有統計學意義(P<0.01)、模型組與SZJ干預組比較有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 腦組織中8-OHDG、COX含量濃度/腦組織蛋白濃度

注：與模型組比較，△P<0.05，與正常組比較**P<0.01，與模型組比較，▲▲P<0.01

3 討論

中醫學認為，氣是構成、維持人體生命活動最基本的物質，隨著年齡的增長，老年人陽氣逐漸衰敗，氣的推動、防御、營養、溫煦作用減弱。物質代謝速度減慢，體內產生瘀血、痰濕等病理產物，阻礙了人體的正常生理功能。《黃帝內經》中有“陽氣者，精則養神”，而氣虛會導致元神失養，神不能外馭五官九竅和機體，最終形成老年癡呆[7]。MCI為本虛標實之證，在腎、心、脾3臟虛損的基礎上，兼有痰、瘀等實邪[8]。SZJ由人參、赤芍、知母組成，人參，益氣健脾，調神益智，補充人體之精氣可增后天之源，在此用以扶正。根據中藥治療老年癡呆病的用藥頻次歸納分析可知中藥功效檢索分類中排在第一位的是人參現代研究表明人參皂苷能有效改善AD動物的認知能力、Aβ誘導細胞毒性和氧化應激水平[9-10]。芍藥，清熱涼血、散瘀止痛，在此用以散瘀涼血通腦絡，現代研究表明芍藥苷能改善AD大鼠的行為學和腦線粒體復合酶活性[11]，降低氧化應激水平對AD大鼠發揮神經保護作用[12]。知母，清熱瀉火、滋陰潤燥，在此用以清熱以祛毒，現代研究表明知母皂苷能顯著的改善Aβ誘導的癡呆大鼠的學習和記憶功能力[13]。本課題前期實驗細胞部分證實參知健腦方組分能有效的保護缺氧誘導的細胞死亡，改善線粒體DNA損傷，抑制毒性線粒體Aβ積累[4]。

AD與氧化應激密切相關，這一點已經毋庸置疑[14]，已知氧化應激的產生是由于活性氧的產生過多超出了其消除能力所致，而在眾多細胞器中，線粒體是活性氧產生的主要位點，超過90%的活性氧產生于線粒體，其中線粒體電子傳遞鏈的復合體Ⅰ和復合體Ⅲ是活性氧產生的主要位點，故而線粒體特別易受氧化應激的損傷。另外，從一些研究報道[15-16]可知，Aβ與磷酸化的Tau蛋白作為AD的重要病理特征，其在增加活性氧的產生，提高AD的氧化應激水平也發揮了作用。考慮到Aβ和磷酸化的Tau蛋白可以直接引起線粒體功能障礙，從以上兩點很容易懷疑氧化應激可以引起線粒體功能障礙，氧化應激使蛋白、脂質和核酸過氧化[17]。氧化應激除了引起mtDNA和線粒體能量代謝相關的損傷，也引起了線粒體動力學相關的損傷[18]。由于氧化應激對線粒體各方面的損傷作用，故而可知氧化應激確實可以導致線粒體功能障礙。mtDNA易受到活性氧的損傷，損傷的mtDNA主要表現為mtDNA點突變、缺失及同源異型性或異質性改變[19]。研究[20-21]認為mtDNA的突變與老化密切相關，mtDNA與CI也有著密切關系。

本實驗為避免藥物因素對缺氧致CI模型的干擾選取自然衰老的老年鼠為實驗對象。實驗中制造缺氧的老年動物模型，可造成大鼠的體重持續緩和下降，水迷宮空間探索顯示持續低壓缺氧可造成空間記憶能力受損傷，而SZJ可從多靶點發揮對線粒體的保護機制，改善空間記憶能力。老齡動物腦組織內可出現淀粉樣斑塊以及學習記憶衰退[22]。大量體外實驗表明Aβ主要通過線粒體途徑引起神經元凋亡[23]。不論是在體內還是體外，Aβ神經毒引起的死亡和誘導的神經細胞凋亡都已經被證實[24]。而本實驗中持續缺氧導致APP、Aβ1-42含量增多，而過度表達的APP會影響線粒體蛋白輸運通道的正常運行，從而導致線粒體功能紊亂。其中在Aβ的神經毒性中占據主導地位[25]的Aβ1-42，在缺氧時刺激線粒體膜并導致其通透性增加，位于線粒體膜內的細胞色素C釋放到細胞質中，作為細胞凋亡誘導因子，促使神經元細胞凋亡導致大鼠則出現一系列的CI。8-羥基脫氧鳥苷作為DNA氧化損傷產物是廣泛用于研究疾病中氧化損傷機制的關鍵標志物[26]，缺氧導致8-OHdG產量增多即氧化損傷產物增多，造成mtDNA缺失或突變，缺氧產生的8-OHdG越多對大鼠的認知功能影響越大。

綜上所述，本實驗研究表明SZJ可以抑制APP、Aβ1-42的積累，增強線粒體細胞色素氧化酶(COX)的活性并減緩DNA氧化損傷，從而發揮對線粒體的作用，進一步改善缺氧對CI學習記憶能力的影響，為SZJ的臨床應用提供實驗支持，為中藥治療CI提供了新思路。SZJ對缺氧模型線粒體雖有一定保護的作用，但是對于缺氧造成的氧化損傷的保護作用不明顯，說明缺氧致mtDNA缺失或突變可能是不可逆的，SZJ能否從多靶點改善線粒體DNA的損傷及其機制還有待進一步研究。

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StudyontheProtectiveMechanismofShenzhiJiannaoFangonMitochondrialInjuryofRatswithCognitiveImpairmentInducedbyHypoxia

Wu Qiong1, Zhang Shujing1, Zhang Yuchen1, Xing Enlong1, Yang Aoran2, Hu Jinghong1, Ge Dongyu1, Huang Xiang1, Tian Xin1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijng100029,China; 2BeijingRehabilitationHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100144,China)

Objective:To observe the protective mechanism of Shenzhi Jiannao (SZJN) on mitochondrial injury rats with cognitive impairment induced by hypoxia.MethodsThe aged rats were randomly divided into three groups to establish cognitive impairment model groups of mitochondrial injury induced by hypoxia, and SZJN intervention group, and the learning and memory abilities of rats were detected by Morris water maze.ELISA was used to measure the activity of mitochondrial cytochrome oxidase (COX), and contents of 8-OHdG, β-APP and Aβ1-42.The correlation between the 4 indexes and cognitive dysfunction was observed to further observe the effect of hypoxia on the mitochondria of the model group and the protective effect of SZJN intervention group on cerebral mitochondria.ResultsIn brain tissue of models induced by continued hypobaric hypoxia, the contents of APP and Aβ1-42 in model group had significant difference when compared with normal group and SZJN intervention group.The content of 8-OHdG in model group was significantly different when compared with normal group and SZJN intervention group (P<0.01), and that of SZJN intervention group was significantly different when compared with normal group (P<0.05).There was a significantly difference in the content of COX when compared between normal group and model group (P<0.01), and was also significantly different between model group and SZJN intervention group (P<0.05).ConclusionShenzhi Jiannao Fang could inhibit the accumulation of APP, Aβ1-42 and DNA oxidative damage, strengthen the activity of mitochondrial COX, so that can protect the neuroprotective effect of mitochondria to further improve the effect of hypoxia on learning and memory of cognitive impairment, providing experimental support for clinical application of SZJN.

Cognitive impairment; Hypoxia; Mitochondria; Shenzhi Jiannao Fang

國家自然科學基金項目(81202684)

吳瓊(1991.03—)，女，醫學碩士，醫師，北京中醫藥大學在讀碩士研究生，研究方向：中醫藥防治心腦血管病的機制研究，E-mail：772007609@qq.com

田昕(1978.06—)，女，醫學博士，副主任醫師，北京中醫藥大學副教授，研究方向：中醫藥防治心腦血管病的機制研究，E-mail：tianxin0618@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.033

(2016-12-25收稿 責任編輯：徐穎)