超聲波輔助提取靈芝三萜工藝研究

康同輝　張一凡　解婉瑩　王涵　席春俠　舒彥宇　袁媛

摘要：采用超聲波輔助提取靈芝三萜，基于單因素試驗結果，以靈芝三萜得率為評價指標，采用正交試驗方法優化靈芝三萜提取工藝條件。結果表明，在乙醇濃度85%、超聲時間15 min、超聲溫度80 ℃、料液比1∶25的條件下，靈芝三萜得率最高、為2.19%。

關鍵詞：靈芝；三萜；超聲波；提取；優化；正交試驗

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2017）06-0041-03

靈芝又稱靈芝草、仙草、瑞草，在藥物領域中已有2000多a的使用歷史，是我國最著名的高等藥用真菌。靈芝具有抗腫瘤、調節免疫、鎮靜鎮痛、抗肝損傷、改善記憶、降脂、抗輻射、降血糖、抗血栓、抗疲勞等藥理作用。靈芝不僅具有廣泛的藥用價值，因其無毒、無害、無副作用，在食品領域也早有應用，是一種極佳的藥食兩用物質。靈芝中的多糖、三萜、生物堿、核苷等有效成分是靈芝發揮治療作用的物質基礎。但靈芝三萜的含量相對較低，對照品也很難獲得，且在提取過程中不穩定。因此，需要尋求一種切實可行的方法來提高靈芝三萜得率。本研究采用超聲波法對靈芝三萜提取工藝條件進行優化，以期為靈芝三萜的工業化生產及其產品的深度開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝：吉林敖東世航產業股份有限公司；齊墩果酸標準品：沈陽市國藥試劑有限公司；無水乙醇、冰乙酸、香草醛、高氯酸、乙酸乙酯均為分析純。

1.2 儀器設備

WFZUV-2000型紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；AXTD5A型臺式低速離心機：鹽城市安信實驗儀器有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；TB-114型電子天平：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200DB型數控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 靈芝三萜提取工藝流程 取適量靈芝烘干→粉碎→準確稱取適量靈芝粉末→加入乙醇→超聲輔助浸提→真空抽濾→濾液濃縮→干燥，即得靈芝三萜。

1.3.2 標準曲線繪制 準確稱取5.0 μg齊墩果酸標準品于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇，定容，即得母液。精確吸取母液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL分別置于試管中，以試劑為空白參比，沸水浴揮發去除溶劑，揮發完全后加入0.4 mL 5%香草醛—冰乙酸和1.6 mL高氯酸，搖勻后將試管置于70 °C水浴鍋中加熱處理15 min，取出后用冰水快速冷卻至室溫，再加入8 mL乙酸乙酯，混勻，在560 nm處測定吸光度值。以齊墩果酸濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，得到：y=8.323 5 x-0.047 8，R2=0.999 7，線性關系良好。

1.3.3 靈芝三萜測定 精密稱取靈芝三萜粉末1 g，加入乙醇，采用超聲波提取，抽濾，準確吸取無水乙醇和三萜濾液各1 mL于試管中，按1.3.2中方法測定560 nm處的吸光度，根據標準曲線計算待測液中的三萜含量Y，利用下式計算三萜得率。

三萜得率（%）={（Y/1 000）/[（m/50） ×V]} ×100

式中：m為樣品質量，mg；V為吸取濾液的體積，mL；Y為靈芝三萜含量，μg。

1.3.4 單因素試驗 在其他條件相同的情況下，分別考察乙醇濃度（55%，65%，75%，85%，95%），料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶45），超聲溫度（40，50，60，70，80 °C），超聲時間（5，15，25，35，45 min），超聲功率（50，140，160，180，200 W）對靈芝三萜得率的影響。

1.3.5 正交試驗 在單因素試驗結果的基礎上，以靈芝三萜得率為指標，進行L9（34）正交試驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對靈芝三萜得率的影響 不同乙醇濃度下靈芝三萜得率如圖1所示。

由圖1可以看出：靈芝三萜得率隨乙醇濃度升高而提高。當乙醇濃度為55%時，靈芝三萜得率僅為0.29%；當乙醇濃度為95%時，靈芝三萜得率最高，為1.69%；而乙醇濃度在85%～95%之間時，靈芝三萜得率非常相近。

2.1.2 料液比對靈芝三萜得率的影響 不同料液比下靈芝三萜得率如圖2所示。

由圖2可以看出：在料液比為1∶30時，靈芝三萜得率最高，為1.71%；當料液比小于1∶30時，溶劑量過少，樣液過于粘稠，不利于超聲波空化作用的產生，也不利于超聲波在溶劑中的傳播擴散，所以提取率相對較低；隨著料液比的增大，靈芝三萜得率提高，但是當料液比超過1∶30時，可能因溶劑量過大反而影響了超聲波對靈芝細胞的破碎，進而影響了機械學和熱力學作用，導致靈芝三萜得率降低。

2.1.3 超聲溫度對靈芝三萜得率的影響 不同超聲溫度下靈芝三萜得率如圖3所示。

由圖3可以看出：當超聲溫度在40～50 ℃之間時，靈芝三萜得率隨溫度升高而提高；而溫度在50～70 ℃之間時，靈芝三萜得率增幅較小；當溫度為70 ℃時，靈芝三萜得率最高，為2.09%。說明隨著超聲溫度的升高，分子運動愈發劇烈，加快了靈芝三萜的擴散和溶劑向靈芝內部的滲透，促進了細胞內三萜的浸出。

2.1.4 超聲時間對靈芝三萜得率的影響 不同超聲時間下靈芝三萜得率如圖4所示。

由圖4可以看出：當超聲時間為25 min時，靈芝三萜得率最高，為1.95%；當超聲時間少于25 min時，靈芝三萜得率隨超聲時間延長而增大；但當超聲時間超過25 min后，靈芝三萜得率反而降低，其原因可能是長時間的超聲處理破壞了靈芝三萜的結構。endprint

2.1.5 超聲功率對靈芝三萜得率的影響 不同超聲功率下靈芝三萜得率如圖5所示。

由圖5可以看出：當超聲處理功率為150 W時，靈芝三萜得率最高，為1.81%；功率過小，超聲波振動幅度過小，靈芝細胞壁破碎不完全，三萜溶出不徹底；功率過大，則造成溶液分子運動加劇，反而使得率略降低。說明過高或過低的超聲波功率均不利于靈芝三萜的提取。

2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以乙醇濃度（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、料液比（D）為自變量，以靈芝三萜得率為評價指標，進行正交試驗，結果見表1。

由表1可知，各因素對靈芝三萜提取得率影響的主次順序為C>A>B>D，即超聲溫度>乙醇濃度>超聲時間>料液比，其中超聲溫度的影響最大，料液比的影響最小。由正交試驗得到最佳工藝組合為A3B1C3D1。

2.3 最佳工藝條件驗證

根據正交試驗結果，對工藝組合A3B1C3D1和A3B1C3D2進行驗證。結果為工藝組合A3B1C3D1的得率（2.19%）高于A3B1C3D2的得率（2.13%），表明正交試驗方法優化得到的靈芝三萜提取工藝條件可靠，最佳工藝條件為乙醇濃度85%、超聲時間15min、超聲溫度80 ℃、料液比1∶25。

3 結論

本研究以靈芝為原料，通過單因素試驗和正交試驗設計，確定超聲波輔助乙醇浸提靈芝三萜的最佳工藝條件。試驗結果表明，各因素對三萜提取影響程度大小順序為超聲溫度>乙醇濃度>超聲時間>料液比，最佳工藝條件為乙醇濃度85%、超聲時間15min、超聲溫度80 ℃、料液比1∶25，此時靈芝三萜得率為2.19%。該方法具有工藝簡單、提取率高、便于工業化生產等優點，可為靈芝三萜產品的深度開發提供理論依據。

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