檸檬苦素的抗氧化與抑菌效果研究

章斌，侯小楨，鄧其海，丁心，陳曉蕓，秦軼，張海鑫

（1.韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院，廣東潮州521041；2.廣東中興綠豐發(fā)展有限公司，廣東河源517000）

檸檬苦素的抗氧化與抑菌效果研究

章斌1，侯小楨1，鄧其海2，丁心2，陳曉蕓1，秦軼2，張海鑫1

（1.韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院，廣東潮州521041；2.廣東中興綠豐發(fā)展有限公司，廣東河源517000）

采用有機溶劑法提取尤力克檸檬果皮和果籽中的檸檬苦素并測定其含量，并對其抗氧化與抑菌活性進行研究。試驗結(jié)果表明：檸檬籽較檸檬皮含更多苦素類化合物，且籽提取液中所含檸檬苦素的濃度為2.766 4×10-1mg/mL；檸檬皮提苦素物和檸檬籽提苦素物對DPPH自由基的清除作用不明顯，試驗條件下的抑制率最高僅為14.58%，遠低于同濃度特丁基對苯二酚（tert-Butylhydroquinone，TBHQ）；2 mg/mL用量的提取液對豬油貯藏期有一定延緩效果。抑菌活性試驗結(jié)果表明從檸檬皮和檸檬籽中提取的苦素物質(zhì)對大腸桿菌、根霉、枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，兩者均對枯草芽胞桿菌的抑菌效果最好，且皮提苦素物和籽提苦素物對枯草芽胞桿菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）分別均為0.5 mg/mL和0.75 mg/mL。

檸檬；檸檬苦素；抗氧化；抑菌

檸檬苦素是廣泛存在于檸檬等柑橘屬水果皮和籽中的一類功能性化合物，具有抗腫瘤[1]、抗病毒[2]、抑菌[3]、鎮(zhèn)痛抗炎[4]等多種生物活性，是生產(chǎn)藥物、功能性食品的主要原料或配料成分之一。

廣東是我國尤力克檸檬的主產(chǎn)地之一，伴隨檸檬加工而大量產(chǎn)生的皮籽等副產(chǎn)物，對其進行檸檬苦素、精油等功效成分開發(fā)是高值化綜合利用的有效途徑之一。因此，本試驗以尤力克檸檬為試材，提取果皮和果籽中的苦素類化合物，并探討其抗氧化與抑菌效果，旨在為檸檬苦素的應(yīng)用及檸檬加工副產(chǎn)物的綜合利用提供一定試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬：廣東中興綠豐發(fā)展有限公司順天鎮(zhèn)檸檬種植基地；枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、根霉、黑曲霉：韓山師范學(xué)院微生物實驗室。DPPH：Sigma公司；丙酮、石油醚、抗壞血酸、焦性沒食子酸、牛肉膏、蛋白胨、氫氧化鈉、鹽酸、碘化鉀、乙酸，硫代硫酸鈉、異辛烷、檸檬苦素標(biāo)準品等（均為分析純）：上海金穗生物科技有限公司。生育酚（Tocopherol，VE）：食品級。

HWS-24型電熱恒溫水浴鍋、LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；AUW120型電子分析天平：日本島津公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；高效液相色譜儀1200系列：安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檸檬苦素提取[5-6]

取檸檬皮和檸檬籽于45℃烘干后粉碎并過80目篩，用索氏抽提法去脂質(zhì)；然后將去脂質(zhì)后的檸檬皮粉末和檸檬籽粉末用丙酮浸泡24 h后，70℃條件下水浴回流提取2 h。

1.2.2 檸檬苦素含量的測定[7-8]

配制 2.00、1.00、0.50、0.25、0.125、0.012 5 mg/mL的檸檬苦素標(biāo)準液備用；并將檸檬皮粗提物溶液與檸檬籽粗提物溶液用針孔式濾膜進行過濾備用。色譜條件：流動相為乙腈-水（體積比為 45∶55），流速 1.00 mL/min，柱溫25℃，檢驗波長210 nm，進樣量10 μL。

1.3 抗氧化活性試驗

1.3.1 DPPH自由基清除率的測定[9]

用 95%乙醇配制 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的檸檬皮粗提物溶液、檸檬籽粗提物溶液、檸檬苦素標(biāo)準品溶液、TBHQ溶液、VC溶液各15 mL為樣品液；精確吸取上述各濃度溶液2 mL，分別加入2 mL 0.1mmol/L的DPPH溶液，搖勻并放置30min，于517nm處測定吸光度A；同時測定2 mL上述溶液與2 mL 95%乙醇混合液的吸光度A0，及2 mL DPPH溶液與2 mL 95%乙醇混合液的吸光度A1，按下式計算清除率：

1.3.2 膜脂質(zhì)（豬油）抗氧化試驗

取2 mg/mL的檸檬皮粗提物溶液、檸檬籽粗提物溶液、焦性沒食子酸液和VE液各5 mL于50.00 g豬油中，攪拌均勻，置于60℃電熱恒溫烘箱，每4小時定時攪拌，并做空白試驗，每隔2天取樣測定過氧化值（Peroxide value，POV）；測定和計算方法按GB 5009.227-2016《食品安全國家標(biāo)準食品中過氧化值測定》的規(guī)定進行。

1.4 抑菌活性試驗

1.4.1 抑菌圈的測定[10-11]

取直徑6 mm滅菌后的濾紙片，分別放入檸檬皮抽提液、檸檬籽抽提液（2 mg/mL）中浸泡12 h；吸取0.1 mL濃度為106cfu/mL的懸菌液，均勻涂布于已制備好的培養(yǎng)基中；然后將濾紙片貼在含菌的平板培養(yǎng)基上，每皿4片，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察。同時用丙酮做空白試驗，測定抑菌圈直徑。

1.4.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定[3]

用丙酮配制 2.00、1.75、1.5、1.25、1.00、0.75、0.50 mg/mL的檸檬苦素粗提物溶液，并各取2.0 mL加入到培養(yǎng)基中混勻凝固，然后對各供試菌進行平板劃線，按各菌種相應(yīng)的適宜生長溫度條件培養(yǎng)觀察，以完全不長菌的最低提取物濃度為該提取物的最低抑菌濃度。

1.4.3 最小殺菌濃度（MBC）的測定

取檸檬苦素抽提液濃度大于等于MIC的培養(yǎng)皿，繼續(xù)在相應(yīng)溫度條件下培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況，以不長菌的最低抽提液濃度為最小殺菌濃度（MBC）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準偏差SD表示，用SAS 8.1統(tǒng)計軟件進行一維方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬苦素含量測定

檸檬苦素標(biāo)準品、檸檬皮抽提液和檸檬籽抽提液的色譜檢測圖分別如圖1、圖2和圖3所示。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of limonin standard substance

圖2 檸檬皮提取物的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of lemon peel extract

圖3 檸檬籽提取物的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of lemon seed extract

對照圖1出峰時間，圖2和圖3中在同樣的保留時間7.920 min時均各出現(xiàn)一個峰面積，說明檸檬皮抽提液和檸檬籽抽提液中均含檸檬苦素；運用外標(biāo)法測得檸檬皮抽提液和檸檬籽抽提液中的檸檬苦素濃度分別為 1.832 6×10-1mg/mL 和 2.766 4×10-1mg/mL。

2.2 檸檬苦素的抗氧化活性

2.2.1 膜脂質(zhì)（豬油）抗氧化作用

豬油在不同抗氧化劑作用下的POV值見圖4。

圖4表明，添加有抗氧化劑和檸檬苦素抽提液的豬油的POV值上升相對較慢，且檸檬皮提物和籽提物的豬油脂質(zhì)抗氧化活性介于VE和焦性沒食子酸之間。另外，VE因其良好的油溶性、熱穩(wěn)定性和氧穩(wěn)定性，使得試驗期間的豬油POV值增幅不大；而檸檬苦素對光和熱較敏感，易發(fā)生多酚結(jié)構(gòu)和取代基團改變后的抗氧化能力下降[12-13]，因而添加檸檬皮提物和籽提物的豬油POV值在第10天后開始大幅度上升。

圖4 豬油在不同抗氧化劑作用下的POV值Fig.4 POV of lard under different antioxidants

2.2.2 對DPPH自由基的抑制作用

檸檬苦素粗提物和TBHQ清除DPPH自由基能力見圖5。

圖5 檸檬苦素粗提物和TBHQ清除DPPH自由基能力Fig.5 Ability of limonin and TBHQ scavenging DPPH free radical

從圖5可看出，TBHQ對DPPH自由基的抑制作用隨濃度增大的變化不大，穩(wěn)定在52%～62%之間；檸檬皮提物和籽提物的DPPH自由基抑制率盡管有隨濃度增大而相應(yīng)增強的趨勢，但總體抑制作用不明顯，在試驗濃度范圍內(nèi)，皮提苦素物和籽提苦素物的DPPH自由基抑制率最高僅為14.58%和6.48%，且皮提苦素物較籽提苦素物表現(xiàn)出更好的DPPH自由基抑制效果。

另一方面，盡管測得檸檬籽中的苦素類化合物含量高于皮提物，但檸檬皮提物中可能含有的精油、黃酮等化合物同樣具有較強的抗氧化活性，因而檸檬皮提物的總體抗氧化活性高于籽提物；圖4和圖5的曲線走向較直觀地說明了這一點。同時，Jun Y[14]對提取于柑橘中的檸檬苦素的DPPH自由基抑制作用結(jié)果表明其清除率僅為0.5%；Breksa[15]的研究結(jié)果同樣表明0.001 mg/mL～1.0 mg/mL濃度的檸檬苦素類化合物清除DPPH自由基的效果不顯著。而本試驗中的檸檬皮提苦素物和籽提苦素物的DPPH自由基抑制效果較他們的試驗結(jié)果顯著，也可能是與提取物中含有少量的酚類、黃酮類等化合物有關(guān)。

2.3 檸檬苦素的抑菌活性

研究表明：檸檬苦素化合物受其原料來源、原料部位、化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)成和含量濃度等多因素影響，對不同微生物的抑菌效果差別較大：如從枸橘中提取分離的檸檬苦素對單增李斯特菌有較佳的抑制作用，且其最小抑菌濃度介于 15.62 μg/mL～62.5 μg/mL[16]。從柑橘籽中提取的檸檬苦素在1.0 g/L條件下對地衣芽孢桿菌和枯草芽抱桿菌的抑制效果較好，而對大腸桿菌、毛霉、金黃色葡萄球菌、黑曲霉幾乎沒有抑制作用[17]；降解性檸檬苦素類化合物梣酮、9-β-羥基梣酮均對黃瓜黑星菌的生長具有抑制作用[17]。

檸檬皮提苦素的抑菌效果見表1，檸檬籽提苦素的抑菌效果見表2。

表1 檸檬皮提苦素的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effects of limonin from lemon peel

表2 檸檬籽提苦素的抑菌效果Table 2 Antimicrobial effects of limonin from lemon seed

從表1和表2的抑菌圈直徑測定結(jié)果來看，檸檬苦素提取物對大腸桿菌、根霉、枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制效果，與羅水忠[6]從柑橘籽中所提檸檬苦素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉的抑制作用研究結(jié)果有一定差別。綜合MIC和MBC測定結(jié)果，檸檬皮中苦素粗提物抑制作用的強弱次序為枯草芽胞桿菌＞大腸桿菌＞根霉＞黑曲霉＞金黃色葡萄球菌；檸檬籽中苦素粗提物抑制作用的強弱次序為枯草芽胞桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞根霉＞黑曲霉。

檸檬苦素類化合物中的呋喃環(huán)已被證明是其抗菌的必要功能基團[18]，但也可能還存在其它具有較好抑菌功效的基團；因此，檸檬苦素化合物對微生物的抑菌效果及具體的抗菌機理有待繼續(xù)深入研究。

3 結(jié)論

1）經(jīng)有機溶劑法萃取所得的檸檬皮提物和檸檬籽提物中分別含有1.832 6×10-1mg/mL和2.766 4×10-1mg/mL的檸檬苦素類化合物。

2）提取于檸檬皮和檸檬籽中的苦素類化合物對DPPH自由基的清除作用不明顯，遠低于TBHQ；但在2 mg/mL用量下對豬油貯藏期有一定延緩效果。

3）檸檬苦素化合物對幾種代表性細菌和真菌有一定的抗菌活性，其中檸檬皮提苦素物對枯草芽胞桿菌的抑制效果最強，對金黃色葡萄球菌的抑制效果最差；而檸檬籽提苦素物對枯草芽胞桿菌的抑制效果最強，而對黑曲霉的抑制效果最差。

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Study on Antioxidant and Antibacterial Activities of Limonins

ZHANG Bin1，HOU Xiao-zhen1，DENG Qi-hai2，DING Xin2，CHEN Xiao-yun1，QIN Yi2，ZHANG Hai-xin1
（1.School of Food Engineering and Biotechnology，Hanshan Normal College，Chaozhou 521041，Guangdong，China；2.Guangdong Zhongxing Lvfeng Development Co.，Ltd.，Heyuan 517000，Guangdong，China）

Limonins from Eureka lemon peel and lemon seed was extracted by organic solvent method and its content was determined，meanwhile，antioxidant and antibacterial activities of limonins in vitro were explored in this paper.Results showed that lemon seeds contain more limonins than lemon peel，the concentratin of the citrate contained in lemon seeds reached 2.766 4×10-1mg/mL；limonoids from lemon peel and seeds had no significant scavenging effects on DPPH free radical，the highest clearance rate under experimental conditions reached only 14.58%，far lower than that of the same concentration of TBHQ.Meanwhile，limonins extracted from lemon peel and lemon seeds had a certain delaying effect on storage period of lard under dosage of 2 mg/mL.Antibacterial activity test results indicated that Limonins extracted from lemon peel and lemon seed exhibited certain antibacterial effects onEscherichia coli，Rhizopus，Bacillus subtilisandStaphylococcus aureusand both showed a best efficiency for Bacillus subtilis with MIC and MBC were 0.5 mg/mL and 0.75 mg/mL respectively.

lemon；limonins；antioxidant activity；antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.001

國家星火計劃項目（2015GA780044）；廣東省"揚帆計劃"引進創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團隊專項資助（2015YT02H049）；廣東省科技計劃項目（2012A020603008）；廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項目（2012B091000074）；廣東普通高校工程技術(shù)開發(fā)中心項目“粵東食品加工與安全控制工程技術(shù)開發(fā)中心”（GCZX-A1415）；潮州市重點農(nóng)業(yè)科技項目（201605）

章斌（1981—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。

2017-08-04