響應面法對核桃粕中蛋白質提取工藝的優化

安傳相，畢遠林，裴璞花，馬立志，2，*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州貴陽550005）

響應面法對核桃粕中蛋白質提取工藝的優化

安傳相1，畢遠林1，裴璞花1，馬立志1，2，*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州貴陽550005）

核桃蛋白是一種營養平衡的蛋白質，其營養價值與動物蛋白相近。采用微波輔助NaOH提取核桃粕中的蛋白質，研究液料比、NaOH濃度、溫度、時間各單因素對核桃蛋白提取率影響。在單因素篩選的條件下，利用響應面優化核桃粕中蛋白質的提取工藝，確定較佳的提取工藝條件：液料比40∶1（mL/g）、NaOH濃度0.08%、提取溫度58℃、時間110 min，核桃蛋白提取率高達56.51%。

響應面；核桃；超聲波；蛋白質

核桃（Juglans regiaL.）又名胡桃、羌桃，系胡桃科核桃屬植物[1]。它與扁桃、腰果、榛子并列為世界四大干果[2]。核桃中核桃仁的油脂含量高達65%左右，其中大部分為不飽和脂肪酸，主要由軟脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸組成，另外核桃仁中還含有約15%的蛋白質[3]。蛋白質是構成生命的物質基礎。其作為生命活動的主要承擔者，擔負著新陳代謝、免疫保護和酶的催化等多種生理功能，并在生物體的生命活動和幾乎所有的生物過程中起著至關重要的作用[4]。蛋白質的營養價值取決于其中氨基酸的種類和含量。核桃蛋白作為一種優質植物蛋白，含有18種氨基酸，其中含有8種人體所必需的氨基酸，8種必需氨基酸的含量比例合理，接近聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）規定的標準氨基酸配比[5]。近年來已有相關文獻報道了核桃粕中蛋白質的提取工藝[6-7]，但提取率相對較低，不能有效的利用核桃粕中的蛋白質，造成寶貴資源的浪費。因此本研究以核桃粕為原料，應用超聲波對蛋白質進行輔助提取，為開發核桃蛋白產品，對實現核桃粕的綜合利用、提高副產物的附加值以及延長核桃產業鏈具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

1.1.1.1 原材料

核桃（黔產5號）：貴州省畢節市赫章縣產。

1.1.1.2 化學試劑

考馬斯亮蘭G-250：天津市登科化學試劑有限公司；牛血清蛋白：北京中生瑞泰科技有限公司；氫氧化鈉：成都金山化學試劑有限公司；硫酸銅：宜興市化學試劑廠；硫酸鉀：天津市天力化學試劑有限公司；硼酸：天津市優譜化學試劑有限公司；甲基紅、亞甲基藍：天津市科密歐化學試劑有限公司；濃硫酸：北京化工廠；85%磷酸：重慶川東化工（集團）有限公司；95%乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

6YZ-180液壓榨油機：河南源通機械設備有限公司；FA2104萬分之一電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；DL-5-B飛鴿牌系列離心機：上海安亭科學儀器廠；WBZ-PPLC智能靜態微波真空干燥機：南京杰全微波設備有限公司；PHB-4雷磁牌數字型PH計：上海精科雷磁公司；KQ-500DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計：島津公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質的含量測定

采用凱氏定氮法（GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》）。

1.2.2 蛋白質含量標準曲線的繪制

1）考馬斯亮蘭G-250試劑的制備[8-9]。

2）標準蛋白質溶液（0.1 mg/mL）：稱取 10 mg牛血清蛋白（Albumin from bovine serum，BSA），用蒸餾水定容至100 mL。

3）標準曲線的回歸方程的建立[10]。

1.2.3 核桃蛋白提取率的測定

蛋白質的提取率以浸出率為指標，蛋白質浸出率按照以下公式計算。

式中：X 為浸出率，%；M1為核桃粕質量，g；M2為浸出的蛋白質質量，g。

1.2.4 單因素對核桃蛋白提取的影響

分別以不同的提取方式、液料比、NaOH濃度、提取溫度及時間為單因素，考察各因素對核桃蛋白提取率的影響。

1.2.4.1 浸提方式對核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），溫度40℃，0.08%NaOH溶液，分別采用常溫、水浴、磁力攪拌器和超聲波的方法分別對脫脂核桃粕浸提70 min，4 000 r/min離心20 min，去油層及沉淀并過濾，取0.5 mL濾液定容100 mL。以蛋白質浸出率為指標，確定較佳的提取方式。

1.2.4.2 料液比對核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在溫度40℃，0.08%NaOH 溶液，分別按液料比為 20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1（mL/g）的條件下對核桃粉超聲波浸提70 min，4 000 r/min離心20 min，確定料液比對提取核桃蛋白率的影響。

1.2.4.3 NaOH濃度對核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），溫度40℃，分別用0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%NaOH溶液超聲波方法浸提70 min，4 000 r/min離心20 min，并測定蛋白質的含量以蛋白質浸出率為指標，確定NaOH溶液濃度對提取核桃蛋白率的影響。

1.2.4.4 溫度對核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），NaOH 溶液濃度 0.08%、溫度分別為 30、40、50、60、70、80℃條件下用超聲波方法浸提70 min，4 000 r/min離心20 min，確定浸提溫度對提取核桃蛋白率的影響。

1.2.4.5 時間對核桃蛋白提取率的影響

稱取約2.0 g脫脂核桃粕，在液料比30∶1（mL/g），溫度40℃，0.08%NaOH溶液，采用超聲波輔助的方法分別對脫脂核桃粕浸提30、50、70、90、110、130 min，4 000 r/min離心20 min，以蛋白質浸出率為指標，確定浸提時間對提取核桃蛋白率的影響。

1.2.5 響應面法優化核桃蛋白的提取

在單因素試驗的基礎上，運用Design-Expert8.0軟件程序根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用四因素三水平，以核桃蛋白的提取率為響應值，對核桃蛋白提取條件進行優化。因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels coding table

1.2.6 驗證性試驗

在響應面優化條件下，進行驗證性試驗，與理論預測值進行比較，以驗證優化結果。

2 結果與分析

2.1 蛋白質的含量測定

蛋白質的含量測定結果見表2。

表2 蛋白質含量Table 2 The content of protein

2.2 標準曲線回歸方程的建立

蛋白質含量標準曲線如圖1所示，線性關系良好。此標準曲線的回歸方程y=5.512 6x+0.013 1，R2=0.996 7，說明牛血清蛋白（Albumin from bovine serum）在0~0.1 mg/mL范圍內所呈現的線性關系良好。

圖1 蛋白質標準曲線Fig.1 Standard curve of protein

2.3 單因素試驗

2.3.1 不同的輔助方式對核桃蛋白提取率的影響

不同的輔助方式對核桃蛋白提取率的影響見表3。

表3 不同的輔助方式對核桃蛋白提取率的影響Table 3 Effect of different assistant methods on the extraction rate of walnut protein

由表3可知，采用超聲波進行輔助提取時，核桃蛋白的提取率最高，可以達到33.51%，其他輔助提取方式都較小。故選取超聲波作為核桃蛋白的輔助提取方式，在以下試驗中，均以超聲波為核桃蛋白的輔助提取方式。

2.3.2 液料比對核桃蛋白提取率的影響

液料比對核桃蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對提取率的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on extraction rate

從圖2可知，在一定的范圍內，液料比越大，越利于蛋白質的溶解。當達到一定程度時，蛋白質的溶出率達到動態平衡。若提取液的體積大，增加后續離心工作量。當液料比達到40∶1（mL/g）時核桃蛋白的提取率不再明顯提高，綜合考慮，選擇料液比30∶1、40∶1、50 ∶1（mL/g）3 個水平。

2.3.3 NaOH濃度對核桃蛋白提取率的影響

改變NaOH的濃度，核桃蛋白提取率變化如圖3所示。

圖3 NaOH濃度對提取率的影響Fig.3 Effect of NaOH concentration on extraction rate

當濃度高于0.08%時，核桃蛋白的提取率反而下降。是由于堿性太強會使蛋白質變性，而且還會產生異味，因此NaOH的濃度在0.08%左右比較合適。

2.3.4 溫度對核桃蛋白提取率的影響

溫度對核桃蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 溫度對提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction rate

從圖4可以看出，在一定范圍內，隨著溫度的升高提取率升高，當溫度超過60℃時，提取率開始下降，是由于核桃蛋白的變性溫度為67℃左右[11]，超過這個溫度提取率會大大降低，因而核桃蛋白最佳提取溫度應控制在60℃左右。

2.3.5 時間對核桃蛋白提取率的影響

時間對核桃蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 時間對提取率的影響Fig.5 Effect of time on extraction rate

從圖5可以看出，提取時間越長，核桃蛋白的提取率越高，當提取時間超過110 min后提取率則不再明顯提高。為了提高工作效率，核桃蛋白的提取時間應控制在110 min內。

2.3.6 響應面模型的建立

Box-Behnken響應面試驗設計結果見表4。Box-Behnken響應面試驗方差分析見表5。

表4 Box-Behnken響應面試驗設計結果Table 4 The results of Box-Behnken response surface design

續表4 Box-Behnken響應面試驗設計結果Continue table 4 The results of Box-Behnken response surface design

表5 Box-Behnken響應面試驗方差分析Table 5 Analysis of variance of Box-Behnken response surface design

利用Design-Expert8.0進行二次多元回歸擬合，可得液料比（A）、濃度（B）、溫度（C）以及時間（D）與響應值提取率（Y）的關系。其多元二次回歸方程為：Y=56.13+2.15A-0.67B-2.44C-0.85D-0.37AB+1.72AC-0.61AD+1.44BC-0.17BD+0.85CD-7.70A2-2.25B2-9.80C2-11.83D2。

由表5的方差分析結果可知，方程模型的p＜0.000 1＜0.01，表明該方程模型極顯著。模型失擬項P=0.147 7＞0.05，表明響應面試驗結果和數學模型擬合良好，試驗誤差小，因此，可以使用該數學模型對試驗結果進行分析。一次項中A影響極顯著（p＜0.01）、B和C的影響顯著、D影響不顯著，各因素對核桃蛋白提取率的影響由大到小依次為液料比＞溫度＞濃度＞時間。

響應面與等高線圖見圖6～圖10。

圖7 Y=f（A，C）的響應面與等高線Fig.7 Response surface and contour of Y=f（A，C）

圖8 Y=f（A，D）的響應面與等高線Fig.8 Response surface and contour of Y=f（A，D）

圖9 Y=f（B，C）的響應面與等高線Fig.9 Response surface and contour of Y=f（B，C）

圖10 Y=f（B，D）的響應面與等高線Fig.10 Response surface and contour of Y=f（B，D）

由圖6～10的響應面與等高線分析，所有交互項對蛋白質提取率的影響都不顯著。每個影響因子對于核桃蛋白提取率都有一個最佳穩定條件，試驗得到的最佳組合為：液料比 41.13∶1（mL/g）、NaOH 濃度0.08%、提取溫度58.74℃、時間109.33 min，此時，模型預測的核桃蛋白最大提取率為56.51%。

2.4 驗證試驗

根據上述優化的試驗結果，并為了實際操作方便操作，實際取值液料比 40∶1（mL/g）、NaOH 濃度 0.08%、提取溫度58℃、時間110 min，在此工藝條件下進行3次重復驗證試驗，實際測得蛋白質提取率的平均值為55.46%，比預測值相差1.05%，說明模型能夠用于預測核桃粕蛋白質提取工藝參數。

3 結論

在單因素試驗的基礎上采用四因素三水平的響應面分析法對超聲波輔助提取核桃蛋白進行優化。試驗確定堿溶酸沉法提取核桃粕中蛋白質的最佳工藝條件為：液料比 40 ∶1（mL/g）、濃度 0.08%、提取溫度58℃、時間110 min，此時，核桃蛋白提取率高達56.51%。因此，響應面分析法為優化核桃蛋白提取工藝提供理論依據，為后續對核桃粕中蛋白質的合理開發利用提供參考意見。

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Optimization of Extraction Technology of Protein from Walnut Meal by Response Surface Methodology

AN Chuan-xiang1，BI Yuan-lin1，PEI Pu-hua1，MA Li-zhi1，2，*
（1.Wine and Food Engineering College of Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Food and Pharmaceutical Engineering Institute of Guiyang University，Guizhou Engineering Research Center for Fruit Processing，Guiyang 550005，Guizhou，China）

Walnut protein is a balanced protein，it's nutritional value is similar with that of animal protein.Present work employed NaOH assisted by ultrasonic to extract the protein in walnut meal，and the effect of single factor like liquid material ratio，NaOH concentration，temperature and time had been studied.Under the condition of single factor screening，the extraction process of protein in walnut meal was optimized by response surface methodology，the results showed that the optimum extraction conditions of walnut protein were as follows：the liquid-solid ratio 40∶1（mL/g），the concentration of 0.08%，extraction temperature 58℃and extraction time 110 min，the maximum extraction rate of walnut protein was 56.51%.

response surface；walnut；ultrasonic；protein

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.008

貴州省農業公關項目（黔科合支撐[2016]2539號）；貴州省果品加工、貯藏與安全控制協同創新中心（黔教合協同中心字[201306]號）；貴州省教育廳重點學科建設（黔學位合字ZDXK[2014]13號）

安傳相（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏。

*通信作者：馬立志（1964—），男，教授，碩士，主要從事農產品加工與貯藏方向研究。

2017-03-21