恩諾沙星免疫親和柱的制備與應用研究

朱新生，強敏，陸源，王韋崗，牛瑞，王云

（1.鎮江市產品質量監督檢驗中心，江蘇鎮江212132；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

恩諾沙星免疫親和柱的制備與應用研究

朱新生1，強敏1，陸源1，王韋崗1，牛瑞2，王云2

（1.鎮江市產品質量監督檢驗中心，江蘇鎮江212132；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

將制備獲得的恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）多克隆抗體與Sepharose 4B進行偶聯，獲得恩諾沙星免疫親和柱（immunoaffinity column，IAC），并對IAC柱的性能和應用前景進行評價。結果表明：恩諾沙星多克隆抗體效價為1.28×105、半抑制濃度為5.47 ng/mL；制備的IAC柱的柱容量為2.54 g/mL凝膠，IAC柱的平均回收率為98.9%，柱與柱之間的變異系數為3.0%；牛奶中ENR的加標回收率分別為96.5%~99.8%。

恩諾沙星；多克隆抗體；免疫親和層析

恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）是畜禽和水產動物常用的一種氟喹諾酮類抗生素，能通過抑制細菌DNA螺旋酶來達到抗菌效果[1]。ENR進入畜禽機體后在體內分布廣泛且速度快，而且其殺菌譜廣，與其他藥物無交叉耐藥性，但是ENR在動物體內消除比較緩慢，半衰期較長[2]。在畜禽養殖業中，濫用ENR的現象相當普遍，造成動物制品中ENR殘留，給人體健康帶來威脅，如導致過敏反應、神經系統不良反應、精子質量下降等[3]。因此，世界各國對喹諾酮類抗生素的最高殘留限量均做出了嚴格的限制。我國農業部規定禽肉及其制品中ENR的最高殘留限量為0.1 mg/kg。為保護消費者的身體健康，迫切需要建立一種快速、準確的食品中ENR殘留分析檢測方法。

目前ENR常用的檢測分析方法有液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[4]、液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC/MS）[5-6]、毛細管電泳法[7]等。但由于實際樣品中抗生素殘留含量低、樣品基質復雜，屬于痕量分析的范疇，因此在進行儀器分析之前通常需要進行樣品凈化處理。常見的樣品凈化前處理的方法有固相萃取、液相微萃取等，但這些方法選擇性低、耗時。免疫親和層析技術，利用配體和靶標分子特異性可逆相互作用進行色譜分離，具有操作簡便、選擇性高等優點，在農獸藥殘留檢測領域顯示出良好的應用前景[8-9]。本研究將恩諾沙星多克隆抗體與CNBr-Sepharose 4B偶聯制備獲得免疫親和柱（immunoaffinity column，IAC），并對其性能和應用前景進行評價。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

恩諾沙星：Santa cruz公司；CNBr活化的sepharose 4B：GE公司；甲醇、乙腈（色譜純）：Thermo-Fisher公司；其他試劑均為化學純：國藥上海化學試劑有限公司。

UV-9600紫外分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；高效液相色譜儀LC 20AT：日本島津公司；5810R冷凍離心機：德國艾本德公司；全自動酶標儀Multiskan FC：美國Thermo公司。

1.2 抗體制備

采用N-羥基琥珀酰亞胺法（N-hydroxysuccinimide，NHS法）制備免疫原[8]。稱取 20 mg ENR、12.5 mg碳二亞胺 （1-ethyl-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC）、10 mg NHS，充分溶解于 0.9 mL 二甲亞砜中，加入100 μL三乙胺，室溫攪拌24 h，然后將其緩慢滴加到含有25 mg牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 的 0.01 mmol/L pH 7.4 磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶液中，室溫攪拌 3 h；將上述反應好的溶液裝入透析袋中，4℃條件下使用PBS溶液透析3天后，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，冷凍干燥后，分裝保存。

免疫原ENR-BSA用生理鹽水配成濃度為1mg/mL的溶液。首次免疫1.0 mg/只，用弗氏完全佐劑將ENRBSA乳化后，采用背部皮下多點的注射方式；加強免疫用不完全佐劑進行乳化。第3次免疫7天后，耳緣靜脈取血，采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked im munosorbent assay，ELISA）測定免疫血清的效價和IC50值。

1.3 IAC的制備

IAC柱的制備參照文獻[8]進行，具體步驟如下：

1）將純化后的多抗置于偶聯緩沖液（0.1 mol/L NaHCO3，0.5 mol/L NaCl，pH 8.3）中透析過夜，然后稀釋到一定濃度備用；2）準確稱取CNBr-Sepharose4B干膠0.1g在10mL 1 mmol/L HCl溶液中溶脹20 min。用10倍體積的偶聯緩沖液洗滌，在4℃，4 000 r/min條件下離心1 min，離心2次；3）取洗滌后的2 mL濕膠迅速轉移至含有2 mL一定濃度多抗的偶聯緩沖液中，于室溫下振搖1 h；4）用10倍體積以上的偶聯緩沖液洗去未偶聯的多抗；5）將凝膠置于5倍體積的0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）中，在室溫下封閉 2 h；6）用 5 倍體積的0.1 mol/L 醋酸鹽緩沖液（pH 4.0）、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）交替洗滌3次，再用pH 7.4的0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌2次后，裝柱至凝膠體積為0.5 mL。裝柱后向柱管加入1 mL 0.01 mol/L PBS緩沖液和10 μL 1%硫柳汞鈉，封住口底后于4℃保存。

1.4 柱容量的測定

取10 mL 400 ng/mL（4 000 ng）ENR標準溶液過柱，每1 mL上樣液收集一管，用HPLC法測定ENR含量，計算柱容量。

柱容量（ng ENR/g濕膠）=IAC柱吸附的ENR總量（ng）/濕凝膠質量（g）

1.5 IAC柱與柱之間重復性的測定

IAC柱之間的重復性用回收率進行評價，按照1.3的方法制備IAC柱，分別用2 mL 50、100、200 ng/mL（總量分別為 100、200、400 ng） 三種不同濃度的ENR標準品溶液依次過柱，每一個濃度兩組平行，用0.01 mol/LPBS緩沖液充分洗滌后，再用90%甲醇-水溶液進行洗脫，收集洗脫液，40℃旋轉蒸發儀上旋干，5 mL甲醇復溶后用HPLC法測定洗脫液中ENR的含量，計算柱與柱之間的重復性。

1.6 牛奶樣品加標回收率的測定

在5 mL空白牛奶樣品中分別加入濃度為5、10 ng/mL的ENR標準溶液（使用0.8%NaOH-PBS進行稀釋），每組兩個平行，將ENR標準溶液分別過柱，充分洗脫后，收集洗脫液，40℃旋轉蒸發，用甲醇定容至5 mL，用HPLC法測定ENR的含量，計算加標回收率。

1.7 HPLC分析

色譜條件：Shimpack VP-ODSC18色譜柱（250 mm×4.6 mm）和UV檢測器；流動相：乙腈和0.05 mol/L磷酸（19∶81，體積比）；UV檢測器檢測波長為280 nm；進樣量：20 μL；流速 1.0 mL/min。

2 結果與分析

2.1 ENR抗體的制備

免疫原ENR-BSA的紫外掃描圖譜如圖1所示。

載體蛋白BSA在277 nm處有特征吸收峰，ENR在282 nm和319 nm處有兩個特征吸收峰，免疫原ENR-BSA則在280 nm和321 nm處有兩個特征吸收峰。由于紫外吸收具有加合性，免疫原ENR-BSA不僅保留了載體蛋白和半抗原ENR的特征吸收峰，同時又有所遷移，說明半抗原ENR和載體蛋白偶聯成功。

圖1 ENR-BSA、BSA和ENR的紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectra of ENR-BSA，BSA and ENR

將所制備的免疫原ENR-BSA免疫動物，采用間接非競爭ELISA法對免疫血清的效價進行檢測，結果如圖2所示。

圖2 免疫血清的效價曲線Fig.2 The titer curve of immune serum

隨著稀釋倍數的增加，陰性血清的A450值無顯著變化，陽性血清的A450值隨著稀釋倍數的增加而降低，當免疫血清的稀釋倍數為128 000時，與陰性血清的比值即P/N值大于2.1，即免疫血清的效價達到1.28×105。

多克隆抗體血清采用飽和硫酸銨法和正辛酸-飽和硫酸銨法進行純化。純化后的抗體采用ELISA法測定其抑制曲線及半數抑制濃度IC50值，結果見圖3。

圖3 多克隆抗體的抑制曲線Fig.3 The inhibition curve of polyclonal antibody

由圖3可求得可以求得ENR多克隆抗體的半數抑制濃度IC50為5.47 ng/mL。

2.2 IAC的制備與評價

參照GE-Healthcare操作手冊，將純化后的ENR多抗與CNBr-Sepharose 4B共價偶聯，制備獲得ENR免疫親和柱。10 mL 400 ng/mL ENR溶液連續過柱，每1 mL上樣液收集一管，測定其中的ENR含量，計算被IAC柱吸附的ENR含量結果見圖4。

圖4 IAC的柱容量Fig.4 Column binding capacity of the IAC

如圖4所示，可得IAC柱容量為（400+393+386+90）/0.5=2.54 μg ENR/mL 凝膠。

將2 mL 50、100、200 ng/mL的ENR標準溶液分別過柱，每個濃度兩個平行，用HPLC法對柱子回收率進行測定，評價該IAC柱與柱之間的重復性結果見表1。

表1 IAC柱之間的重復性Table 1 Column-to-column variation of IACs

如表1所示，IAC柱的平均回收率為98.9%，柱與柱之間的變異系數為3.0%，說明IAC柱之間重復性良好。

2.3 IAC的應用評價

將所制備的IAC柱與HPLC法結合，在實際樣品牛奶中進行加標回收的測定，過柱后ENR的回收率測定結果如表2所示。

由表2可知，其中牛奶樣品分別加標5、10 ng/mL，加標總量分別為25 ng和50 ng時，其回收率分別為96.5%~99.8%、96.6%~99.6%，RSD值分別為1.9%和1.7%。

表2 牛奶樣品中的加標回收Table 2 Recoveries of ENR from milk and relative standard deviation（RSD）

3 結論

制備獲得了ENR多克隆抗體免疫親和柱，并對其配合HPLC分析在實際樣品中ENR殘留檢測的應用前景進行了評價。動物免疫獲得的ENR多抗的IC50值5.47 ng/mL，具有較高的親和性和特異性；抗體與Sepharose4B共價偶聯獲得的IAC柱的柱容量為2.54μg ENR/mL凝膠；IAC柱的平均回收率為98.9%，柱與柱之間的變異系數為3.0%，IAC柱與柱之間重復性良好；牛奶中ENR添加總量為5 ng和10 ng/mL時，加標回收率分別為96.5%~99.8%、96.6%~99.6%。

[1] 朱模忠.獸藥手冊[M].北京:化學工業出版社,2002:103-104

[2] Gore S R,Harms C A,Kukanich B,et al.Enrofloxacin pharmacokinetics in the European cuttlefish,Sepia officinalis,after a single i.v.injection and bath administration[J].Journal of Veterinary Pharmacology&Therapeutics,2005,28(5):433-439

[3]Aral F,Karacal F,Bab F.The effect of enrofloxacin on sperm quality in male mice[J].Research in Veterinary Science,2008,84(1):95-99

[4] 楊娜娜,王庚南,劉靜,等.高效液相色譜測定雞蛋中4種喹諾酮類藥物[J].河北農業大學學報,2014,37(6):101-105

[5] 梁君妮,劉寧,曹鵬,等.HPLC-MS/MS測定飼料中16種氟喹諾酮類藥物殘留量[J].食品研究與開發,2013,34(22):39-42

[6] 吳小蓮,向壘,莫測輝,等.超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜測定蔬菜中喹諾酮類抗生素[J].分析化學,2013,41(6):876-881

[7] 周梅仙,周業飛,劉文琪,等.高效毛細管電泳法分離檢測雞蛋中3種喹諾酮類抗菌藥[J].西北農業學報,2013,22(3):38-43

[8] 徐燕,王云,張勛,等.去氫甲睪酮多克隆抗體免疫親和柱制備研究[J].中國食品學報,2011,11(7):195-199

[9] 宋潔,趙笑天,潘亞利,等.免疫親和凈化-超高效液相色譜法同時測定豬肉和牛奶中的12種磺胺類藥物[J].食品科技,2013,38(3):319-323

[10]郝莉花,陳復生.免疫親和柱凈化-UPLC-MS/MS測定花生中黃曲霉毒素B1[J].食品工業,2017,38(1):269-272

Preparation of Immunoaffinity Column and Its Application in Sample Cleanup for Enrofloxacin Residues Detection

ZHU Xin-sheng1，QIANG Min1，LU Yuan1，WANG Wei-gang1，NIU Rui2，WANG Yun2
（1.Zhenjiang Products Quality Supervision and Inspection Center，Zhenjiang 212132，Jiangsu，China；2.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China）

The production of polyclonal antibody （pAb）against enrofloxacin （ENR），the preparation of immunoaffinity column（IAC）and its potential application to the selective extraction of ENR residues from actual samples were described.The produced pAb exhibited good sensitivity to ENR with antiserum titre of 1.28×105and IC50value of 5.47 ng/mL.By coupling the produced antibody with CNBr-activated Sepharose 4B，an IAC was prepared.The maximum capacity of the column for ENR was approximately 2.54 g/mL gel.The average recovery of ENR standard solutions from IACs was 98.9%with the relative standard deviation（RSD）among columns of 3.0%.The IACs were then challenged with ENR-fortified milk samples，recoveries of ENR were found to be in the range of 96.5%-99.8%.

enrofloxacin；polyclonal antibody；immunoaffinity chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.028

國家科技支撐計劃（2015BAK45B00）；鎮江市農業科技支撐計劃（NY2014024）

朱新生（1966—），男（漢），高級工程師，本科，主要從事食品安全檢測研究。

2017-07-11

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