Rcn3與細胞內質網應激機制的相關性

陳學正++王清華++楊東奇++馬潤林++石小倩

小鼠Reticulocalbin（RCN3）蛋白是一種定位于哺乳動物內質網分泌途徑，含有6個EF-Hand結構域的內質網鈣離子結合蛋白。為了研究Rcn3與內質網應激機制的相關性，我們利用前期獲得的Rcn3基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞作為實驗材料。將細胞分別用毒胡蘿卜素（TG）和衣霉素（TM）處理，并通過QPCR和Western Blot技術測得在內質網應激情況下Rcn3基因和RCN3蛋白的表達量。在模型構建成功的情況下，結果表明：1）Rcn3基因的表達量相比對照組均成上升趨勢。2）RCN3蛋白的表達量相比對照組均成上升趨勢。可得出結論：Rcn3基因及其編碼的蛋白RCN3蛋白與內質網應激機制有關。

近年來，生物技術逐漸嶄露頭角，成為世界科研的主要潮流之一，生物研究的根本便是研究基因和基因所編碼的蛋白質的表達情況和在細胞、個體、種群層次上發揮的作用。由于生物技術與食品安全、生物制藥等方面的緊密關聯性，其具有重大的科研以及商業價值。生物技術也必將在未來為改善人類生活做出更重要、更不可或缺的貢獻。

研究背景

Rcn3簡介

小鼠Reticulocalbin（Rcn3）是一個單拷貝基因，基因序列號是BC055903，位于小鼠的第7號染色體上，包含有7個外顯子，翻譯起始位點（ATG）位于第二個外顯子上，分布在10kb的染色體范圍內（基因組結構示意圖如圖1[1]），預測編碼一個328個氨基酸的多

肽[2]。蛋白結構預測表明，RCN3含有6個

EF-Hand結構域，在C-末端含有一個內質網定位信號HDEL，結構上非常保守，屬于近年來新發現的一個含6個EF-hand結構域，定位內質網中的鈣離子結合蛋白家族Reticulocalbin。關于Rcn3的研究還很少，其基因功能仍然很不清楚。

內質網應激

內質網（endoplasmic reticulum， ER）是真核細胞內非常重要的多功能細胞器，在完成基本生理功能的同時，內質網憑借其龐大的膜結構成為協調信號轉導的樞紐平臺，內質網是脂類和固醇合成、維持Ca2+動態平衡、蛋白質合成與折疊及其翻譯后修飾的場所[3-4]。

遺傳或環境損傷會引起細胞內鈣穩態失衡、氧化應激、營養缺乏、糖基化抑制和蛋白質錯誤折疊，從而破壞內質網功能，誘發內質網應激[3-6]。本次研究使用毒胡蘿卜素（thapsigargin， TG）、衣霉素（tunicamycin， TM）處理小鼠胚胎成纖維細胞，從而誘導細胞產生內質網應激過程。

TG原理：TG是內質網Ca2+-ATP酶選擇性抑制劑，可以使胞質內Ca2+濃度升高。

TM原理：TM阻礙了蛋白中N-糖苷鍵的

形成。

圖1 小鼠RCN3蛋白質序列，EF-Hand結構域和蛋白結構示意圖

A：預測的小鼠RCN3氨基酸序列，紅色序列代表信號肽，藍色序列是預測的6個保守的EF-Hand結構域。B：對應于A中的6個在CREC家族中非常保守的EF-Hand結構域。C：RCN3蛋白結構示意圖。

研究目的與意義

Tsuji A. 等人發現，人的RCN3蛋白嚴格定位于內質網，具有Ca2+結合活性[2]，且其具體功能尚不明確，故選擇RCN3作為研究對象。

本次實驗利用已有的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）作為實驗材料，通過TG和TM的處理，誘導細胞建立內質網應激模型。然后通過熒光定量PCR法（QPCR）和免疫印跡法（Western Blot）檢測在內質網應激條件下，Rcn3基因和蛋白的表達量，從而得出Rcn3與內質網應激機制是否存在關聯。

Rcn3是通過生物信息學預測出來的基因，RCN3在人，大鼠，小鼠中都存在同源蛋白，并且小鼠RCN3和人RCN3的氨基酸同源性高達93% [1]。故通過對小鼠體內Rcn3基因與內質網應激機制是否關聯的研究，我們可以檢測或推斷出人類Rcn3與內質網應激機制的關聯性，從而對未來生命科學和生物制藥等方面的研究奠定一定的理論研究基礎。

實驗方法與步驟

RNA的提取

1）準備試劑：氯仿、異丙醇、75℅乙醇、無RNase的水。

操作步驟：

（1）單層培養細胞：在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積加1mL。

（2）將勻漿樣品在室溫（15℃～30℃）放置5min，至核酸蛋白復合物完全分離。

（3）每使用1mLTRIzoL加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置5min。4℃12000r離心15min。

（4）把上層水相轉移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA，4℃放置30min，4℃12000r離心10min，棄去上清。

（5）用75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃12000r離心5min，棄上清。

（6）室溫放置干燥RNA沉淀10min。加入30μl無RNase的水，55℃放置10min使RNA溶解，-70℃保存。

2）RNA反轉錄。

采用試劑盒為 HiFiScript cDNA Synt

hesis Kit（CWBIO），根據指導手冊進行 cDNA 合成。

（1）模板 RNA Total RNA 3μg

Primer Mix（50 μL） 1μL

dNTP Mixture （10 mM each） 1μL

RNase-free water Up to 13μL

70℃ 保溫 10min 后， 冰上迅速冷卻。

（2）上述反應液 13μL

5×RT Buffer 4μL

DTT 2μL

HiFiScript（200U/μL） 1μL

Total：20μL

（3）混勻后，50℃反應15min。

（4）85℃，5 min 使酶滅活，冰上冷卻。

3）QPCR 體系。

MASTER MIX 5μl

正向引物（ 10μM） 0.5μl

反向引物（ 10μM） 0.5μl

DNA模板 50ng

ddH2O to 10μl

反應條件：94℃，60s變性模板DNA；變性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃， 1min/kb；35 cycles。68℃，10min；4℃，保存。

4）Western Blot實驗檢測蛋白質的表達。

（1）去離子水清洗1.5mm規格玻璃板，晾干待用。

（2）配膠：配制12%分離膠，用去離子水排氣泡封膠。膠已凝固時（約30min），傾去膠上的水后洗滌數次，并用濾紙將水吸干。配制5%的濃縮膠，將剩余空間灌滿濃縮膠然后立即將干凈且干燥的梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后（約30min），將凝膠放入電泳槽中，加入電泳液，排除凝膠底部兩塊玻璃板之間的氣泡，拔出梳子。

（3）蛋白上樣：電泳液沖洗濃縮膠上樣孔，水浴鍋煮沸去離子水，煮蛋白5min使之變性，立即冰浴，然后低速離心5min，進行蛋白上樣。

（4）電泳：將電泳槽與電泳儀相接，跑濃縮膠時用80V電壓，到分離膠后改為120V直至蛋白跑至膠底。

（5）轉膜：半干法：從負極到正極方向依次為纖維墊、凝膠、PVDF膜、纖維墊，用轉膜液濕潤即可，限壓（20V）、限流（5.5倍膠面積mA）轉膜1小時。

（6）將膜用1×麗春紅染液染5min，去離子水輕輕沖洗，觀察蛋白轉膜情況，并根據目的蛋白位置裁剪PVDF膜，TBST洗去染液。

（7）封閉：將膜移入盛有5%脫脂奶粉的平皿中，室溫搖床孵育1h，TBST洗膜。

（8）孵育一抗：用5%脫脂奶粉稀釋一抗，濕盒中4℃恒溫房搖床過夜。

（9）孵育二抗：傾去一抗，TBST室溫搖床洗膜3～5次，每次5min～10min，5%脫脂奶粉稀釋相應二抗，室溫搖床孵育3h。

（10）曝光：傾去二抗，TBST室溫搖床洗膜3～5次，每次5min～10min。將兩種發光劑按1：1的比例混合，避光孵育膜上蛋白2min～5min，傾去發光劑，準備顯影。

（11）顯影：整個過程在暗室中。將膠片壓于已封發光劑的蛋白膜上，取出膠片后在顯影液中浸洗，適時在水中終止，將膠片放入定影液中定影，之后用水將膠片沖洗干凈，吹干。

結果與分析

QPCR結果

圖2

A：Rcn3敲除小鼠成纖維細胞TM處理后GRP78 mRNA表達情況。B：Rcn3敲除小鼠成纖維細胞TG處理后GRP78 mRNA表達情況。C：野生型小鼠成纖維細胞TM處理后GRP78 mRNA表達情況。D：野生型小鼠成纖維細胞TG處理后GRP78 mRNA表達情況。與對照組相比，所有處理樣本的GRP78 mRNA表達量上升。

圖3

A：野生型小鼠成纖維細胞TG處理后Rcn3 mRNA表達情況。B：野生型小鼠成纖維細胞TM處理后Rcn3 mRNA表達情況。與對照組相比較，所有處理組樣本的Rcn3 mRNA表達量呈現上升趨勢。

Western Blot結果

圖4

免疫印跡法測得野生型和Rcn3基因敲除小鼠成纖維細胞在TM 和TG 處理后內參蛋白（β-BUTULIN）、GRP78蛋白、RCN3蛋白表達情況。 內參蛋白表達情況大體相同，說明上樣量基本一致。通過對比可知，在內質網應激情況下，RCN3蛋白表達量上升。

結論與展望

結論

1）所有小鼠成纖維細胞的GRP78 mRNA表達量均成上升趨勢，可得出結論：所有細胞內質網皆產生應激反應即ER stress模型建立

成功。

2）所有小鼠成纖維細胞的Rcn3 mRNA表達量均成上升趨勢，可得出結論：小鼠成纖維細胞內Rcn3基因與內質網應激反應有關聯，在內質網受到刺激的情況下，Rcn3基因表達量上升。

3）所有小鼠成纖維細胞的RCN3蛋白表達量均成上升趨勢，可得出結論小鼠細胞內RCN3蛋白與內質網應激機制有關聯，與mRNA表達量變化趨勢大致相同。

展望

1）通過更改刺激內質網的藥品和內質網所處的環境，并多次重復實驗，進一步確定Rcn3基因和RCN3蛋白是否與內質網應激機制存在關聯性。

2）通過對RCN3蛋白肽鏈組成、空間結構等方面的探究，揭示該種蛋白及編碼其的基因在內質網應激條件下發揮的具體作用。

本次研究通過建立模型法成功證實了還未被廣泛研究和重視的Rcn3基因及其編碼的RCN3蛋白與內質網應激機制具有顯著的相關性。在未來，通過對此種基因的進一步研究和利用可以為生命科學的研究和利用做出更多、更重要的貢獻。

參考文獻

[1]張一荻.Rcn3基因功能探究[D].北京：中國科學院大學，2013.

[2]Tsuji， A. Kikuchi， Y. Sato， Y. Koide， S. Yuasa， K. Nagahama， M. and Matsuda， Y （2006）. A proteomic approach reveals transient association of reticulocalbin-3， a novel member of the CREC family， with the precursor of subtilisin-like proprotein convertase， PACE4[J]. Biochem 396，51-59.

[3]Paschen， W. Frandsen， A. Endoplasmic reticulum dysfunction a common denominator for cell injury in acute and degenerative diseases of the brain[J]. Neurochem， 2001，79（4）：719-725.

[4]Schroder， M. Kaufman， R. ER stress and the unfolded protein response[J]. Mutat Res，2005，569（1-2）：29-63.

[5]Zhang H Y. Wang Z G. Lu X H. et al. Endoplasmic reticulum stress： relevance and therapeutics in central nervous system diseases[J]. Mol Neurobiol，2015，51（3）：1343-1352.

[6]Breckenridge D G， Germain M，Mathai J P，et al.Regulation of apoptosis by endoplasmic reticulum pathways. Oncogene，2003，22（53）：8608-8618.

（通訊作者：馬潤林，教授，博士生導師，中國科學院大學，研究方向為人類及動物功能基因組學。

石小倩，博士，中國科學院大學，研究方向為遺傳學。

作者簡介：陳學正，王清華，楊東奇，北京市牛欄山第一中學。）