桿狀病毒LEF-11蛋白自身相互作用關鍵區域的鑒定

蔣亞明，董戰旗，陳婷婷，胡楠，董非凡，黃亮，唐良彤，潘敏慧

?

桿狀病毒LEF-11蛋白自身相互作用關鍵區域的鑒定

蔣亞明1，董戰旗1，陳婷婷1，胡楠1，董非凡1，黃亮1，唐良彤2，潘敏慧1

（1西南大學農業部蠶桑生物學與遺傳育種重點實驗室，重慶400716；2重慶農業機械化學校，重慶404000）

家蠶核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是蠶業上最常見且危害最為嚴重的病原微生物之一，其晚期表達因子（late expression factor，lef）LEF-11對病毒的增殖具有重要作用，相關研究證明LEF-11蛋白能夠發生自身相互作用形成寡聚體，本研究通過逐步截短探究LEF-11蛋白自身相互作用的關鍵區域。利用雙分子熒光互補（bimolecular fluorescence complementation）技術和熒光定位（fluorescent co-location）技術，首先根據BmNVP及各個截短片段序列和熒光蛋白序列設計引物，通過PCR技術擴增回收得到所有片段以及熒光標簽片段，并且通過限制性內切酶處理回收后，將熒光標簽片段分別連接到昆蟲細胞表達載體pIZ/V5-His上，構建pIZ-DsRed和pIZ-EGFP質粒，然后用相同方法構建LEF-11全長和逐步截短的LEF-11紅色熒光融合蛋白載體，分別與pIZ-LEF11-GFP共同轉染到家蠶BmN-SWU1細胞中，更換普通培養基48 h后固定細胞并制片，最后在熒光共聚焦顯微鏡下觀察熒光融合蛋白表達及定位情況，鑒定LEF-11蛋白自身相互作用的關鍵區域；熒光雙分子互補試驗相關載體的構建步驟與熒光融合表達載體構建方法一致，轉染處理及熒光觀察方法也相同。桿狀病毒LEF-11蛋白2—61和62—112端均能與LEF-11蛋白全長發生相互作用，分別共定位于細胞質和細胞核；逐步截短過程中，LEF-11蛋白N-端2—61、12—61、22—61、32—61、42—61和2—51均能與LEF-11蛋白全長共同定位于細胞質中，但其52—61、2—41未發生共定位；C-端截短片段能夠與LEF-11蛋白全長發生共定位的有62—112、72—112、82—112、72—101和72—91，但92—112和72—81區域未發現共定位現象；雙分子熒光互補試驗結果驗證LEF-11蛋白N-端片段與LEF-11蛋白全長相互作用的有2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、2—51，而2—41、52—61截短突變體則不能，與N-端片段熒光共定位結果保持一致。鑒定到了桿狀病毒LEF-11蛋白的42-51和82-91區域為其自身相互作用關鍵區域，可用于LEF-11相關功能研究。

家蠶；BmNPV；LEF-11；雙分子熒光互補；自身相互作用

0 引言

【研究意義】桿狀病毒是一類以節肢動物為專一性宿主進行感染和傳播的、具有囊膜包裹的雙鏈環狀DNA病毒，其基因組大小為80—220 kb[1-3]。桿狀病毒分為顆粒型病毒屬（GV）和核型多角體病毒屬（NPV）兩個屬。根據病毒生活史中具有兩種不同的病毒粒子形態，又可分為包埋型的病毒粒子（occlusion-derived virus，ODV）和出芽型的病毒粒子（budded virus，BV），分別介導宿主之間的原發感染和細胞之間的繼發感染[4-5]。病毒基因組相對其他生物更為簡單，嚴格的寄生生活使病毒缺乏新陳代謝所必需的結構，所以病毒需要利用宿主的物質和能量才能完成自身生命活動[6-9]。桿狀病毒在其生活周期中，基因的表達屬于級聯模式，按表達時序可分為極早期基因、早期基因、晚期基因和極晚期基因。晚期基因的表達有賴于病毒基因組的復制和轉錄，同時需要一些特殊的蛋白進行調控，即晚期表達因子（late expression factor，lef）。相關研究證明LEF-11和病毒DNA復制相關，而病毒編碼的小分子蛋白在病毒感染宿主過程中往往需要寡聚化，形成不同程度的寡聚體，以行使不同的功能。因此對LEF-11蛋白自身相互作用的研究對于解析桿狀病毒復制機制和培育抗病素材具有重要意義。【前人研究進展】迄今為止已經鑒定了至少19種晚期表達基因，統稱為基因家族。而此家族基因有些為DNA復制所必需，有些是在轉錄水平上進行調控，所有家族基因均能調控晚期基因的表達，是晚期表達基因的必需因子[10-14]。LEF-11是桿狀病毒編碼的只有112個氨基酸殘基的小分子蛋白，大小為13.1 kD，除庫蚊核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，CuniNPV）之外，所有已發現的桿狀病毒基因組中都存在它的同源基因[15-18]。2002年，Lin等[19]通過敲除試驗確定苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是病毒DNA復制必需基因，能夠促進晚期基因轉錄；2014年，Zhang等[20]在BmNPV中確定LEF-11具有一個保守的核定位基序，并通過免疫熒光證明LEF-11能夠與病毒DNA復制中心標記物BrdU共定位到一起，更進一步確定LEF-11可能在BmNPV DNA復制過程中起重要作用。此外，相關研究表明，LEF-11與細胞核入核受體蛋白importin-3和定位于核內病毒DNA復制位點的病毒復制因子IE1有相互作用，這都表明LEF-11在病毒復制過程中扮演極其重要的角色。LEF-11能形成寡聚體，其寡聚體形式對其行使生理功能具有決定性作用[21]。【本研究切入點】病毒編碼的小分子蛋白LEF-11對于病毒DNA復制非常重要，相關研究表明病毒編碼的一些小分子蛋白以寡聚體的形式行使功能，但LEF-11自身相互作用具體機制仍不清楚。因此本研究通過逐步截短，鑒定LEF-11蛋白自身相互作用關鍵區域。【擬解決的關鍵問題】通過對LEF-11自身相互作用的鑒定，找出關鍵的結合區域，為解析LEF-11功能和應用于培育抗病毒品種打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2016年在西南大學農業部蠶桑生物學與遺傳育種重點實驗室完成。

1.1 細胞和培養基

BmN-SWU1細胞為西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室保存，用TC-100培養基（United States Biological，Swampscott，MA，USA），添加10%（V/V）胎牛血清（FBS；PAA Laboratories），在27℃條件下恒溫培養。

1.2 質粒構建

以pIZ/V5-His（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）為空載，通過PCR獲得家蠶核型多角體病毒全長及各個截短片段和EGPP、dsRed片段，先通過酶切、連接，構建pIZ-DsRed和pIZ-EGFP質粒。截短PCR片段包括N-端基因片段：2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、52—61和2—41；C-端基因片段：62—112、72—112、82—112、92—112、72—101、72—91和72—81，全長及所有片段分別通過酶切、連接，構建了帶有dsRed標簽的質粒，同時全長構建了帶EGFP融合的質粒。pBiFC-VC155質粒和pBiFC-VN173質粒為安徽蚌埠醫學院呂合作教授惠贈，筆者實驗室保存，相應的BiFC載體構建方法與熒光載體構建方法相同，所有構建質粒都經測序分析，本研究所用引物見表1。

1.3 轉染

將對數期生長的BmN-SWU1細胞平鋪到有蓋玻片的24孔板中，每孔按單轉0.8 μg質粒、共轉各0.5 μg質粒轉染，將質粒與2.5 μl轉染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）分別加到100 μl的無抗生素TC100培養基中，輕柔混勻，室溫孵育30 min后將轉染復合物逐滴加入到細胞中，于27℃恒溫培養箱中繼續培養。

1.4 免疫熒光

按照1.3所述方法轉染48 h后，用1×PBST輕洗細胞3次，每次5 min。加入4%的多聚甲醛溶液，室溫固定15 min，1×PBST同上輕洗。由于本試驗所構建質粒均融合熒光蛋白標簽，能在激光條件下發出熒光，故可不用進行免疫一抗、二抗處理。最后取出蓋玻片在Olympus激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察拍照。

表1 本試驗所用引物

下劃線代表酶切位點The restriction enzyme sites were underlined

1.5 熒光雙分子互補

BiFC載體構建方法與1.2一致，構建的載體分別命名為pBiFC-VN-LEF-11（aa2—61）、pBiFC-VN- LEF-11（aa12—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa22—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa32—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa42—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa52—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa2—51）和pBiFC-VC-LEF-11；表達產物簡寫為VN-LEF-11（2—61）、VN-LEF-11（12—61）、VN-LEF-11（22—61）、VN-LEF-11（32—61）、VN-LEF-11（42—61）、VN-LEF-11（52—61）、VN-LEF-11（2—51）、 VN-LEF-11（2—41）以及VC-LEF-11。將相應的VN載體分別與VC載體共同轉染到細胞中，轉染48 h后，通過共聚焦顯微觀察是否有黃色熒光激發。轉染和免疫熒光按1.3與1.4所述操作。

2 結果

2.1 LEF-11蛋白N-端、C-端與LEF-11全長的相互作用

為探究LEF-11相互作用及其關鍵區域，將只有112個氨基酸殘基的LEF-11蛋白分為N-端LEF-11（2—61）和C-端LEF-11（62—112），并與DsRed融合表達，分別與pIZ-LEF-11-EGFP共同轉入BmN-SWU1細胞，對照分別為pIZ-DsRed和pIZ-DsRed-LEF11。結果顯示各熒光標簽融合片段均能夠在細胞中正常表達，LEF-11分布于細胞核內。對照組DsRed蛋白彌散分布于細胞質與細胞核，與LEF-11-EGFP沒有共定位；LEF-11全長與N-端、C-端分別共定位在細胞質和細胞核，表明兩段都含有與全長發生共定位的區域，同時N-端缺失核定位信號，無法定位在細胞核（圖1）。

2.2 LEF-11 N-端自身相互作用關鍵區域

上述試驗結果表明LEF-11在N-端具有能與LEF-11全長發生共定位的區域，為找到這個關鍵區域，將N-端按照每次遞減10個氨基酸殘基逐步截短，與紅色熒光標簽DsRed融合，并分別與pIZ-GFP-LEF11共轉染BmN-SWU1細胞，在共聚焦顯微鏡下觀察到各個截短片段融合熒光標簽后，能在細胞中穩定表達（圖2）。2—61、12—61、22—61、32—61、42—61和2—51均能和全長共同定位于細胞質中，52—61和2—41則沒有該現象。通過對比發現，沒有共定位現象的截短片段缺少42—51區域，彌散分布，說明該區域為N端自我相互作用關鍵區域（圖3）。

圖1 LEF-11-EGFP分別與LEF-11蛋白N-端、C-端熒光共定位

圖2 LEF-11-EGFP分別與LEF-11 N-端各截短片段熒光共定位

圖3 N-端截短相互作用示意圖

2.3 LEF-11 C-端自身相互作用關鍵區域

N-端發生自我相互作用關鍵區域已經被鑒定，用相同的方法得到C-端截短區段共7個，分別命名為LEF-11（62—112）、LEF-11（72—112）、LEF-11（82—112）、LEF-11（92—112）、LEF-11（72—101）、LEF-11（72—91）和LEF-11（72—81），與DsRed融合后，分別與全長載體pIZ-GFP-LEF11共轉染于BmN-SWU1細胞，結果顯示各片段均能正常表達，其中能與全長發生共定位的有5個：62—112、72—112、82—112、72—101和72—91，而缺少82—91區域的72—81、92—112卻沒有發生共聚現象，紅色熒光分布整個細胞，呈現彌散狀態，說明82—91對于C-端發生自我相互作用極為重要。82—91位于LEF-11核定位信號72—101中，72—91和82—112含有部分核定位信號，共定位在細胞核中，但彌散分布（圖4、圖5）。

2.4 BiFC探究LEF-11蛋白N-端自身相互作用關鍵區域

為驗證LEF-11蛋白共定位現象與自身相互作用關系，采用雙分子熒光互補技術（BiFC）對N-端截短各蛋白進行分析，結果如圖6所示，LEF-11N-端截短突變體VN-LEF-11（2—61）、VN-LEF-11（12—61）、VN-LEF-11（22—61）、VN-LEF-11（32—61）、VN-LEF-11（42—61）和VN-LEF-11（2—51）均可與VC-LEF-11激發出熒光，VN-LEF-11（52—61）、VN-LEF-11（2—41）與VC-LEF-11則無熒光激發，表明LEF-11N-端截短突變體2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、2—51與全長LEF-11可發生相互作用，缺失42—51的2—41、52—61突變體則不能，結果顯示N-端截短突變體共定位和相互作用保持一致。

圖4 LEF-11-EGFP分別與LEF-11 C-端各截短片段熒光共定位

圖5 C-端截短相互作用示意圖

圖6 LEF-11-GFP分別與LEF-11蛋白N-端截短片段雙分子熒光互補

3 討論

本研究主要采用熒光定位和雙分子熒光互補技術探究了BmNPV晚期表達因子LEF-11自身相互作用，發現LEF-11蛋白N-端和C-端能夠與全長發生共定位，并且通過BiFC試驗初步證明，N-端各個截短突變體與LEF-11全長共定位和相互作用是一致的；通過逐步截短，發現了缺少42—51（氨基酸序列：VCAHMLDIVS）和82—91（氨基酸序列：HKRIARLLGI）區域的片段，喪失了與全長發生共定位的能力，說明這兩個區域對于LEF-11蛋白自身相互作用具有關鍵作用。同源比對分析桿狀病毒LEF-11的結構域，發現LEF-11自身相互作用關鍵區域結構域中疏水性氨基酸是非常保守的，先前研究表明一般二聚體結構都是有疏水性氨基酸或二硫鍵維持，因此筆者認為LEF-11結構域中疏水氨基酸殘基對于維持自身相互作用具有關鍵作用，這些疏水基團的缺失能夠使LEF-11喪失了自身相互作用的能力，因而呈彌散分布。對比發現，非自身相互作用關鍵區域對于LEF-11自身相互作用的穩定也有著重要作用。LEF-11核定位信號在72—101[22]，缺失全部或者部分核定位信號的突變體，定位均發生變化，N-端各個突變體缺失全部核定位信號，定位在細胞質中，且不影響自身相互作用；C-端片段中，自身相互作用關鍵區域為82—91，位于核定位信號中，缺失82—91不僅影響自身相互作用，也影響定位。同時還發現，即使保留82—91，其他區域的缺失對共定位也存在影響，這些區域可能對于自身相互作用的穩定具有一定作用。自身相互作用關鍵區域結構域和核定位信號是重疊的，根據多聚體功能域疏水性氨基酸和核定位信號分析它們保守氨基酸并不一致，在研究自身相互作用關鍵區域共定位時，核定位發生變化可能是由于截短突變了核定位信號的緣故。

作為桿狀病毒極晚期表達因子，LEF-11已被證實對病毒的復制極其重要[22]。相關研究已發現其能夠與病毒或宿主關鍵因子發生相互作用，如LEF-11與細胞核入核受體importin-3具有相互作用，能夠促進其進入細胞核；和IE-1共定位于核內病毒DNA復制位點，可能直接參與了病毒的復制過程；與LEF-3的相互作用，可能是其募集其他因子，對病毒DNA復制進行調控。

桿狀病毒LEF-11是一個小分子蛋白，很容易發生多聚化，很多細胞蛋白都會發生多聚化現象，從單體前體到多聚化是蛋白功能特征的進化，也是蛋白質行使不同作用的重要形式[23]。因此很多DNA病毒包括HSV、WSSV和桿狀病毒編碼多聚化蛋白，并且這些多聚化在病毒復制增殖中都具有很重要的作用。目前研究表明很多桿狀病毒蛋白，如IE-1、IE-2、LEF-3、LEF-5、DBP、CG30和HA44都能多聚化，對病毒DNA復制是必要的。另外，AcMNPV LEF-3能夠自身發生相互作用形成同源二聚體，在AcMNPV擴散過程中，調控病毒DNA復制所必需[24-25]。LEF-11具有兩個獨立的自我相互作用位點，可能直接影響其寡聚化，進而影響病毒DNA復制。同時，LEF-11具有核定位信號（NLS），這為其進核及定位在相關位置提供了極為有利的條件，熒光定位顯示，LEF-11在缺失核定位信號后，在核內外均有分布。相關試驗證明LEF-11和病毒復制中心IE1及宿主DNA復制中心BrdU能夠共定位到一起，這不僅說明了LEF-11自身相互作用，同時共定位在核內也是其行使功能不可缺少的條件。

本研究表明LEF-11擁有兩個自身相互作用功能域，并且自身相互作用不僅在細胞質中，也發生在細胞核，結合其定位在核內DNA復制關鍵區域，筆者推測LEF-11的兩個相互作用位點能夠保證其在胞質合成后寡聚化，說明LEF-11在胞質中具有相應功能，寡聚化可能就是在胞質中行使這個功能所必要的形式，考慮到LEF-11影響DNA復制的功能需要在細胞核中完成，且具有核定位信號，推測LEF-11在胞質中自我相互作用形成寡聚體，同時募集相關物質，在核定位信號和入核受體的作用下進入細胞核，進而影響病毒DNA復制。桿狀病毒LEF-11蛋白在病毒復制過程中是必要的，在病毒感染過程中LEF-11同樣存在多聚體。這些結果為以后研究LEF-11調控病毒復制以及病毒和宿主相互作用提供了理論依據，為家蠶抗病毒研究提供了基礎數據。

有趣的是，具有核定位信號蛋白的相互作用共定位的區域往往因為核定位序列的缺失或突變而改變，這可能是由于蛋白相互作用后被一同轉運。筆者已經利用這項技術，探究了一些蛋白之間的相互作用，通過熒光定位，更加直觀地了解蛋白質之間的相互關系，為胞內大分子相互作用研究提供了一個新的方法，但其進核機制及其調控過程仍不清晰，還需要更深入地研究。

本研究揭示了桿狀病毒晚期表達因子LEF-11能夠發生自身相互作用，并且通過一系列截短試驗，找到了其在N-端和C-端具有的兩個相互作用關鍵區域。結合相關研究，筆者推測LEF-11在胞質合成后，通過自身相互作用形成寡聚體，募集其他因子，可能在入核受體蛋白importin-3的作用下進入細胞核，利用自身核定位序列定位于相關區域，并且和LEF-3等蛋白相互作用[20]，進而形成一個復合體結構，直接調控病毒DNA合成。當然，這個假設仍有很多問題沒有被闡明，如LEF-11寡聚體是否募集了其他因子，這些因子對于病毒感染過程又有什么作用，LEF11-11入核機制和調控病毒DNA復制的模式又是什么，相關問題的研究也是正在探索的方向。

4 結論

通過免疫熒光和雙分子熒光互補技術，鑒定了家蠶核型多角體病毒晚期表達蛋白LEF-11 N-端和C-端均具有獨立的相互作用區域，同時通過截短確定42—51和82—91為其相互作用關鍵區域。

[1] 陳琳, 于少芳, 吳小鋒. 昆蟲質型多角體病毒與桿狀病毒多角體的結構比較. 蠶業科學, 2011, 37(5): 883-891.

CHEN L, YU S F，WU X F. A comparison on polyhedral structures of insect cytoplasmic polyhedrosis virus and baculovirus., 2011, 37(5): 883-891. (in Chinese)

[2] CHATEIGNER A, BEZIER A, LABROUSSE C, JIOLLE D, BARBE V, HERNIOU E A. Ultra deep sequencing of a baculovirus population reveals widespread genomic variations., 2015, 7(7): 3625-3646.

[3] 孫修煉, 胡志紅, 彭輝銀. 桿狀病毒生態學研究進展. 中國病毒學, 2006, 21(2): 200-206.

SUN X L, HU Z H, PENG H Y. Recent advances in baculovirus ecology., 2006, 21(2): 200-206. (in Chinese)

[4] 孟慶峰, 劉曉勇. 桿狀病毒與昆蟲宿主相互作用的研究進展. 昆蟲學報, 2013, 56(8): 925-933.

MENG Q F, LIU X Y. Research progress in the interactions of baculoviruses with host insects., 2013, 56(8): 925-933. (in Chinese)

[5] 相興偉, 陳琳, 于少芳, 楊銳, 吳小鋒. 家蠶核型多角體病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表達及引導外源蛋白進入多角體的研究. 蠶業科學, 2010, 36(5): 785-791.

XlANG X W, CHEN L, YU S F, YANG R, WU X F. Fusion expression of thenucleopolyhedrovirus ODV envelope protein and immobilization of foreign protein into BmNPV polyhedra., 2010, 36(5): 785-791. (in Chinese)

[6] 王思民. 兩個桿狀病毒蛋白與宿主蛋白的相互作用[D]. 武漢: 華中師范大學, 2012.

WANG S M. The interaction between two baculovirus proteins and host proteins[D]. Wuhan: Central China Normal University, 2012. (in Chinese)

[7] 鄭秦, 吳小鋒. 昆蟲桿狀病毒經口感染因子P74的結構和功能. 病毒學報, 2016, 32(4): 523-528.

ZHENG Q, WU X F. Structure and function of the baculovirus per os infectivity factor (PIF) P74., 2016, 32(4): 523-528. (in Chinese)

[8] 伯曉晨, 楊靜, 王升啟. 病毒-宿主相互作用的系統生物學與宿主靶向抗病毒策略. 中國藥理學與毒理學雜志, 2013, 27(2): 127-131.

BO X C, YANG J, WANG S Q. Systems biology approach for virus-host interaction and host-directed antiviral strategy., 2013, 27(2): 127-131. (in Chinese)

[9] 張傳軍, 連海. miRNA調控病毒與宿主細胞相互作用的研究進展. 中國生物制品學雜志, 2010, 23(5): 549-553.

ZHANG C J, LIAN H. Progress in research on regulation of host-virus interaction by miRNA., 2010, 23(5): 549-553. (in Chinese)

[10] 劉德立, 齊義鵬. 桿狀病毒lef基因家族及其功能. 病毒學報, 2001, 17(2): 188-191.

LIU D L, QI Y P. The lef gene family of baculovirus and their functions., 2001, 17(2): 188-191. (in Chinese)

[11] TODD J W, PASSARELLI A L, MILLER L K. Eighteen baculovirus genes, including,,, and, support late gene expression., 1995, 69(2): 968-974.

[12] VANARSDALL A L, MIKHAILOV V S, ROHRMANN G F. Characterization of a baculovirus lacking the DBP (DNA-binding protein) gene., 2007, 364(2): 475-485.

[13] LIANG Z, ZHANG X, YIN X, CAO S, XU F. Genomic sequencing and analysis ofgranulovirus., 2011, 156(7): 1185-1198.

[14] 羅輯, 周國英, 朱積余. 油桐尺蛾核型多角體病毒基因結構及系統進化分析. 林業科學研究, 2015, 28(2): 230-235.

LUO J, ZHOU G Y, ZHU J Y. The structural and phylogenetic analysis of late expression factor 8 () gene innuclear polyhedrosis virus., 2015, 28(2): 230-235. (in Chinese)

[15] 顧奇偉, 楊麗榮, 嚴興成, 尚金燕, 高瞻, 張傳溪. 灰斑古毒蛾核型多角體病毒三個晚期表達因子基因. 中國病毒學, 2004, 19(5): 504-509.

GU Q W, YANG L R, YAN X C, SHANG J Y, GAO Z, ZHANG C X. Three late expression factor genes ofsingle-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus., 2004, 19(5): 504-509. (in Chinese)

[16] 馮樅棣, 陳新文, VLAK J M, 胡志紅. 中國棉鈴蟲核多角體病毒基因組I-I片段的序列分析. 中國病毒學, 2002, 17(2): 125-131.

FENG Z D, CHEN X W, VLAK J M, HU Z H. Sequence analysis of theI-I region of the single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus of., 2002, 17(2): 125-131. (in Chinese)

[17] 陳婷婷, 董戰旗, 胡楠, 胡志剛, 魯成, 潘敏慧. 家蠶核型多角體病毒基因RNA干擾策略的優化. 微生物學報, 2016, 56(10): 1561-1570.

CHEN T T, DONG Z Q, HU N, HU Z G, LU C, PAN M H. Optimization of RNA interference strategy forgene ofnucleopolyhedrovirus., 2016, 56(10): 1561-1570. (in Chinese)

[18] ZHANG X X, LIANG Z P, PENG H Y, ZHANG Z X, TANG X C, LIU T Q. Characterization and partial genome sequence analysis ofgranulovirus., 2005, 113(1): 36-43.

[19] LIN G, BLISSARD G W. Analysis of annucleopolyhedrovirusknockout: LEF-11 is essential for viral DNA replication., 2002, 76(6): 2770-2779.

[20] ZHANG J, DONG Z Q, ZHANG C D, HE Q, CHEN X M, CAO M Y, LI H Q, XIAO W F, LU C, PAN M H. Identification of a novel nuclear localization signal of baculovirus late expression factor 11., 2014, 184: 111-119.

[21] DONG Z Q, HU N, ZHANG J, CHEN T T, CAO M Y, LI H Q, lei x j, chen p, LU C, PAN M H. Oligomerization of baculovirus LEF-11 is involved in viral DNA replication., 2015, 10(12): e0144930.

[22] ZHANG J, HE Q, ZHANG C D, CHEN X Y, CHEN X M, DONG Z Q, LI N, KUANG X X, CAO M Y, LU C, PAN M H. Inhibition of BmNPV replication in silkworm cells using inducible and regulated artificial microRNA precursors targeting the essential viral gene., 2014, 104: 143-152.

[23] GUO Z J, TAO L X, DONG X Y, YU M H, TIAN T, TANG X D. Characterization of aggregate/aggresome structures formed by polyhedrin ofnucleopolyhedrovirus., 2015, 5: 14601.

[24] DOWNIE K, ADETOLA G, CARSTENS E B. Characterization of protein-protein interaction domains within the baculovirusmultiple nucleopolyhedrovirus late expression factor LEF-3., 2013, 94(11): 2530-2535.

[25] MORR J, Rundstr?m N, BETZ H, Langosch D, Schmitt B. Baculovirus-driven expression and purification of glycine receptor1 homo-oligomers., 1995, 368(3): 495-499.

（責任編輯 岳梅）

Identification the key areas ofNucleopolyhedrovirus LEF-11 self-interaction

JIANG YaMing1, DONG ZhanQi1, CHEN TingTing1, HU Nan1, DONG FeiFan1, HUANG Liang1, Tang LiangTong2, PAN MinHui1,2

(1Key Laboratory of Sericultural Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Southwest University, Chongqing 400716;2Chongqing Agricultural Mechanization School, Chongqing 404000)

nucleopolyhedrovirus (BmNPV) is one of the most common and most serious pathogenic microorganisms in sericulture, and LEF-11, one of the late expression factors of baculovirus, has been verified essential for virus proliferation.Related research proves that LEF-11 has the ability to form oligomers by self-interaction.the objective of this study is to explore the key areas of LEF-11 self-interaction via gradually truncated.Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and fluorescent co-localization were utilized in this study. Firstly, the primers were designed based on the sequence of BmNPVeach truncated fragment as well as fluorescent protein sequence, all of the fragments were treated with restriction endonuclease after PCR. Then, pIZ/V5-His, the insect cell expression vector, was used to construct fluorescence fusion protein vector. Next, each truncated fragment fluorescence fusion protein vector was transfected together with pIZ-LEF11-GFP in BmN-SWU1, respectively. Cells were fixed after 48 h of the replacement of ordinary medium. Finally, the expression and localization of fluorescent fusion protein were observed under fluorescence confocal microscopy. As for the BiFC essay, the construction of vectors and the way of post processing were the same with fluorescence fusion protein.Both the 2-61 and 62-112 of the baculovirus LEF-11 protein could interact with the full length of the LEF-11 protein, and co-located in cytoplasm and nucleus, respectively. In the process of gradual truncation, LEF-11 protein N-terminal 2-61, 12-61, 22-61, 32-61, 42-61 and 2-51 could co-located with the full length of LEF-11 protein in cytoplasm, but N-terminal 52-61 and 2-41 did not co-locate. LEF-11 protein C-terminal 62-112, 72-112, 82-112, 72-101 and 72-91 could co-located with the full length of LEF-11 protein, but C-terminal 92-112 and 72-81 did not co-locate. The result of BiFC essay indicated that LEF-11 protein N-terminal 2-61, 12-61, 22-61, 32-61, 42-61 and 2-51 could interact with the full length of LEF-11 protein, but the 2-41 and 52-61 truncated fragments did not interact with the full length of LEF-11 protein. It was compatible with the result of N-terminal fragments fluorescence localization.The 42-51 and 82-91 truncated fragments were identified as the key areas for the baculovirus LEF-11 protein self-interaction and could be used in LEF-11 protein related functional studies.

; BmNPV; LEF-11; bimolecular fluorescence complementation; self-interaction

2017-04-17；接受日期：2017-05-12

國家自然科學基金（31472152）、國家蠶桑產業技術體系（CARS-22）

蔣亞明，E-mail：437313028@qq.com。通信作者潘敏慧，E-mail：pmh047@126.com