不同能量Er,Cr:YSGG激光照射對牙體硬組織抗酸作用的體外研究

劉思婧 李涢

臨床醫(yī)學研究

不同能量Er,Cr:YSGG激光照射對牙體硬組織抗酸作用的體外研究

劉思婧 李涢

目的探討Er,Cr:YSGG激光照射能量與牙體硬組織抗酸性之間的關系。方法采用2.5、 3.5、 5 W激光照射牙釉質樣本， 2、 3、 4 W激光照射牙本質樣本。經0.1 mmol/L乳酸液浸泡24 h后檢測鈣磷溶出量，能譜儀檢測樣本表面鈣磷原子百分比，SEM觀察表面形態(tài)。結果除2.5 W牙釉質組，其余牙釉質和牙本質實驗組鈣磷溶出量顯著低于對照組(P<0.05)，實驗組間無明顯差異。激光照射后牙釉質鈣磷比增加，牙本質鈣磷含量均無變化。SEM觀察顯示實驗組樣本表面粗糙，釉柱間隙增大，牙本質小管口周牙本管突出成袖口狀。結論一定能量的Er,Cr:YSGG激光照射可使牙硬組織抗酸性提高。

Er,Cr:YSGG激光； 牙釉質； 牙本質； 抗酸性

Er,Cr:YSGG激光是新一代水動力激光治療系統，當激光被工作端噴出的水霧吸收后，水霧體積急劇膨脹，產生微爆裂，可以達到切割組織的效果[1]。因其采用了非接觸式和點狀切割的工作方式，可避免渦輪機切割時產生的振動感，具有無痛治療效果[2]和避免牙髓不可逆性損傷[3]的優(yōu)勢，因而在齲病的預防和治療中具有良好的應用前景。研究顯示，Er,Cr:YSGG激光照射能增強牙體硬組織的抗酸性[4-8]，但尚不明確激光能量的改變與牙體組織抗酸性變化之間的關系。本研究分別選取多種激光能量進行牙面照射，經體外脫礦后檢測鈣磷溶出量，以了解不同激光能量對牙體組織抗酸性的影響；同時采用能譜檢測儀(X-ray energy dispersive spectroscopy，EDS)檢測樣本表面鈣磷含量、采用SEM觀察牙體表面形態(tài)，探究牙體組織抗酸性變化的機制，為臨床治療提供實驗依據及指導。

1 資料與方法

1.1 實驗儀器和試劑

Er,Cr:YSGG水激光口腔治療儀Waterlase MD(Biolaser, 美國); 全自動生化檢測儀， 冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡S-4800(日立，日本); 超聲波清洗機(Branson，美國); 乳酸液(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 離體牙收集

收集2014-08～2014-10在北京口腔醫(yī)院因牙周病、冠周炎等原因拔除的24 顆第三恒磨牙和48 顆恒切牙，要求牙冠完整，無齲壞、無缺損、無變色、無裂紋，無釉質發(fā)育不全，排除氟斑牙、四環(huán)素牙、死髓牙。

1.3 脫礦實驗過程

1.3.1 樣本制備 磨除48 顆切牙牙根，牙冠唇面釉質作為實驗面向外，包埋于自凝塑料內，制成48 個牙釉質樣本。將24 顆第三磨牙沿近遠中向切開，磨除牙根和頰或舌/腭面釉質，牙本質作為實驗面朝外，包埋于自凝塑料內，制成48 個牙本質樣本。以上樣本實驗區(qū)用水磨砂紙由粗到細(250、500、1 000 目)打磨。

1.3.2 實驗分組及處理 隨機選取40 個牙釉質樣本和40 個牙本質樣本，各自分為5 組， 即3 個實驗組、渦輪對照組和空白對照組。每組8 個樣本，實驗區(qū)大小均為3 mm×3 mm。

釉質實驗組分別使用2.5、 3.5和5 W的激光能量照射，牙本質實驗組采用2、 3和4 W的激光能量照射。對照組采用高速渦輪機EX-21型號金剛砂車針均勻磨除0.5 mm厚的牙體組織。空白組不做處理。

激光照射方法：將激光手柄固定，樣本放置于工作平臺上勻速平移，保持激光纖維頭末端與樣本實驗區(qū)之間距離始終為1 mm。照射時間為6 s，照射區(qū)域呈線狀，激光纖維頭直徑為0.6 mm，脈寬140 μs，脈沖頻率為20 Hz，氣水量為：牙釉質空氣量75%，水量85%；牙本質：空氣量65%，水量75%。

樣本經處理后，超聲蕩洗15 min，實驗區(qū)以外的區(qū)域涂雙層抗酸指甲油，晾干。

1.3.3 體外脫礦及鈣、磷離子溶出量的檢測 將每個樣本分別浸入8 ml pH=4.8的0.1 mmol/L的乳酸液中，37 ℃靜置24 h，然后取出樣本，使用全自動生化分析儀測定脫礦液中鈣、磷離子濃度，以此代表鈣磷溶出量。

1.4 激光照射樣本表面的鈣磷原子含量檢測

將余下的8 個牙釉質和8 個牙本質樣本分區(qū)進行激光照射，即每個樣本表面劃分5 個實驗區(qū)域，大小均為1.5 mm×1.5 mm，以渦輪磨切和不處理為對照，分別進行上述多種能量激光照射，照射方式和參數設置同上。樣本超聲蕩洗15 min后，自然干燥，表面噴金，在掃描電鏡視野下，采用EDS檢測各個區(qū)域的鈣磷原子百分比。

1.5 掃描電鏡觀察牙體表面形態(tài)

隨機選取能譜分析后的牙釉質標本2 個，牙本質標本2 個，采用掃描電鏡在1 000 倍放大視野下觀察樣本實驗區(qū)的表面形態(tài)。

1.6 統計學分析

使用SPSS 22.0統計軟件，采用Kruskal-Wallis檢驗，比較牙釉質和牙本質各5 組的鈣磷溶出量，同時對表面鈣磷原子百分比、鈣磷比進行統計學分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 樣本肉眼觀察結果

各樣本經過激光照射后，表面粗糙不平整，未見明顯碳化，牙釉質表面呈白堊色改變。

2.2 鈣磷溶出量的測定結果

各組樣本脫礦后鈣磷離子溶出量見表 1。

經Kruskal-Wallis檢驗分析，牙釉質各組和牙本質各組鈣磷溶出量差異具有統計學意義(P<0.01)。牙釉質樣本中，3.5 W組和5 W組鈣溶出量均低于對照組和空白組，差異具有統計學意義(P<0.05)， 3.5 W組和5 W組之間的差異無統計學意義(P>0.05)； 3 個實驗組磷溶出量低于對照組和空白組，差異具有統計學意義(P<0.05)。牙本質樣本中， 3 個實驗組鈣磷溶出量均低于對照組和空白組樣本，差異具有統計學意義(P<0.05)，不同實驗組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。 同一類型樣本的渦輪組和空白組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。

Tab 1 The cumulative aount of dissoved Ca and P of the samples in lactic buffer solution after 24 h

(mmol/L，±s)

注： ①與牙釉質渦輪組相比較,P<0.05； ②與牙釉質空白組相比較,P<0.05； ③與牙本質渦輪組相比較,P<0.05； ④與牙本質空白組相比較,P<0.05

2.3 樣本表面鈣磷含量的EDS測定結果

經EDS檢測，各組樣本表面鈣磷原子百分比和鈣磷比見表 2。

注： ①與牙釉質渦輪組相比較,P<0.05； ②與牙釉質空白組相比較,P<0.05

牙釉質組結果：經Kruskal-Wallis檢驗分析，牙釉質5 組之間鈣原子重量百分比的差異無統計學意義(P>0.05)，磷原子重量百分比和鈣磷比的差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組和空白組牙釉質樣本相比，實驗組的鈣原子百分比無明顯變化，磷原子百分比明顯下降，鈣磷比明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。實驗組之間的差異無統計學差異(P>0.05)。

牙本質組結果：牙本質5 組之間鈣原子重量百分比、磷原子重量百分比和鈣磷比的差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 掃描電鏡觀察結果

SEM下激光照射區(qū)牙體組織表面均呈粗糙不平整狀，未見玷污層、熔融或碳化痕跡。牙釉質部分剖面可見明顯釉柱間間隙，激光能量越大，相鄰釉柱之間間隙越大(圖 1A～C)。牙本質則可見小管口清晰。多數牙本質小管口周圍的管周牙本質突出，管間牙本質凹陷，似“袖口狀”(圖 2A～D)。

A: 2.5 W激光照射后; B: 3.5 W激光照射后; C: 5 W激光照射后; D: 渦輪機磨切后; E: 正常牙釉質表面

圖 1 各組牙釉質樣本表面形態(tài) (SEM, ×1 000)

A: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 2.5 W; B： Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 3.5 W； C： Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 5 W； D： Enamel surface prepared using diamond burs; E: Untreated normal enamel surface

A: 2 W激光照射后; B: 2 W激光照射后; C: 3 W激光照射后; D: 4 W激光照射后; E: 渦輪機磨切后; F: 正常牙本質表面

圖 2 各組牙本質樣本表面形態(tài)

A: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 2 W; B: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 2 W; C: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 3 W; D: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 4 W; E: Prepared using diamond burs; F: Untreated normal dentin surface

Fig 2 Surface morphology of the dentin samples

3 討 論

自1989 年Kayano等[7-9]發(fā)現Er:YAG激光消融后周圍的牙釉質抗酸性增強以來，出現大量關于鉺激光照射增強牙體組織抗酸性的研究。比如Hossain及喬麗艷等人發(fā)現，采用6 W Er,Cr:YSGG激光照射后的牙釉質和5 W或4 W激光照射后的牙本質在乳酸脫礦液中鈣離子溶出量低于空白對照組。盡管還有學者探究了不同的激光照射條件對牙體組織抗酸性的影響，但由于采用的儀器不同，所使用的能量多數尚低于對組織產生切割效果的能量級別[10]，因此還不確定，在Er,Cr:YSGG激光達到切割牙體組織的能量范圍時是否均具有同樣的抗酸效果。

本實驗采用的Er,Cr:YSGG水動力激光治療系統在噴水條件下，采用2 W以上的激光能量即能達到硬組織被切割的效果[11]。在考慮本實驗采用的能量范圍時，我們發(fā)現如果能量設置過高會對牙體組織造成熱損傷。有研究指出當能量達到4.5 W時，電鏡下牙本質表面可見熔融物，正常組織形態(tài)有破壞[12]，因此，我們選用2、 3、 4 W的激光能量照射牙本質。同時選用了稍高的能量(2.5、 3.5、 5 W)照射牙釉質。因為激光切割牙本質的效率高于牙釉質，一方面正常牙本質的顯微硬度約為牙釉質的1/5，牙釉質抵抗破壞的能力強于牙本質；另一方面，牙本質中有機物和水含量均明顯高于成熟的牙釉質，而波長為2.79 μm的Er,Cr:YSGG激光極易被水吸收，牙本質中的水分子吸收能量后可以較快達到一定的切割效果。因此，為了既能避免對牙釉質和牙本質造成熱損傷，又能與臨床操作的選擇相近，我們選用本實驗中的幾個激光能量級別進行牙體組織照射。實驗結果也證實電鏡下未發(fā)現實驗區(qū)組織表面出現熱損傷。

本研究結果顯示，除2.5 W牙釉質組外，其余實驗組鈣磷溶出量均明顯低于渦輪組和空白組，說明一定能量的Er,Cr:YSGG激光照射后可增強牙釉質和牙本質的抗酸性。這與Hossain等學者的研究結果相似[7-8]。 2.5 W組鈣溶出量較對照組也有下降趨勢，但差異無統計學意義，提示低能量激光照射牙釉質抗酸性的提高不明顯。Diaz-Monroy等[10]也發(fā)現在使用較低的Er:YAG激光能量制備窩洞后牙釉質抗酸性無明顯變化。

激光照射后牙體組織抗酸性增加的機制主要與組織表面溫度變化有關。一種解釋是熱效應導致牙體組織碳酸鹽和結晶水減少，純化了羥基磷灰石，并在照射后可能形成焦磷酸鹽，改變牙體微晶結構，降低溶解性[13]；另一種解釋是熱效應使有機基質變性，占據牙體組織中的空隙，造成滲透性下降，可以阻礙無機物溶解，促進再礦化[14-15]。

通過EDS檢測，本實驗發(fā)現激光照射后牙釉質表面Ca/P比值有明顯增高，這與Diaz-Monroy等[16]的研究結果相似，有學者分析，這可能是由于激光導致照射區(qū)溫度增高，使得組織表面生成抗酸性略高于碳酸化羥基磷灰石和碳酸鹽的β-Ca3(PO4)2，達到了純化羥磷灰石的效果，因而，被照射后的樣本整體抗酸性增強。而Mine等[13]則認為造成牙體組織Ca/P比值降低的原因可能是，在熱效應的作用下組織會生成抗酸性高的焦磷酸鹽，使得磷含量增加，Ca/P比降低。本實驗激光照射后牙本質表面鈣磷含量及Ca/P比值較正常牙體組織均無明顯差異，這與Shahabi等[17]的研究結果相似，說明，牙本質抗酸性增加不僅可能與組織成分或分子晶體改變有一定關系，還可能與牙本質中更為豐富的有機基質發(fā)生變性，降低組織滲透性有關。激光照射后牙體組織抗酸性改變及其機制還沒有明確定論，還需要更深入的研究以明確激光照射與牙體抗酸性變化之間的關系，深入了解激光的作用機制。

本研究中，牙本質3 個實驗組之間、牙釉質3 W組和5 W組之間鈣磷溶出量無明顯統計學差異。說明在一定的能量范圍內，不同的激光能量不會顯著影響牙體硬組織抗酸性的變化程度。原因可能是這些激光能量能充分激活水霧和組織中水分，使組織表面溫度變化達到改變組織結構和成分的程度；而激光脈沖式的照射方式，會減少熱積累而使組織表面溫度變化差異不明顯。

綜上所述，除了2.5 W能量照射牙釉質外，我們選用的Er,Cr:YSGG激光能量參數照射均可使牙體組織獲得一定的抗酸性，但口內條件下是否能達到良好的抗酸防齲效果還有待進一步研究。

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TheeffectofEr,Cr:YSGGlaserirradiationontheacquiredacidresistanceofenamelanddentininvitro

LIUSijing，LIYun.

100050Beijing,DepartmentofEndodontics,SchoolofStomatologyCapitalMedicalUniversity,China

Objective: To investigate the acid resistance of tooth hard tissues irradiated by different power outputs of Er,Cr:YSGG laser.MethodsSamples in laser groups were irradiated using Er,Cr:YSGG laser with the power outputs of 2.5, 3.5 and 5 W for enamel and 2 W, 3 W and 4 W for dentin, respectively. The calcium and phosphate ion dissolved was measured after decalcification in lactate buffer solution for 24 h. The atomic percentage of calcium and phosphate on the surface of samples was examined by X-ray energy dispersive spectroscopy and the morphological changes were investigated by SEM.ResultsIn all laser groups of enamel samples except 2.5 W group calcium and phosphate ion dissolved less than in control group and block group(P<0.05). There's no statistic difference between different power groups. Compared with control group and block group, Ca/P ratio increased(P<0.05). There's no statistic difference of the atomic percentage of Ca and P on the surface of dentin samples between each 2 groups. SEM observation showed that the surface of the laser irradiated samples was rouph, the space among enamel fibers was increased, the dentin around dentinal tuble orifice was protruded and looked like collar flange.ConclusionEr,Cr:YSGG laser irradiation with a range of power is effective in increasing acquired acid resistance of dental hard tissue. There was no relationship between laser power outputs and acid resistance.

Er,Cr:YSGGlaser;Enamel;Dentin;Acidresistance

國家自然科學基金(編號： 81400515)

100050 北京， 首都醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院牙體牙髓科[劉思婧(現在重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院) 李涢]

李涢 010-57099232 E-mail： liyun_prc@126.com

R780.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.008

(收稿： 2016-12-07 修回： 2017-06-06)