蘆薈提取物對脂多糖誘導的人牙周膜細胞炎性反應的抑制作用

張雙 高鷹 李黎仙 杜俊蓉

蘆薈提取物對脂多糖誘導的人牙周膜細胞炎性反應的抑制作用

張雙 高鷹 李黎仙 杜俊蓉

目的探討蘆薈(AVE)提取物對脂多糖(LPS)誘導人牙周膜細胞(hPDLCs)炎性反應的作用。方法將hPDLCs分為對照組，模型組(1 μg/ml LPS)和AVE組，濃度為0.05，0.1， 0.2 mg/ml的AVE分別處理AVE組的hPDLCs； MTT法測定各組細胞存活率； ELISA法檢測細胞上清中IL-6含量；用免疫細胞化學染色檢測TLR4的表達情況；免疫熒光染色檢測NF-κB-p65的核轉情況。結果各組細胞存活率差異沒有顯著性，模型組上清液中的IL-6含量顯著升高， TLR4表達及 NF-κB-p65的核轉均明顯上調；與模型組相比，蘆薈提取物呈劑量依賴性抑制細胞上清液中IL-6的分泌，下調TLR4表達及NF-κB-p65的核轉移。結論蘆薈提取物能有效抑制人牙周膜細胞的炎癥反應，其機制與TLR4/NF-κB-p65信號通路有關。

蘆薈提取物(AVE)； 人牙周膜細胞(hPDLCs)； 脂多糖(LPS)

牙周炎是細菌引起的慢性炎癥，往往引發牙周支持組織的炎性破壞。人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)免疫應答是牙周組織結構完整或者破壞的重要決定因素[1]。牙周炎主要是由革蘭氏陰性菌引起的[2-3]，而脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。Toll 樣受體(Toll like receptors, TLRs)是一類天然免疫受體，TLR4是其主要成員之一，研究表明hPDLCs被 LPS 刺激后，經一系列信號轉導，激活細胞核轉錄因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)從而調節各種炎癥因子的表達[4]，參與牙周組織破壞。因此如何調控hPDLCs炎癥反應的發生，對牙周炎的防治具有重要意義。

蘆薈為百合科蘆薈屬多年生肉質草本植物，集食用、藥用、美容、觀賞于一身。文獻報道，該植物具有抗炎、促進傷口愈合、增強免疫功能、降血糖等多種藥理活性[5-6]。目前，蘆薈提取物對牙周炎的防治作用鮮有報道，本研究從細胞水平探討蘆薈提取物對LPS誘 導下的hPDLCs炎癥的抑制作用并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與藥物來源

1.2 主要儀器與試劑

LPS(E.coliO55:B5，Sigma，美國)；IL-6 Elisa試劑盒(北京達科為生物技術有限公司)；α-MEM培養基(Hyclone，美國)；胎牛血清(民海生物)；DMSO，MTT(Amresco，美國)；兔抗TLR4單克隆抗體、羊抗兔FITC、抗熒光衰減封片劑、4, 6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色劑、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)；羊抗兔NF-κB p65單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；倒置式生物顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司)；酶標儀(Bio-RAD Model 550,美國)；顯微鏡及照片獲取系統(Olympus，日本)。

1.3 細胞培養

將凍存的hPDLCs復蘇，用含10%胎牛血清和1%青霉素、1%鏈霉素的α-MEM培養基，在37 ℃、5%CO2孵箱中進行培養， 1∶3比例進行傳代，選取4～6 代細胞用于實驗。

1.4 實驗分組

實驗分為5組，包括對照組，模型組(1 μg/ml LPS)，蘆薈提取物低劑量組(0.05 mg/ml)，中劑量組(0.1 mg/ml)，高劑量組(0.2 mg/ml)。

1.5 MTT法檢測細胞活性

從DDoS攻擊的發展歷程，我們不難看出，在如今這個虛擬網絡已經嵌入我們現實生活的社會里，DDoS攻擊無疑是一個巨大的安全隱患。伴隨著DDoS工具的廉價性、易獲取性，以及各僵尸網絡家族的快速增長，利用物聯網設備組建僵尸網絡發起攻擊的現象日益嚴峻，與此同時，移動端的僵尸網絡亦處于萌芽階段，網絡安全之路可謂任重道遠。

將對數生長期的hPDLCs(1×105/ml) 接種于96 孔板，于37 ℃、 5% CO2培養箱中培養24 h，按各組濃度進行造模或給藥，每組3 個復孔，繼續培養24 h后，每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，常溫下搖床搖10 min，在酶標儀490 nm 波長測吸光度值，取3 孔平均值，計算細胞存活率(實驗組A490/空白組A490×100%)。重復3 次。

1.6 ELISA法檢測IL-6的含量

將對數生長期的hPDLCs(1×105/ml) 接種于96 孔板，于37 ℃、 5% CO2培養箱中培養24 h，按照各組濃度預防給藥1 h， 1 μg/ml LPS造模作用24 h， 每組9 個復孔，收集培養上清，根據Elisa試劑盒說明書測定細胞上清液中IL-6含量。

1.7 免疫染色法測定TLR4的表達

將對數生長期的hPDLCs(3×104/ml) 接種24 孔板爬片，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，取對照組、模型組、高劑量組，預防給藥1 h，每組3 個復孔，1 μg/ml LPS造模作用24 h后，SABC免疫細胞染色法進行DAB染色，蘇木素染核，脫水透明后，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察TLR4表達情況。

1.8 免疫熒光染色法檢測NF-κB-p65的核轉狀況

將對數生長期的hPDLCs(3×104/ml)接種24 孔板爬片，于37 ℃、 5% CO2培養箱中培養24 h，取高劑量組預防給藥1 h。 1 μg/ml LPS造模1 h后， PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min， PBS洗3 次，1 min/次，0.3% Triton X-100打孔30 min，PBS漂洗3 次， 1 min/次，3% H2O230 min氧化內源性過氧化物酶， PBS洗3 次，1 min/次，5% 牛血清 37 ℃封閉1 h，一抗(1∶50)4 ℃過夜，PBS洗3 次，熒光二抗37 ℃避光孵育1 h， DAPI染核1 min，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察NF-κB-p65的表達情況。每組3 個復孔。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 蘆薈提取物對hPDLCs細胞活性的影響

與對照組比較，模型組、蘆薈提取物低、中、高劑量組中細胞活力無顯著差異(P>0.05, 表 1)。

注： 與對照組比較, ①P>0.05

2.2 蘆薈提取物對細胞上清液中IL-6 含量的影響

與正常組比較，模型組中IL-6含量顯著提高(P<0.05)。與模型組比較，蘆薈提取物低、中、高劑量組hPDLCs細胞上清中IL-6 含量均顯著下降(P<0.05)，并且呈劑量依賴性(表 2)。

注： 與模型組比較, ①P<0.01， ②P<0.05

2.3 蘆薈提取物對LPS誘導的hPDLCs中TLR4蛋白的影響

與對照組相比，模型組的TLR4陽性表達明顯上調。與模型組相比，蘆薈提取物高劑量組TLR4陽性表達顏色明顯變淺，表達下調(圖 1)。

2.4 蘆薈提取物對NF-κB-p65的作用

對照組NF-κB-p65基本分布在胞漿中，模型組NF-κB-p65核轉明顯增多，蘆薈提取物高劑量組NF-κB-p65的核轉明顯減少(圖 2)。

3 討 論

牙周炎是常見的口腔感染性疾病，已成為突出的口腔保健問題。 據報道， 蘆薈具有抗炎作用[5]， 本研究就蘆薈提取物對LPS誘導hPDLCs炎癥的抑制效果進行了探討。研究結果表明，蘆薈提取物能夠抑制LPS誘導hPDLCs分泌IL-6，其抗炎機制可能與抑制TLR-4介導的NF-κB信號通路有關，提示蘆薈提取物可能是牙周疾病預防與治療的有效藥物。

A: 對照組； B: 模型組； C: 高劑量組

圖 1 蘆薈提取物對牙周膜細胞TLR4表達的影響 (×200)

A: Control group; B: Model group; C: AVE of 0.2 mg/ml

Fig 1 The effects of AVE on TLR4 expression in LPS-induced hPDLCs (×200)

圖 2 蘆薈提取物對LPS誘導牙周膜細胞NF-κB-p65核內轉的作用 (×400)

Fig 2 The effects of AVE on the transfer of NF-κB-p65 into the nucleus in LPS-induced hPDLCs (×400)

hPDLCs在牙周炎的發生及發展過程中發揮著重要作用[1]。牙周炎的主要致炎因子LPS能促進如IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達，參與牙周組織的破壞。因此，抑制炎癥因子的產生有益于減緩牙周疾病的發展進程[7]。IL-6具有多種生物學效應，在牙周疾病中參與局部炎癥反應及牙周組織的破壞。研究表明，IL-6不僅在牙周組織中能夠誘導破骨細胞的生成[8]，還與牙周袋的深度密切相關[9]。牙周炎患者齦溝液中IL-6的含量顯著高于健康人齦溝液中IL-6的含量，表明IL-6在某種程度上是牙周炎的嚴重程度的重要標志[10]。本研究中，蘆薈提取物對LPS誘導hPDLCs分泌IL-6有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性。這些結果提示，蘆薈提取物對LPS誘導的hPDLCs的炎癥反應有較好的抗炎效果。

TLR4是LPS的主要受體，二者結合后，通過相關信號轉導激活NF-κB，從而誘發一系列炎癥因子如IL-1β、IL-6等的產生[3]。正常狀態下，NF-κB-p65在胞漿中與 NF-κB 抑制蛋白(Inhibitor of NF-κB，IκB)相結合[11]，處于非活化狀態。在LPS刺激下，TLR4與髓樣分化因子88結合，活化后的髓樣分化因子88使得IL-1受體相關激酶發生一系列磷酸化反應[12]，IκB 磷酸化后，與NF-κB-p65形成的蛋白復合體解離，游離的 NF-κB-p65 進入細胞核，與相關位點的DNA鏈結合，從而發揮其調節轉錄功能[13-14]，調節多種炎癥介質和細胞因子的表達，引起一系列炎癥因子產生，促進牙周病的發生和發展。本實驗探究了蘆薈提取物對LPS誘導下hPDLCs中TLR4及NF-κB-p65的影響，結果顯示庫拉索蘆薈凝膠凍干粉能夠抑制LPS誘導的TLR4蛋白的表達以及NF-κB-p65的核轉，進而抑制下游靶基因IL-6的生成。

綜上所述，本研究選用的蘆薈提取物對LPS誘導的hPDLCs炎癥反應有一定抑制效應，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關。但值得注意的是，在本課題組同步進行的LPS誘導人牙齦成纖維細胞炎癥反應研究中，蘆薈提取物并沒有抗炎活性(組內結果)。為何庫拉索蘆薈凝膠凍干粉對hPDLCs和人牙齦成纖維細胞炎癥反應的影響有明顯差異，值得進一步深入研究以闡明其藥理學機制，為蘆薈提取物在口腔保健產品中的合理應用提供可靠的實驗依據。

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Theinhibitoryeffectsofaloeveraextractonlipopolysaccharide-inducedinflammatoryresponseinhumanperiodontalligamentcells

ZHANGShuang1,GAOYing2,LILixian2,DUJunrong1.

1. 610041Chengdu,DepartmentofPharmacology，WestChinaCollegeofPharmacy,SichuanUniversity,China; 2.YunnanBaiyaoGroupCo.,Ltd,Kunming

Objective: To explore the effects of aloe vera extra(AVE) on lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammatory response of human periodontal ligament cells(hPDLCs).MethodshPDLCs were induced with LPS at 1 μg/ml for the simulation of periodontitis model(model group) and then treated by AVE at 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml respectively(AVE group). Cell viability was examined by MTT assay. The level of interleukin-6(IL-6) from cell culture medium was measured by ELISA. The expression of Toll like receptor 4(TLR4) protein was detected by immunocytochemistry staining and the transfer of nuclear factor-kappa B p65(NF-κB-p65) was observed by immunofluorescence staining.ResultsThere was no significant difference of the cell viabilities among the groups. IL-6 in culture medium, the expression of TLR4 protein and the transfer of NF-κB-p65 into the nucleus were increased in model group. AVE at 0.05-0.2 mg/ml inhibited the secretion of IL-6 in the cell culture supernatant down-regulated the TLR4 expression, attenuated the transfer of NF-κB-p65 into the nucleus in a concentration-dependent manner.ConclusionAloe vera extract can inhibit the inflammation response of hPDLCs induced by LPS through TLR4/ NF-κB-p65 signaling pathway.

Aloeveraextract(AVE);Humanperiodontalligamentcells(hPDLCs);Lipopolysaccharide(LPS)

610041, 四川大學華西藥學院藥理學系(張雙 杜俊蓉)； 云南白藥集團股份有限公司(高鷹 李黎仙 )

杜俊蓉 E-mail： dujr_1@163.com

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.020

(收稿： 2016-10-18 修回： 2016-12-19)