氟化鈉-殼聚糖凝膠對乳牙釉質早期齲再礦化實驗觀察

周紅艷 臧睿覺 王玨 劉茜 張曉旻 曹靈 梅予鋒

氟化鈉-殼聚糖凝膠對乳牙釉質早期齲再礦化實驗觀察

周紅艷 臧睿覺 王玨 劉茜 張曉旻 曹靈 梅予鋒

目的探討氟化鈉殼聚糖凝膠促進乳牙釉質早期齲模型再礦化的可行性。方法乳前牙試件使用乳酸羧甲基纖維素凝膠預處理，制備早期齲模型；早期齲的乳前牙試件隨機分成4 組(n=6)，3 組分別進行氟化鈉殼聚糖凝膠、殼聚糖空白凝膠、多樂氟處理，1 組作為空白對照，處理完成后進行pH循環，SEM、EDS檢測循環完成后的試件表面。結果SEM觀察，氟化鈉殼聚糖凝膠能更好的保護釉質表層結構不受破壞，而多樂氟和空白對照組，則表現出釉質表層的崩解。同時氟化鈉殼聚糖凝膠有更多的礦化物結晶在釉質表面形成。EDS檢測鈣離子的沉積比例，氟化鈉殼聚糖凝膠組明顯多于其余各組(P<0.05)。結論氟化鈉殼聚糖凝膠可以提高乳前牙早期齲的再礦化水平。

殼聚糖水凝膠； 氟化鈉； 乳牙； 早期齲； 再礦化

對于兒童牙病來說，早期齲的再礦化治療是一項理想的微創治療方法。促進再礦化的藥物對于這一微創治療來說是至關重要的。氟化物，CPP-ACP等都有很好的臨床應用。本實驗通過制備乳牙釉質早期齲模型，使用氟化鈉殼聚糖凝膠處理后，進行pH循環的再礦化治療，并通過SEM及EDS觀察再礦化的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

乳前牙，南京醫科大學附屬口腔醫院兒童牙病科拔出的乳前牙24 顆，已征得患兒及家長同意，要求乳前牙沒有齲壞，磨耗量適中保證唇面釉質的大小，釉質表面沒有裂紋，拔出時注意不要用力過猛，造成不必要的裂紋。

殼聚糖氟化鈉凝膠(單位自制，正在申請專利)。

多樂氟(Sigma,美國),乙酸、無水氯化鈣、磷酸二氫鉀、羧甲基纖維素鈉(AR，滬試)，HEPES(AR，Sigma),掃描電鏡(JSM-6360LV)，能譜儀(GENESIS-2000XMS60)。

1.2 方法

1.2.1 釉質試件制備 選取拔除的乳前牙24 顆，用金剛砂平頸緣去除牙根，橡皮輪拋光釉質表面，三用槍沖洗表面30 s后，置于去離子水中，4 ℃冰箱保存。

存放24 h后，取出乳前牙，使用低速切割機切去厚約3 mm除唇側釉質片。釉質片唇側中央預留3 mm×3 mm的實驗區域，其余部分用抗酸指甲油，涂3 遍，待指甲油干燥后，置于去離子水中，4 ℃冰箱保存。

1.2.2 釉質試件處理 稱取64.4 g羧甲基纖維素鈉顆粒，7.46 ml乳酸，用1 L去離子水充分攪拌24 h，pH儀測定其pH值。取出釉質片，用吸水紙吸干表面水分，全部浸沒在乳酸羧甲基纖維素鈉凝膠中，放入37 ℃恒溫箱48 h，制作早期齲模型。從凝膠中取出釉質片，三用槍沖洗1 min去除表面的凝膠后，置于去離子水4 ℃冰箱中備用。取早期齲模型的釉質片，隨機分成4 組(n=6)，3 組分別進行藥物涂布，均勻地涂上氟化鈉殼聚糖凝膠，殼聚糖空白凝膠，多樂氟，每組涂布1 min, 靜置4 h，另一組不處理作為空白對照。

1.2.3 pH循環實驗 去離子水配制1 L含1.5 mmol/L CaCl2、0.9 mmol/L KH2PO4及4.766 2 g HEPES的再礦化液，去離子水配制1 L含1.5 mmol/L CaCl2、0.9 mmol/L KH2PO4及50 mmol/L乙酸的脫礦液。

對各組釉質片每片進行pH循環處理，每次5 ml脫礦液3 h， 5 ml再礦化液21 h，換液之間，用去離子水沖凈，吸水紙吸干。經過7 d的循環，取出釉質片，去離子水洗凈，放入去離子水中4 ℃冰箱保存。

1.2.4 釉質試件再礦化檢測 各組釉質片進行SEM及EDS測定，收集整理數據。

1.3 統計學處理

統計數據，SPSS 19軟件統計分析。

2 結 果

2.1 SEM結果

各組再礦化后電鏡顯示，氟化鈉殼聚糖凝膠組(圖 1A、E)釉質表面結構粗糙，孔隙大部分被新生的礦物質結晶所堵塞，結晶結構相對統一，能看到明顯的結晶形態。殼聚糖空白凝膠組(圖 1B、F)釉質表面呈蜂窩狀凹陷，大量的孔隙結構暴露，個別孔隙被結晶結構堵塞。多樂氟組(圖 1C、G)釉質表面粗糙，有散在的不規則結晶結構，同時也能觀察到不少孔隙。空白對照組(圖 1D、H)釉質表面形態不規則、粗糙，大量的孔隙結構，少數的結晶結構。

2.2 EDS檢測結果

圖 1 各組再礦化后釉質表面 (SEM, A～D: ×1 000； E～H： ×1 500)

Fig 1 Enamel surface of the each group after remineralization

(SEM, A～D: ×1 000； E～H： ×1 500)

2.2.1 F元素、P元素、Ca元素方差分析 F、P的元素組間比較均無統計學意義(P>0.05)，Ca元素的單因素方差分析氟化鈉殼聚糖凝膠組高于其余各組(P<0.05)，其余各組兩兩比較無統計學差異(表 1，圖 2)。

圖 2 各組樣本F、P、Ca元素比例比較(%)

3 討 論

早期齲的形成主要是釉質在細菌的酸性產物作用下，引起釉質晶體結構脫礦，羥基磷灰石的結構遭到破壞，鈣磷等離子從中流失。最早期的表現就是釉質的顏色發生變化，呈現白堊色。這一變化，在臨床治療中經常能夠見到。早期齲出現后，針對病癥的治療是當下研究的熱點，控制早期的齲病不再發展，可抑制基質結構的崩塌這樣不可逆的結果的發生[1]。Gurunathan[2]、Sk?ld-Larsson[3]等的實驗指出了再礦化治療釉質白色病損的機制和方法，這樣的早期齲壞經過治療是可逆的，因為唾液中的鈣磷是處于飽和的平衡狀態，脫礦的釉質在一天中是不斷地和唾液接觸，脫礦和再礦化對于釉質來說是一個每天不斷進行的過程。

本項目另一部分實驗研究證實本課題制作的氟化鈉殼聚糖水凝膠為智能型凝膠，隨溫度升高凝膠由液相向膠體相的轉變，在溫度達到37 ℃時，8 min內迅速變成薄膜狀緊密附著在牙面。pH值接近中性，生物相容性較好。作為大分子多糖，凝膠化后，提供的空間可以作為藥物的良好載體。口腔局部用藥，參考多樂氟這一口腔涂氟經典藥物，4 h時的作用時間，可以達到70%多的藥物釋放量，可以充分地發揮藥物的作用。因此本實驗使用氟化鈉殼聚糖溫敏凝膠進行乳牙釉質早期齲再礦化研究是可行的。

氟化物可以促進釉質的再礦化這一理論早已被寫進教科書，這是因為氟離子的大小與羥基接近，且結合能力強，可以置換羥基磷灰石中的羥基和碳酸根，并填補羥基磷灰石的一些離子空隙，形成的氟磷灰石穩定性更高，強度更大。本研究通過SEM可以直觀的觀察到釉質的表層結構，通過區分結構的變化說明處理對于釉質的作用。高潔等[58]的實驗，通過掃描電鏡觀察乳切牙牙體結構，展示了正常乳切牙的釉質表面結構，釉質與牙本質的相接的結構，為乳牙的釉質形態觀察展示了良好的辦法。郭青玉[4]、金燕[5]、劉梅天[6]等指出SEM觀察下，未處理時牙釉質的表面形態光滑,而酸蝕后的牙釉質表面呈現多孔的蜂窩狀或魚鱗狀結構，這種酸蝕后描述上的差異可能與投照的角度有關，并指出了經過再礦化實驗后釉質結構呈現散在的礦化結節，表面粗糙，這些實驗支持了本實驗觀察到的結果。首先空白對照組，在單純的pH值循環后出現少量的結晶結構散在釉質表面，表面結構粗糙，孔隙較多，說明再礦化作用不明顯；多樂氟組的釉質表面觀察到了更多的結晶結構，但仍為散在的分布于表面，表面粗糙，與光滑的釉質表面結構有所區別；而殼聚糖空白凝膠組，觀察到的釉質表面結構為鱗片狀的大量的孔隙結構，釉質表面在經過了pH值循環之后，只有少量的礦物質結晶的形成；氟化鈉殼聚糖凝膠的SEM觀察結果，顯示了脫礦的孔隙周圍在經過了pH值循環后大量的結晶結構排列并阻塞了釉質表面的孔隙。SEM的結果提示，殼聚糖凝膠可能滲透入釉質的脫礦孔隙中，釉柱的直徑約4～6 μm，釉柱峭即釉柱間隙要小于這一寬度，殼聚糖凝膠這一高聚物的大分子結構可能僅能夠滲透入酸蝕后的釉質孔隙中，這與本課題的另一實驗結果，相呼應。

Arnaud的實驗[7]指出單純殼聚糖鹽酸溶液能夠滲透入正常釉質表面的孔隙當中形成屏障作用來達到抗酸蝕的作用，正常釉質表面的孔隙多來自釉柱間隙，本實驗中殼聚糖凝膠表現為阻止了釉質孔隙結構與礦化液的接觸沒有形成礦化物結晶結構。同時殼聚糖凝膠在pH值循環后，釉質表面的結構和酸蝕后的蜂窩狀結構極為相似，而多樂氟及空白對照組pH值循環后表面粗糙，散在的礦化物結晶，無類蜂窩狀的結構；氟化鈉殼聚糖凝膠則表現為大量的礦化物結晶阻塞孔隙，結晶結構為條索狀，酸蝕后的蜂窩狀結構也隱約可見，提示了與多樂氟相比氟化鈉殼聚糖凝膠及殼聚糖凝膠有維持釉質表面結構不變的能力，這與當今的早期齲微創治療原則不謀而合。Zhou等[8]通過AFM觀察，酸蝕過后的釉質表面經過再礦化處理后，孔隙結構可以被結晶所填塞，礦化效果越好，其表面結構約趨于平坦；本實驗中氟化鈉殼聚糖凝膠SEM結果提示有大量的礦化物結晶形成，再礦化治療的效果明顯。

EDS，全稱是energy dispersive spectrometer即能量色譜儀用來對材料微區成分元素種類與含量進行。電子轟擊表面結構，散射出來的不同波普的X線經過收集，電腦處理，比較出這一區域的元素構成比，比例的不同，提示了酸蝕處理后釉質表面經過再礦化之后的元素變化。釉質表面的鈣磷以及氟在一定程度上是成比例的，而且這一比例一般情況下不會發生變化，Peric的實驗[9]也指出了EDS檢測的元素比例即便在再礦化后沒有顯著性的差異。由本實驗統計結果可知，氟及磷的元素含量在各組之間沒有統計學差異，各組含量均值近似相等，這可能與氟化鈉殼聚糖凝膠及多樂氟的藥物在預處理完酸蝕后的釉質表面后即去除，而后經歷了pH值循環，氟元素并沒有更多的沉積在釉質表面有關，并且氟和磷達到了一個平衡值；鈣元素的含量，氟化鈉殼聚糖凝膠明顯要高于多樂氟、殼聚糖空白水凝膠及空白對照組，這與SEM的觀察結果是統一的，多樂氟、空白對照組都有少數結晶結構堵塞了釉質表面的孔隙結構，殼聚糖空白水凝膠則表現為孔隙暴露，沒有更多的結晶結構形成，此三組都沒有更多的Ca元素沉積，而氟化鈉殼聚糖凝膠組有大量的礦化物結晶在孔隙周圍形成阻塞了釉質酸蝕后的孔隙結構，所以EDS測定后有更多的Ca元素的沉積，Amaechi[10]用EDS檢測也證明了Ca元素比例的變化。說明氟化鈉殼聚糖凝膠相較于其他各組促進釉質再礦化的能力都要高。

氟化物作為治療早期齲的經典藥物，局部用氟的方法很多，但使用含氟凝膠后，可在牙齒表面形成一層半透明的薄膜，持續緩慢釋放氟離子，同時此薄膜具有一定的粘接性，很難從牙齒表面去除[11]，不易脫落，并且由醫生操作，不用擔心因患者使用劑量的不合適而造成的中毒反應。Magalh?es的研究[12]指出，多樂氟是一個酸性的凝膠，這一產品已經作為美國FDA的治療和預防齲病的一個金標準。本實驗所研制的氟化鈉殼聚糖凝膠，實驗結果表明用于治療早期齲的效果優于多樂氟，而且殼聚糖水凝膠的生物相容性良好，配置的原料易獲得，價格相對較便宜，這為氟化鈉殼聚糖凝膠成為治療早期齲的有效藥物提供了良好的基礎。

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Aninvitrostudyofre-mineralizationofenamelwithearlycariesinprimaryteethtreatedbyNaF-chitosangel

ZHOUHongyan1,ZANGRuijue2,WANGJue1,LIUQian1,ZHANGXiaomin1,CAOLing1,MEIYufeng1.

1. 210029,DepartmentofPediatricDentistry,NanjingStomatologicalHospital,JiangsuKeyLaboratoryofOralDiseases,NanjingMedicalUniversity,China; 2.DepartmentofPediatricDentistry,AffiliatedHospitalofStomatology,NanjingMedicalUniversity

Objective: To estimate the remineralization of enamel of primary teeth with early caries protreated by NaF-chitosan gel.MethodsEarly stage caries was created on anterior primary teeth. The samples were divided into 4 groups randomly(n=6), and treated by NaF-chitosan gel, chitosan gel, duraphat and non-treatment(the control) respectively. Then all samples were underwent a 7 days pH cycle. Then samples were tested with SEM and EDS. Data were analyzed with SPSS 19.ResultsThe SEM data showed that chitosan gel protected the enamel surface from being ruined by erosion. NaF-chitosan gel group showed more mineral crystal formation on the enamel surface. The NaF-chitosan gel group showed more Ca remineralized on the enamel surface.ConclusionNaF-chitosan gel can increase the remineraliztion of on the anterior primary teeth with early stage caries.

Chitosangel;NaF;Primaryteeth;Remineralization

江蘇省衛生計生委預防醫學科研課題(編號： Y2015051)； 江蘇高校品牌專業建設工程資助(編號： PPZY2015B163)

210029， 南京醫科大學口腔疾病研究江蘇省重點實驗室, 南京醫科大學口腔醫學院兒童口腔科預防口腔科(周紅艷 王玨 劉茜 張曉旻 曹靈 梅予鋒)； 南京市口腔醫院兒童口腔科(臧睿覺)

梅予鋒 025-85031837 E-mail： yfmei@njmu.edu.cn

R780.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.026

(收稿： 2016-12-12 修回： 2017-06-02)