鐵皮石斛花多糖相對(duì)分子質(zhì)量及其單糖組成的研究

張四杰　錢正　劉京晶　張新鳳　斯金平

[摘要]為了明確鐵皮石斛花中多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布及其單糖組成，該研究采用高效凝膠色譜和柱前衍生UPLC對(duì)11個(gè)鐵皮石斛花樣品的多糖進(jìn)行了相對(duì)分子質(zhì)量及其單糖組成分析，并利用SPSS 190軟件根據(jù)組成的單糖峰面積進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明11個(gè)雜交家系鐵皮石斛花的粗多糖均分離為三部分（DOP1，DOP2和DOP3），其平均相對(duì)分子質(zhì)量分別為553×105，349×105和212×105。鐵皮石斛花多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖5種單糖組成，其中甘露糖組成比例最高，其與葡萄糖比值為0302～3335；不同家系樣品多糖中各單糖的相對(duì)含量存在一定差異，11個(gè)家系按單糖組成及相對(duì)含量劃分為4類，該研究基本明確了鐵皮石斛花中多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布及單糖構(gòu)成，為其資源利用打下基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]鐵皮石斛花； 多糖； 相對(duì)分子質(zhì)量分布； 單糖組成； 高效凝膠色譜； 超高效液相

[Abstract]In order to provide new information on polysaccharide in Dendrobium officinale flowers，the monosaccharide composition and relative molecular mass distribution of 11 families of flowers were investigated and analyzed by high performance gel filtration chromatography （HPGFC） and precolumn derivatization ultra performance liquid chromatography （UPLC） in this study Then cluster analysis was carried out for the monosaccharide peak areas by utilizing SPSS 190 software The results showed that the polysaccharides of all the above 11 hybrid families of D officinale flower were separated into three fractions （DOP1， DOP2 and DOP3） with the average relative molecular mass of 553×105， 349×105 and 212×105 The polysaccharides in 11 different families were mainly composed of glucose， mannose， galactose， galacturonic acid and arabinose； mannose had the highest proportion among them， with mannose/glucose ratio of 03023335 Additionally， the relative contents of various monosaccharides in different families varied 11 families of D officinale flower could be classified into four categories according to their monosaccharide components and relative contents In this study， the relative molecular mass distribution and monosaccharide composition of polysaccharides in D officinale flowers were defined， which can provide foundations for its resource utilization.

[Key words]Dendrobium officinale flower； polysaccharide； relative molecular mass distribution； monosaccharide composition； HPGFC； UPLC

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kiumra et Migo屬蘭科石斛屬Dendrobium多年生附生草本植物，以莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津之功效[1]。在栽培生產(chǎn)中，鐵皮石斛花量較大，民間多鮮食或烘干泡茶，應(yīng)用歷史悠久。鐵皮石斛花具有舒緩精神緊張、滋陰護(hù)肝等功效[2]，主要含有多糖、黃酮碳苷、揮發(fā)性成分、氨基酸等主要成分[36]。藥典規(guī)定鐵皮石斛莖的多糖含量不低于2500%，其中葡萄糖與甘露糖比值為24～80，且多糖的活性與其相對(duì)分子質(zhì)量大小，含量和所含單糖組成比例密切相關(guān)[79]。鐵皮石斛花多糖含量低于莖[10]，但其相對(duì)分子質(zhì)量大小、組成多糖的單糖類型和組成比例與莖是否相同尚不清楚。為了更好地利用鐵皮石斛花資源，本實(shí)驗(yàn)選取11個(gè)雜交家系鐵皮石斛花，利用高效凝膠色譜分析多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布，并將粗多糖進(jìn)行柱前酸水解及衍生，采用UPLC測(cè)定多糖中單糖組成，明確鐵皮石斛花中多糖的具體相對(duì)分子質(zhì)量分布及單糖組成比例，以期為鐵皮石斛花質(zhì)量評(píng)價(jià)及資源利用提供理論依據(jù)。

1材料

Acquity超高效液相色譜儀（PDA檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)（RID檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司） ；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Thermo Scientific GENESYS 10s UVVIS）；DKS24型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；D37520型高速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；DHG9416A恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ALPHA 12 LD Plus凍干機(jī)（北京博勱行儀器有限公司）；AB104N電子分析天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）。endprint

鼠李糖（批號(hào) 111683200401）、D半乳糖醛酸（批號(hào) 111646200301）、D葡萄糖（批號(hào) 110833200503）、D葡萄糖醛酸（批號(hào) 140648200602）、D甘露糖（批號(hào) 140651200602）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；D半乳糖（批號(hào) 20120209）、D阿拉伯糖（批號(hào) 20120209）、木糖（批號(hào) B21880）對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；1苯基3甲基5吡唑啉酮（PMP）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為去離子水，乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

供試的11個(gè)不同雜交家系鐵皮石斛花樣品，2016年6月14日采集于浙江省臨安市天目山鎮(zhèn)橫塘村麻泥角弄（東經(jīng)119°26′11″，北緯30°20′30″，海拔280 m），經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)斯金平教授鑒定為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛花，經(jīng)過(guò)80 ℃殺青，60 ℃徹底烘干，粉碎，過(guò)60目篩備用。其中C13為天目山野生種質(zhì)，共有3種栽培模式，分別為巖壁附生（C13壁）、梨樹(shù)附生（C13梨）及盆栽（C13），其他均為智能溫室盆栽樣品，親本名稱及子代農(nóng)藝性狀見(jiàn)表1，圖1。

2方法

21鐵皮石斛花總多糖含量測(cè)定

211供試品溶液制備

精密稱定鐵皮石斛花干樣0300 0 g，加入蒸餾水200 mL，水浴回流25 h，趁熱過(guò)濾，定容到250 mL，搖勻靜置，取提取液5 mL于50 mL離心管中，加無(wú)水乙醇25 mL，4 ℃冷藏1 h，6 000 r·min-1離心1 h，棄上清液，沉淀加80%乙醇20 mL離心30 min，去上清液，最后沉淀加20 mL 80%乙醇離心20 min，棄上清液，沉淀加熱水溶解定容至50 mL。精密吸取1 mL提取溶液加1 mL 5%苯酚溶液，最后精密加入5 mL濃硫酸，混勻，冰水中靜置5 min，沸水浴20 min，取出冰水中放涼，以1 mL水為空白，于488 nm處測(cè)定吸光度，試驗(yàn)平行3次。

212標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取葡萄糖1000 0 mg，定容至10 mL，即配制成01 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)液，然后分別精密吸取01，02，04，06，08，1 mL標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加水補(bǔ)足至1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，精密加入5 mL濃硫酸，混勻，冰水中靜置5 min，沸水浴 20 min，取出冰水中冷卻，于488 nm 處測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其回歸方程為 Y=12898X+0064 1（R2=0999 8），結(jié)果表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0005～005 g·L-1與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

22鐵皮石斛花多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

221鐵皮石斛花粗多糖提取

稱取不同家系鐵皮石斛花粉末各0500 0 g，加入10倍體積水，水浴回流提取25 h，過(guò)濾，收集濾液，殘?jiān)貜?fù)煎煮3次，合并濾液，分別離心，合并上清液，濃縮到20 mL，玻璃棒一邊攪拌一邊緩慢加入80 mL無(wú)水乙醇，在4 ℃溫度下，醇沉48 h，離心，倒出上清液，將沉淀用丙酮反復(fù)洗滌2次，真空冷凍干燥得到鐵皮石解花多糖粗品。多糖溶液中1∶5 的比例加入Sevags試劑（正丁醇氯仿 1∶4）混合液，充分搖勻，震蕩2 min，溶液成乳濁液，室溫下3 000 r·min-1離心20 min，取上清液放入透析袋流水透析72 h，蒸餾水透析24 h后，冷凍干燥，得鐵皮石斛花粗多糖。準(zhǔn)確稱取鐵皮石斛花粗多糖1000 0 mg，加入1 mL 雙蒸水，配成1 g·L-1水溶液，045 μm濾膜過(guò)濾，備用。

222對(duì)照品溶液制備

2221多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定對(duì)照品溶液制備準(zhǔn)確稱取平均相對(duì)分子質(zhì)量分別為805×105，366×105，200×105，113×105，488×104，217×104，62×103的普蘭糖各1000 0 mg，精密加入1 mL雙蒸水，配置成每種標(biāo)樣的質(zhì)量濃度為1 g·L-1，充分搖勻，045 μm濾膜過(guò)濾，即得。

2222多糖各分離流分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定對(duì)照品溶液制備準(zhǔn)確稱取平均相對(duì)分子質(zhì)量為366×105普蘭糖對(duì)照品，精確至0000 1 g，用流動(dòng)相配置成質(zhì)量濃度為5，25，2，1，0625，0312 5，0156 2 g·L-1一系列對(duì)照品溶液，045 μm濾膜過(guò)濾，即得。

223高效凝膠色譜條件

高效凝膠色譜分析柱為XtimateTM SEC300 （78 mm× 300 mm，5 μm），兩柱串聯(lián)，流動(dòng)相為雙蒸水，進(jìn)樣量10 μL，流速10 mL·min-1，示差折光檢測(cè)器（RID），柱溫35 ℃。

23鐵皮石斛花多糖中單糖組成種類測(cè)定

231鐵皮石斛花多糖完全酸水解和衍生化產(chǎn)物制備

精密吸取21項(xiàng)下多糖溶液1 mL，置于水解管中，加30 mol·L-1的鹽酸溶液05 mL，封口，混勻，110 ℃水解1 h，放冷，加30 mol·L-1的氫氧化鈉溶液05 mL調(diào)pH至中性，備用。吸取上述溶液及配置好的01 g·L-1的單糖對(duì)照品溶液各400 μL，加05 mol·L-1PMP甲醇溶液和03 mol·L-1的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，封口，70 ℃水浴100 min；加03 mol·L-1鹽酸溶液500 μL，混勻，用三氯甲烷萃取3次，每次2 mL，棄三氯甲烷層，水層離心后過(guò)045 μm的微孔濾膜備用。

232色譜條件

ACQUITYBEH C18色譜柱，流動(dòng)相002 mol·L-1乙酸銨（A）乙腈（B），梯度洗脫（0～7 min，17%B；7～71 min，17%～20%B；71～20 min，20%B；20～201 min，20%～17% B；201～24 min，17%B），柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量3 μL。endprint

233方法學(xué)考察

2331精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液，在232項(xiàng)下的色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定的5種單糖的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于20%，表明儀器精密度良好。

2332穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，在232項(xiàng)下的色譜條件下，在0，2，4，8，16，24 h分別進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得5種單糖的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于30%，表明供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2333重復(fù)性試驗(yàn)取同一鐵皮石斛花樣品6份，按21條件下提取，231項(xiàng)條件下水解和衍生化處理，在232項(xiàng)下的色譜條件下測(cè)定，測(cè)得5種單糖的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于20%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3結(jié)果

31鐵皮石斛花多糖各流分相對(duì)分子質(zhì)量及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

311不同家系鐵皮石斛花總多糖含量

鐵皮石斛花作為非藥用部位，其總多糖含量低于藥典對(duì)莖的含量要求（<25%）[11]，通過(guò)測(cè)定可知，所有雜交家系花中多糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6921 mg·g-1，變幅為3943～8856 mg·g-1（40%～90%），變異系數(shù)為2646%。3種栽培模式下的樣品中，C13巖壁附生的花中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（6772 mg·g-1）明顯低于其盆栽和梨樹(shù)附生花中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（8856，8220 mg·g-1），次生代謝物質(zhì)積累與環(huán)境關(guān)系密切[12]，可能是巖壁附生的鐵皮石斛受光照強(qiáng)度及溫度影響，其次生代謝物質(zhì)的合成積累較旺盛，消耗較多的養(yǎng)分，導(dǎo)致多糖含量較低。

312鐵皮石斛花多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布

將配制的不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的普蘭糖標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)HPGFC分析，以LogMw為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間tR為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程為Y=-0242 3X+7948 5 （R2 =0996）。將221項(xiàng)下制備的不同雜交家系鐵皮石斛花多糖溶液在相同色譜條件下進(jìn)行分析，從圖2可看出鐵皮石斛花多糖在高效凝膠色譜柱中按相對(duì)分子質(zhì)量大小共分離為3部分，分別為DOP1，DOP2和DOP3，其中DOP1和DOP3峰形較寬，說(shuō)明這2個(gè)流分中多糖成分的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍較大；而DOP2峰形較窄，且為單一對(duì)稱峰，說(shuō)明DOP2中的多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布相對(duì)集中，為均一分布。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算各雜交家系花中多糖相對(duì)分子質(zhì)量大小，從表2可知，DOP1，DOP2和DOP3平均相對(duì)分子質(zhì)量為553×105，349×105和212×105，說(shuō)明鐵皮石斛花中的多糖多為相對(duì)分子質(zhì)量較大的多糖。另外，鐵皮石斛花多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布在11個(gè)雜交家系中差異較大，DOP1相對(duì)分子質(zhì)量變幅為505×105～631×105，DOP2相對(duì)分子質(zhì)量變幅為300×105～443×105，DOP3相對(duì)分子質(zhì)量變幅為173×105～247×105。鐵皮石斛多糖的合成和積累受生長(zhǎng)時(shí)間和環(huán)境影響較大，在植物不同部位中分布及組成也不同。張勇等采用高效凝膠色譜法測(cè)得鐵皮石斛莖和花中多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布均為2部分，但平均相對(duì)分子質(zhì)量差別較大，莖為206×105和15×104，花為351×105和36×104[13]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得花中多糖主要由3部分組成，可能是由于鐵皮石斛原料和提取純化的方法不同，所得到的鐵皮石斛花多糖相對(duì)分子質(zhì)量個(gè)數(shù)及大小也不同[1415]。

313DOP1，DOP2和DOP3質(zhì)量分?jǐn)?shù)

選擇相對(duì)分子質(zhì)量為366×105普蘭糖對(duì)照品，將凝膠色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得線性方程為Y=82 428X+5 2082，r=0999 1，多糖質(zhì)量濃度在0156 25～5 g·L-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，色譜圖見(jiàn)圖3。根據(jù)回歸方程計(jì)算得出不同雜交家系鐵皮石斛花多糖DOP1，DOP2和DOP3相對(duì)于粗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，見(jiàn)表2。各樣品間多糖DOP1，DOP2，DOP3質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，其中DOP1占有比例最大，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3419%，顯著高于DOP2（1572%）和DOP3（1983%）。

32鐵皮石斛花多糖中單糖組成種類及其比例分析

將231項(xiàng)下制備液經(jīng)UPLC色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。通過(guò)對(duì)11個(gè)鐵皮石斛花樣品多糖酸水解后的衍生化產(chǎn)物的指紋圖譜和生成的對(duì)照譜圖進(jìn)行分析，確定5個(gè)主要共有峰，即鐵皮石斛花多糖中的主要單糖組成為甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。通過(guò)比較對(duì)照品和樣品譜圖，在樣品中未能檢測(cè)到鼠李糖、木糖和葡萄糖醛酸，與莖中多糖中的單糖組成相比較，鐵皮石斛花多糖中未檢測(cè)到木糖[16]，但含有相同的甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖這5種成分。

在中藥指紋圖譜中一般選擇含量比較高并且穩(wěn)

定的峰作為參照峰，在鐵皮石斛花多糖中5種單糖中，葡萄糖的含量較高且比較穩(wěn)定，因此選擇葡萄糖為參照峰，計(jì)算其他4種單糖相對(duì)峰面積，見(jiàn)表3。11個(gè)不同家系鐵皮石斛花多糖中各單糖的組成比例存在一定差異，其中甘露糖所占比例最大，其相對(duì)峰面積變幅為0302～3335，變異系數(shù)為4948%；半乳糖醛酸相對(duì)峰面積變幅為0116～1243，變異系數(shù)為5893%；半乳糖相對(duì)峰面積變幅為0239～1076，變異系數(shù)為5196%；阿拉伯糖相對(duì)峰面積變幅為0395～1845，變異系數(shù)為6658%；4種單糖的相對(duì)峰面積變異系數(shù)由大到小為阿拉伯糖>半乳糖醛酸>半乳糖>甘露糖。結(jié)果表明甘露糖相對(duì)峰面積變異系數(shù)最小，其相對(duì)峰面積貢獻(xiàn)率最大，阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸相對(duì)峰面積貢獻(xiàn)率較小。

3311個(gè)雜交家系鐵皮石斛花聚類分析

選取鐵皮石斛花多糖中指標(biāo)性單糖組分，采用SPSS190軟件利用歐氏距離、離差平方和法進(jìn)行聚類分析，以10（15）間距為軸，可將11個(gè)鐵皮石斛花家系聚為四大類，見(jiàn)圖5。其中，6A2B和C13 2個(gè)家系的半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的峰面積較為接近，聚為一類，另外2個(gè)家系莖均較粗，花瓣心淺黃色，說(shuō)明外觀性狀和成分組成具有相似性；endprint

1甘露糖；2.鼠李糖；3.葡萄糖醛酸；4.半乳糖醛酸；5.葡萄糖 ；6.半乳糖；7.阿拉伯糖；8.木糖。

5×163，9×163，13×163，5×168，78×69和C13梨樹(shù)附生6個(gè)家系甘露糖、半乳糖醛酸和半乳糖峰面積較為接近，歸為一類；13×168和17×163半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖峰面積較為接近，聚為一類；C13巖壁栽培樣品五種單糖峰面積較為接近，單獨(dú)聚為一類。從聚類結(jié)果來(lái)看，遺傳因素和栽培環(huán)境是決定鐵皮石斛花外觀及成分組成的關(guān)鍵因素：以親本163為父本的雜交家系5種單糖組成比例差異較大，并未聚為一類，說(shuō)明物質(zhì)積累受另一親本遺傳因素的影響較大；3種栽培環(huán)境下的C13品系單糖組成比例顯著不同。

4討論

本文通過(guò)高效凝膠色譜測(cè)得鐵皮石斛花多糖由三部分組成（DOP1，DOP2和DOP3），平均相對(duì)分子質(zhì)量為553×105，349×105和212×105，且均為相對(duì)分子質(zhì)量較大的多糖，其中DOP1占總多糖比例最大。不同家系鐵皮石斛花多糖中單糖組成種類基本相同，主要包括半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，各單糖組成比例不同，甘露糖和葡萄糖在多糖中分布較多，尤其甘露糖貢獻(xiàn)率最大。2015年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定，鐵皮石斛莖多糖中甘露糖與葡萄糖峰面積比為24～80，本實(shí)驗(yàn)中9×163，78×69花多糖中甘露糖與葡萄糖比值在此范圍之內(nèi)，說(shuō)明多糖合成和積累在不同部位中具有相似性。不同家系鐵皮石斛花總多糖含量及各單糖組成比例也均存在一定差異，通過(guò)聚類分析，形成親緣關(guān)系較為接近的4類，每一類親緣關(guān)系較近的家系在單糖組成比例上較為接近，且花色與花形態(tài)較為接近。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確了不同家系鐵皮石斛花多糖相對(duì)分子質(zhì)量大小與含量，以及多糖的單糖組成種類和組成比例，為鐵皮石斛的資源利用及品種選育提供理論基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]endprint