基于UPLC技術(shù)的吳茱萸定性定量一體化研究

樊小瑞　劉梓晗　馮偉紅　劉曉謙　楊立新　王智民　李春

[摘要]采用UPLC建立吳茱萸指紋圖譜和多成分同步測定方法。采用Waters Acquity BEH C18色譜柱（21 mm×50 mm，17 μm）色譜柱，02%甲酸乙腈02%甲酸水為流動相，梯度洗脫，檢測波長320 nm。以去氫吳茱萸堿為參照峰，通過對29 批吳茱萸進行測定，建立了吳茱萸的UPLC指紋圖譜，該指紋圖譜可同時對24個共有峰進行檢測，采用對照品對新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿共10個色譜峰進行了指認。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”2008A版進行相似度評價，29批藥材中有19批藥材相似度大于09。此外，采用同一色譜條件對吳茱萸中的9個成分進行了同步測定。所測定的9個成分新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿分別在0000 46～0138， 0000 146～0175， 0000 412～0124， 0000 448～0134， 0000 452～0136， 0003 38～0169， 0000 44～0132， 0001 07～0128， 0001 71～0128 μg與各自峰面積積分值成良好線性關(guān)系，9種成分的平均加樣回收率分別為1003%，1004%，1016%，9751%，1029%，1014%，1038%，1040%，9599%，RSD分別為24%，20%，30%，080%，19%，21%，11%，22%，24%。該文建立的UPLC方法在20 min內(nèi)實現(xiàn)了對吳茱萸化學成分的全譜分離，與文獻報道方法相比，該文在一個色譜條件下同時實現(xiàn)了吳茱萸指紋圖譜測定和多成分同步測定，而且所建方法具有專屬性強、分離度高、色譜峰純度高、方法簡單易行的特點，為吳茱萸藥材同步進行定性和定量分析提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]吳茱萸；指紋圖譜；多成分同步測定；超高效液相色譜

[Abstract]An UPLC method was developed for the studies of fingerprint and quantification of multicomponents for Evodiae Fructus The chromatographic separation was performed on a C18 column （21 mm×50 mm，17 μm） with mobile phase of 02% formic acidacetonitrile and 02% formic acidwater in gradient mode， and the detection wavelength was set at 320 nm.Dehydroevodiamine was used as the reference peak， there were 24 common peaks in the fingerprint of 29 samples were detected， and among them 10 chromatographic peaks were identified with the reference substance and they were neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， hyperin， isorhamnetin3OβDrutinoside， dehydroevodiamine， evodiamine， rutaecarpine， evocarpine and dihydroevocarpine The fingerprint data was evaluated with similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine （Version 2008A）， and the similarity of 19 batches of Evodiae Fructus was greater than 09 in the 29 samples In addition， 9 components including neochlorogenic acid， chlorogenic acid， hyperin， isorhamnetin3OβDrutinoside， dehydroevodiamine， evodiamine， rutaecarpine， evocarpine and dihydroevocarpine were simultaneously determined at the same chromatographic conditions， whose peak area integral values showed good linear relationship at the range of 0000 460138， 0000 1460175， 0000 4120124， 0000 4480134， 0000 4520136， 0003 380169， 0000 440132， 0001 070128， 0001 710128， respectively Their average recoveries were 1003%， 1004%， 1016%， 9751%， 1029%， 1014%， 1038%， 1040%， 9599%， and RSD were 24%， 20%， 30%， 080%， 19%， 21%， 11%， 22%， 24%， respectively The established UPLC method not only realized the full separation of all chemical constituents of Evodiae Fructus within 20 minutes， but also achieved the chromatographic fingerprint determination and simultaneous multicomponents determination of Evodiae Fructus at the same chromatographic conditions Compared with other methods in literatures， the method has the following characteristics of strong specificity， good separation， high purity of chromatographic peaks， simplity and feasibility， which provides better means for the simultaneous qualitative and quantitative analysis of Evodiae Fructus.endprint

[Key words]Evodiae Fructus； chromatographic fingerprint； simulataneous multicomponent determination； UPLC

2015年版《中國藥典》規(guī)定吳茱萸為蕓香科Rutaceae植物吳茱萸Evodia rutaecarpa （Juss） Benth，石虎E rutaecarpa （Juss） Benth var officinalis （Dode） Huang 或疏毛吳茱萸E rutaecarpa （Juss） Benth var bodinieri （Dode） Huang的干燥近成熟果實，具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉之功效，用于厥陰頭痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣，經(jīng)行腹痛，脘腹脹痛，嘔吐吞酸，五更泄瀉等的治療[1]。現(xiàn)代藥理研究表明其有鎮(zhèn)痛、抗菌、降壓、抗炎等作用，其主要化學成分有生物堿、萜類（檸檬苦素類）、黃酮、甾體、酚酸、木脂素、揮發(fā)油和多糖等[26]。2015年版《中國藥典》規(guī)定按干燥品計算，吳茱萸中含吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總量不得少于015%，檸檬苦素不得少于020%。近年來有大量吳茱萸質(zhì)量控制的文章面世，研究熱點主要集中在吳茱萸多成分同步測定和指紋圖譜研究上[7]，研究方法絕大多數(shù)采用HPLC，僅4篇文章用到UPLC方法[811]，多成分測定的檢測指標多是在吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素的基礎(chǔ)上增加幾個喹諾酮類生物堿[1213]或黃酮和酚酸類成分[14]，測定數(shù)目最多為7個成分同步測定；指紋圖譜研究也是多采用HPLC方法，分析時間28～140 min不等，共有峰最多32個，指認色譜峰最多13個[1516]。但是，迄今為止所有文獻報道的吳茱萸多成分同步測定和指紋圖譜研究都沒有融會貫通，基本是各自采用不同的方法進行，目前尚未見用同一色譜條件同時完成吳茱萸指紋圖譜和多成分同步測定研究的文獻報道。

因此，本文在優(yōu)化UPLC分析方法的基礎(chǔ)上，用同一色譜條件同時完成了吳茱萸藥材指紋圖譜和多成分含量測定研究，即一套方法可以同時進行吳茱萸藥材的定性定量分析，這無疑會降低吳茱萸藥材的檢測成本，提高分析效率。

1材料

Waters Acquity UPLC HClass 超高效液相色譜儀，Empower3色譜工作站（美國，沃特世公司）； XS205型1/10萬分析天平（瑞士，梅特勒托利多儀器有限公司）；8320型電熱恒溫水浴鍋（北京長風儀器儀表公司）。

甲醇和乙腈均為HPLC級（美國Fisher公司），水為屈臣氏純凈水，甲酸為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

吳茱萸堿（批號W012140801，純度≥98%）、吳茱萸次堿（批號W013140801，純度≥98%）、去氫吳茱萸堿（批號Q068150520）、異鼠李素3OβD蕓香糖苷（批號S063150317）、綠原酸（批號L007140730）和金絲桃苷（批號J012140730），以上對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；吳茱萸卡品堿（批號160324xz）購自成都克洛瑪生物科技有限公司；二氫吳茱萸卡品堿（批號SH03209）購自北京賽百草科技有限公司；新綠原酸（批號MUST13013001）和隱綠原酸（批號MUST13013002）購自成都曼思特生物科技有限公司。按HPLC面積歸一化法計算，以上所有對照品含量均≥98%。

吳茱萸藥材于201510～201610分別購買于全國各地藥材市場，經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所李春研究員鑒定為吳茱萸Evodiae Fructus的干燥近成熟果實，29批吳茱萸藥材信息見表1。

2方法與結(jié)果

21吳茱萸藥材指紋圖譜研究

211色譜條件色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（21 mm×50 mm，17 μm）；流動相02%甲酸乙腈（A） 02%甲酸水（B），梯度洗脫，洗脫程序見表2。檢測波長320 nm；流速0613 mL·min-1；進樣量05 μL，柱溫30 ℃。

212供試品溶液的制備取本品粉末（過40目篩）約025 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱重，加熱回流提取1 h，取出，放冷，再稱重，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

213對照品溶液的制備分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿、二氫吳茱萸卡品堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含新綠原酸0115 mg、綠原酸0096 mg、隱綠原酸0146 mg、金絲桃苷0103 mg、異鼠李素3OβD蕓香糖苷0112 mg、去氫吳茱萸堿0113 mg、吳茱萸堿0141 mg、吳茱萸次堿0110 mg、吳茱萸卡品堿0107 mg和二氫吳茱萸卡品堿0107 mg的混合溶液，即得1#混合對照品溶液。將1#混合對照品溶液分別稀釋10倍、25倍和100倍，制備得2#、3#和4#混合對照品溶液。

214精密度試驗取同一份吳茱萸藥材（編號3）供試品溶液，按211項方法連續(xù)進樣6次，記錄UPLC圖譜。以去氫吳茱萸堿為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD均<20%，相對峰面積的RSD均<30%，測定結(jié)果符合中藥指紋圖譜的要求，表明儀器的精密度良好，見表3。

215穩(wěn)定性試驗取吳茱萸藥材粉末（編號3）約025 g，按212項方法制備供試品溶液，分別于供試品溶液制備后的第0，2，4，6，12，14 h按211項方法進樣，記錄UPLC圖譜。以去氫吳茱萸堿為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD均<20%，相對峰面積的RSD均<30%，測定結(jié)果符合中藥指紋圖譜的要求，表明14 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好，見表4。endprint

216重復性試驗取吳茱萸藥材粉末（編號3）約025 g，平行6份，分別按照212項方法制備供試品溶液，按211項方法進樣，記錄UPLC圖譜。以去氫吳茱萸堿為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD均<20%，相對峰面積的RSD均<30%，測定結(jié)果符合中藥指紋圖譜的要求，表明本方法的重復性良好，見表5。

217指紋圖譜的建立與共有峰的確定取29批吳茱萸藥材，分別按212項方法制備供試品溶液，按211項確定的色譜條件進樣，記錄UPLC圖譜。29批吳茱萸藥材的指紋圖譜中共獲得24個共有峰，經(jīng)與對照品比對，對其中10個共有峰進行了指認，按保留時間依次分別為：新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿，見圖1。218共有指紋峰的相對保留時間及相對峰面積本研究中鑒于去氫吳茱萸堿的相對含量較高，化學結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定、保留時間居中，且在本色譜分離中分離度、色譜峰純度等方面均符合含量測定的要求，因此確定以去氫吳茱萸堿為參照峰（S），其余各共有峰的保留時間和峰面積與S峰的比值定義為其余各峰的相對保留時間和相對峰面積。按以上方法計算29個不同產(chǎn)地吳茱萸藥材的24個共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，見表6～7。

A供試品溶液；B混合對照品溶液； 1～24 為共有峰； 5 新綠原酸； 11 綠原酸； 12 隱綠原酸； 17 金絲桃苷； 18 異鼠李素3OβD蕓香糖苷； 19 去氫吳茱萸堿； 20 吳茱萸堿； 21 吳茱萸次堿； 22吳茱萸卡品堿； 24 二氫吳茱萸卡品堿。

219相似度評價將所得到的29批吳茱萸藥材UPLC色譜圖AIA數(shù)據(jù)導入國家藥典委員會“中藥指

紋圖譜評價系統(tǒng)”（2008版），通過軟件分析得到吳茱萸藥材的UPLC指紋圖譜。結(jié)果顯示：29批吳茱萸藥材與對照特征圖譜相似度在0712～0981，

平均相似度為0912，RSD為73%。29批藥材中有19批藥材相似度大于09，有8批藥材相似度在08～09，還有2批藥材相似度在07～08，表明建立的吳茱萸藥材的UPLC指紋圖譜較合理，見圖2，表8。

22吳茱萸藥材中9種成分的同步測定

221色譜條件同211項下。色譜圖見圖3。

222供試品溶液的制備同212項。

223對照品溶液的制備同213項。

224線性關(guān)系考察分別精密吸取213項下的1#～4#混合對照品溶液01，02，04，06，08，10，12 μL注入超高效液相色譜儀，平行2針，測定新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿的峰面積。以測

得的峰面積和被測物的量（μg）進行線性回歸，得到各個成分的回歸方程以及線性范圍，繪制標準曲線。其中隱綠原酸的線性范圍下限為4#混標進樣01 μL的量，吳茱萸堿的線性范圍下限為3#混標進樣06 μL的量，吳茱萸卡品堿的線性范圍下限為2#混標進樣01 μL的量，二氫吳茱萸卡品堿的線性范圍下限為3#混標進樣04 μL的量，其他待測成分的線性范圍下限均為3#混標進樣01 μL的量，而所

A供試品溶液；B混合對照品溶液； 1 新綠原酸； 2 隱綠原酸； 3 金絲桃苷； 4 異鼠李素3OβD蕓香糖苷； 5去氫吳茱萸堿； 6吳茱萸堿； 7吳茱萸次堿； 8吳茱萸卡品堿； 9二氫吳茱萸卡品堿。

有待測成分線性范圍的上限均為1#混標進樣12 μL的量。取4#混合對照品溶液，進樣測定，以S/N=3作為檢測限，S/N=10作為定量限，結(jié)果見表9。

225精密度試驗取同一份吳茱萸藥材（編號3）供試品溶液，按211項方法連續(xù)進樣6次，測定供試品溶液中新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、 吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿的峰面積，計算RSD。結(jié)果顯示各成分峰面積的RSD

分別為29%，18%，14%，17%，27%，23%，29%，19%，28%。表明儀器精密度良好。

226穩(wěn)定性試驗取吳茱萸藥材粉末（編號3）約025 g，精密稱定，按212項方法制備供試品溶液，分別于供試品溶液制備后第0，2，4，6，12，14 h進樣，測定供試品溶液中新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿的峰面積，計算RSD。結(jié)果顯示各成分峰面積的RSD分別為27%，22%，25%，20%，19%，10%，26%，18%，23%，表明供試品溶液制備后14 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

227重復性試驗取吳茱萸藥材粉末（編號3）約025 g，精密稱定，按212項方法平行制備6份供試品溶液，分別測定供試品溶液中新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿的峰面積，計算含量及RSD。結(jié)果測得吳茱萸藥材中上述各成分的含量分別為675，285，120，312，828，988，277，454，260 mg·g-1，其RSD分別為23%，28%，27%，19%，27%，28%，23%，25%，25%，表明該方法的重復性良好。

228加樣回收試驗精密稱取新綠原酸420 mg、隱綠原酸181 mg、金絲桃苷0780 mg、異鼠李素3OβD蕓香糖苷192 mg、去氫吳茱萸堿526 mg、吳茱萸堿614 mg、吳茱萸次堿171 mg、吳茱萸卡品堿271 mg和二氫吳茱萸卡品堿171 mg，用甲醇溶解并定容至250 mL 量瓶中，搖勻，記作5#混合對照品溶液，備用。endprint

取同一來源的吳茱萸藥材粉末（編號3）約0062 5 g，精密稱定，分別按藥材含量對照品大致1∶1的比例加入25 mL 5#混合對照品溶液，按212項方法平行制備6份供試品溶液，按211項方法測定供試品溶液中新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿的峰面積，計算加樣回收率及RSD。結(jié)果測得各成分加樣回收率的平均值分別為1003%，1004%，1016%，9751%，1029%，1014%，1038%，1040%，9599%，RSD分別為24%，20%，30%，080%，19%，21%，11%，22%，24%，表明該方法的準確度良好，結(jié)果見表10。

229含量測定取29批吳茱萸藥材，按212項方法制備供試品溶液，注入超高效液相色譜儀，按211項方法測定供試品溶液中新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿的峰面積，并用外標一點法計算含量，見表11。

3討論

本實驗對提取溶劑進行了考察，比較了50%甲醇、甲醇、50%乙醇和95%乙醇的提取效果，結(jié)果顯示甲醇提取效果最好，因此選擇甲醇為提取溶劑。本實驗采用 Waters 的PDA 檢測器進行紫外區(qū)全波長掃描，結(jié)果在320 nm 波長下，色譜圖基線噪音較低，特征峰響應較高，因此選擇320 nm 作為本實驗的檢測波長。實驗還考察了甲醇水，乙腈水，乙腈01%甲酸水和乙腈02%甲酸水4種不同的流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈甲酸酸水流動相系統(tǒng)，各峰的分離度和峰純度均較好，且基線平穩(wěn)。因此最終采用02%甲酸乙腈02%甲酸水作為流動相組成。

本文在短短20 min內(nèi)實現(xiàn)了對29批吳茱萸藥材化學成分的輪廓分析，建立了指紋圖譜，共選出24個共有峰，指認了其中10個共有峰，分別是新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異鼠李素3OβD蕓香糖苷、去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿，并且針對除綠原酸之外的其他9個成分進行了含量測定。與文獻報道的吳茱萸的多成分含量測定和指紋圖譜研究相比，在一個色譜條件下同時實現(xiàn)了吳茱萸樣品的定性和定量分析，提高了分析效率，降低了檢測成本，節(jié)約了對照品。該方法的建立為吳茱萸藥材的質(zhì)量控制提供了簡便快捷的分析方法。

由于綠原酸在本文色譜條件下未達到基線分離，所以雖然指紋圖譜中將綠原酸作為共有峰計入，但未進行含量測定。研究結(jié)果顯示雖然1號藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度僅為0764，但其所含吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量卻較高（二者的總含量達36%，遠高于2015年版藥典中二者含量不得低于015%的標準），那么到底應該如何評價吳茱萸藥材的質(zhì)量呢？作者認為至少應將指紋圖譜和多成分含量測定結(jié)果結(jié)合起來進行考量才比較全面，單純以某幾個成分的總含量為考量依據(jù)可能并不合適。本文所建立的指紋圖譜和多成份測定中包含了吳茱萸中含有的三大類主要成分（生物堿、酚酸和黃酮類成分），但令人遺憾的是本研究中未涉及到檸檬苦素類成分，主要原因在于檸檬苦素類成分是末端吸收，在320 nm波長下檢測不到色譜峰。而檸檬苦素類是吳茱萸中的一大類有效成分，因此日后的工作中應在本文研究的基礎(chǔ)上加入檸檬苦素類成分的測定。可采用添加對照品的方法進行相關(guān)成分的測定，這部分工作正在進行中。

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[責任編輯丁廣治]endprint