降香新黃酮latifolin對大鼠急性心肌缺血影響及介導Nrf2信號通路機制研究

李雪亮　陳蘭英　官紫祎　駱瑤　崔亞茹　劉榮華　邵峰　王定清

[摘要]研究降香新黃酮latifolin對垂體后葉素（Pit）及異丙腎上腺素（ISO）致大鼠急性心肌缺血保護作用及作用機制。Pit及ISO分別誘導大鼠急性心肌缺血，觀察大鼠心電圖變化。ISO誘導大鼠急性心肌缺血，ELISA法或比色法檢測血清中心肌損傷標志物含量或活力、比色法檢測心肌中SOD活力及MDA含量；HE染色進行組織病理學檢查；心肌組織冰凍切片進行DCFHDA熒光染色，檢測心肌中ROS含量水平；Western blot法檢測心肌中Nrf2，Keap1，HO1及NQO1的蛋白表達水平。心電圖結果顯示，latifolin抑制Pit及ISO引起的ST段變化，抑制Pit引起心率減慢。機制研究結果顯示，latifolin降低血清中cTnI含量和AST及LDH活力；升高心肌中SOD活力，降低心肌中MDA含量；降低心肌組織炎細胞浸潤、肌纖維斷裂及壞死的程度；減弱心肌DCFHDA熒光染色的熒光強度；抑制Keap1的蛋白表達，促進Nrf2核轉移，促進HO1及NQO1的蛋白表達。結果表明降香新黃酮latifolin對大鼠急性心肌缺血具有保護作用，主要機制可能與激活Nrf2信號通路從而發揮抗氧化作用有關。

[關鍵詞]latifolin； 垂體后葉素； 異丙腎上腺素； 心肌缺血； Nrf2信號通路

[Abstract]The present study was designed to evaluate the cardioprotective effect of latifolin on pituitrin（Pit） or isoproterenol（ISO）induced myocardial injury in rats， and further investigate its underlying mechanisms Rats were administrated sublingually with pituitrin or subcutaneously with isoproterenol to induce acute myocardial ischemia in rats， and lead II electrocardiograph was recorded In rats with isoproterenol， ELISA assay or colorimetric method was used to detect the content or activity of myocardial injury markers in serum， and the SOD activity and MDA content in myocardium were detected by colorimetric assay； histopathological examination was conducted by HE staining； the frozen section of myocardial tissues was used for DCFHDA fluorescent staining to detect the content of ROS in myocardium； Western blot was used to detect the protein expression levels of Nrf2， Keap1， HO1 and NQO1 in myocardium Results showed that latifolin significantly inhibited STsegment changes induced by pituitrin or isoproterenol， and increased heart rate Further mechanism study showed that latifolin reduced cardiac troponin I（cTnI） level， aspartate transaminase（AST） and lactate dehydrogenase（LDH） activities in serum， increased myocardial superoxide dismutase（SOD） activity and reduced myocardial malondialdehyde（MDA） level， and protected myocardium with less necrosis， infiltration of inflammatory cells and fracture of myocardial fibers Furthermore， latifolin obviously reduced ROS level in myocardium， inhibited the expression of Kelchlike ECHassociated protein1（Keap1）， increased the nuclear translocation of nuclear factor erythroid 2 related factor 2（Nrf2）， and promoted the expression of Heme oxygenase1（HO1） and NAD（P）H quinone oxidoreductase1 （NQO1） in myocardial tissues Our data suggest that latifolin has a potent protective effect against pituitrin or isoproterenolinduced myocardial injury， which may be related to inhibition of oxidative stress by activating Nrf2 signaling pathway.endprint

[Key words]latifolin； pituitrin； isoproterenol； myocardial injury； reactive oxygen species； Nrf2 signaling pathway

缺血性心臟病是引起人類死亡的主要因素，世界衛生組織公布的數據顯示，2015年缺血性心臟病死亡人數占全球死亡人數的155%，對人類健康有著極其重大的威脅。藥物治療是目前缺血性心臟病的首選治療方法，因此研發安全、有效、毒副作用小的治療藥物對缺血性心臟病的防治具有重要意義。降香為豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T Chen樹干和根的干燥心材，可化瘀止血，理氣止痛，被廣泛用于治療胸痹刺痛和跌撲傷痛等[1]。舒心寧片、冠心丹參膠囊、血栓通、冠心Ⅱ號及通心絡等含降香的中成藥被廣泛用于缺血性心臟病的治療。降香主要包含揮發油和黃酮類化合物，藥理學研究表明這些成分具有抗血栓、抗炎及抗氧化等生物活性[2]。課題組前期研究證實降香具有明顯的抗心肌缺血作用，本課題主要開展降香有效成分latifolin對心肌缺血的保護作用及機制研究。

1材料

11動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質量180～200 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（湘）20110003。

12藥品及試劑

latifolin[化學結構名稱為（-）（R）latifolin，PubChem編號為340211]由江西中醫藥大學藥學院提供，純度>98%；硝酸異山梨酯片購自山西云鵬制藥有限公司（批號B141001）；鹽酸普萘洛爾片購自江蘇亞邦愛普森藥業有限公司（批號1505109）；垂體后葉素注射液購自南京新百藥業有限公司（批號150104）；異丙腎上腺素（批號WXBB7695V）及DCFHDA（批號015M4038V）購自Sigma公司；AST試劑盒（批號20160311）、LDH試劑盒（批號20160311）、SOD試劑盒（批號20160311）、MDA試劑盒（批號20160309）均購自南京建成生物工程研究所；cTnI酶聯免疫吸附試劑盒購自武漢優爾生商貿有限公司（批號L160303092）；胞漿/胞核蛋白提取試劑盒購自凱基生物科技發展有限公司（批號20160113）；兔Nrf2多克隆抗體（批號GR2499535）、兔Keap1多克隆抗體（批號GR2851673）、兔HO1單克隆抗體（批號GR9679510）、兔NQO1單克隆抗體（批號GR1950438）均購自Abcam公司；兔H3多克隆抗體（批號20）及兔βactin多克隆抗體（批號0007）購自Cell Signaling公司。

13儀器

ML866型Powerlab電生理記錄儀（澳大利亞ADI Instruments）；SpectraMaxi3型多功能酶標儀（美國Molecular Devices）；5810R型冷凍離心機（德國Eppendorf）；COVER015型光學顯微鏡（日本OLYMPUS）；CM1850型冰凍切片機（德國LEICA）；DMI300B型熒光倒置顯微鏡（德國LEICA）；Western blot系統（美國BioRad）；BioRad凝膠成像系統（美國BioRad）。

2方法

21latifolin對急性心肌缺血大鼠心電圖的影響

211latifolin對Pit致急性心肌缺血大鼠心電圖的影響分組、給藥及造模：SD大鼠隨機分為正常組、模型組、硝酸異山梨酯片組（3 mg·kg-1）及latifolin高、中、低劑量組（100，50，25 mg·kg-1），正常組及模型組給予等體積的05%CMCNa溶液，連續灌胃給藥5 d。末次給藥后1 h，除正常組外，各組舌下靜脈恒速推注Pit（1 U·kg-1），復制大鼠急性心肌缺血模型。正常組則按相同方法注射等體積的生理鹽水。

心電圖檢測：腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠板上，Powerlab電生理記錄儀記錄Ⅱ導聯心電圖。記錄各組大鼠造模前后的心率和ST段高度（其中ST段無論抬高或壓低，均以造模前后變化的絕對值進行統計學分析）。

212latifolin對ISO致急性心肌缺血大鼠心電圖的影響分組、給藥及造模：SD大鼠隨機分為正常組、模型組、普萘洛爾組（30 mg·kg-1）及latifolin高、中、低劑量組（100，50，25 mg·kg-1），正常組及模型組給予等體積的05%CMCNa溶液，連續灌胃給藥5 d。除正常組外，各組分別于給藥第4天和第5天皮下注射ISO（30 mg·kg-1），復制大鼠急性心肌缺血模型。正常組則皮下注射等量的生理鹽水，2次皮下注射間隔24 h。

心電圖檢查：末次給藥45 min后，腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠板上，Powerlab電生理記錄儀記錄Ⅱ導聯心電圖。記錄各組大鼠造模前后的ST段高度（ST段無論抬高或壓低，均以造模前后變化的絕對值進行統計學分析）。

22latifolin對ISO致急性心肌缺血大鼠保護作用機制研究

221分組、給藥及造模方法同212項。

222血清心肌損傷標志物測定記錄完心電圖后腹主動脈取血，室溫靜置1 h后3 500 r·min-1離心15 min，分離血清。采用ELISA法測定血清cTnI含量，比色法測定血清AST，LDH活力。

223心肌勻漿SOD活力和MDA含量測定腹主動脈取血后，立即取出心臟。稱取適量心室組織，制備10%心肌勻漿。采用比色法測定心肌勻漿中SOD活力及MDA含量。

224組織病理學檢查大鼠心尖組織放入10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定，用于心肌組織HE染色。對心肌組織進行脫水、包埋、切片、染色及封片等操作，并在光學顯微鏡下觀察及拍照。endprint

225心肌ROS含量測定大鼠心尖組織進行冰凍切片，厚度10 μm。切片上滴加25 μmol·L-1的DCFHDA溶液，于37 ℃保濕盒中避光孵育20 min。PBS沖洗2遍后滴加2 mg·L-1的 DAPI溶液，暗室中常溫孵育20 min。PBS沖洗2遍后，將切片置于熒光倒置顯微鏡下進行熒光激發，觀察切片熒光強度及拍照，并采用ImagePro Plus圖像分析軟件分析熒光強度。

226Western blot心尖組織稱重后，按凱基胞漿/胞核蛋白提取試劑盒方法分別提取胞漿蛋白及胞核蛋白，胞漿蛋白用于胞漿Nrf2，Keap1，HO1及NQO1蛋白表達的測定，胞核蛋白用于胞核Nrf2蛋白表達的測定。BCA法測定各組蛋白樣品的蛋白濃度并調至等蛋白濃度，沸水中煮5 min。蛋白樣品進行SDSPAGE電泳，轉膜，封閉，孵一抗（Nrf2抗體1∶1 200稀釋；HO1抗體1∶15 000稀釋；NQO1抗體1∶2萬稀釋；Keap1抗體1∶1 000稀釋；βactin抗體1∶1 000稀釋；H3抗體1∶1 000稀釋）4 ℃過夜，孵辣根過氧化物酶標記二抗（1∶8 000稀釋）室溫15 h，凝膠成像儀中顯色并進行半定量分析。

23統計學分析

采用SPSS 20統計軟件進行分析，數據以±s表示，采用t檢驗（正常組與模型組）或ANOVA單因素方差分析，組間比較方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett T3法，P<005表示差異有統計學意義。

3結果

31latifolin對急性心肌缺血大鼠心電圖的影響

311latifolin對Pit致急性心肌缺血大鼠心電圖的影響正常大鼠注射Pit后5～20 s會出現T波升高、ST段抬高，30 s至數分鐘則會出現T波低平、倒置、雙向，心率減慢等[3]。本實驗過程中發現，造模后0～15 min模型組ST段表現為先抬高后壓低隨后逐漸恢復至正常，其中在30 s時ST段出現明顯壓低，且與正常組比較，此刻ST段變化值顯著升高（P<001）；另外造模后模型組心率顯著降低（P<001）并伴有心律失常，表明造模成功。與模型組比較，latifolin各劑量組及硝酸異山梨酯片組ST段變化值顯著降低（P<001，P<005）；latifolin中劑量組心率顯著升高，latifolin高、低劑量組及硝酸異山梨酯片組心率具有升高的趨勢，見圖1。

312latifolin對ISO致急性心肌缺血大鼠心電圖的影響與正常組比較，皮下注射ISO后，模型組心電圖出現壞死性Q波，且ST段變化值顯著升高（P<001），表明造模成功。與模型組比較，latifolin各劑量組及普萘洛爾組心電圖出現壞死性Q波的動物數減少，且ST段變化值顯著降低（P<001，P<005），見圖2。

32latifolin對ISO致急性心肌缺血大鼠保護作用機制研究

321latifolin對血清心肌損傷標志物的影響與正常組比較，模型組血清中AST，LDH活力及cTnI

與正常組比較1）P<005，2）P<001；與模型組比較3）P<005，4）P<001（圖2～7同）。

含量顯著升高（P<001）。與模型組比較，latifolin高、中劑量組及普萘洛爾組血清中AST與LDH活力及血清中cTnI含量均顯著降低（P<001，P<005）；latifolin低劑量組血清中LDH活力也顯著降低（P<005），血清中AST活力及血清中cTnI含量也有降低的趨勢，見圖3。

322latifolin對心肌勻漿SOD活力及MDA含量的影響與正常組比較，模型組心肌中SOD活力顯著降低（P<001），MDA含量顯著升高（P<001）。與模型組比較，latifolin各劑量組及普萘洛爾組心肌中SOD活力顯著升高（P<005）；latifolin各劑量組心肌中MDA含量顯著降低（P<005），而普萘洛爾組心肌中MDA含量的變化不顯著，見圖4。

323latifolin對心肌組織病理變化的影響HE染色結果顯示正常組心肌細胞結構清楚，未出現炎細胞浸潤及壞死等病理學變化。模型組心肌細胞則出現壞死和炎細胞浸潤，且這些病理變化在心內膜或乳頭肌中更加明顯。與模型組比較，latifolin各劑量組及普萘洛爾組心肌細胞出現壞死、肌纖維斷裂及炎細胞浸潤的程度明顯減輕，見圖5。

324latifolin對心肌組織中ROS的影響為了驗證大劑量的ISO是否產生大量的ROS，本實驗采用熒光探針DCFHDA來檢測心肌中ROS的含量水平。熒光染色結果顯示，正常組綠色熒光微弱；與正常組比較，模型組綠色熒光強度明顯增加，表明大劑量ISO可以引起心肌組織中ROS的大量生成。與模型組比較，latifolin各劑量組及普萘洛爾組綠色熒光強度明顯減弱。結果表明latifolin可減少ISO引

起的ROS生成，見圖6。

325latifolin對Nrf2，HO1，NQO1及Keap1蛋白表達的影響為了研究latifolin發揮心肌保護作用的分子機制，本實驗應用Western blot法來檢測Nrf2/ARE通路相關蛋白表達水平。Western blot結果顯示，與正常組比較，模型組胞漿Nrf2的蛋白表達無明顯變化，胞核Nrf2，Keap1，HO1及NQO1的蛋白表達均顯著升高（P<001，P<005）。與模型

組比較，latifolin各劑量組及普萘洛爾組胞漿Nrf2的蛋白表達無顯著變化；latifolin高劑量組胞核Nrf2蛋白表達顯著升高（P<001），中、低劑量組胞核Nrf2蛋白表達的變化不顯著，而普萘洛爾組胞核Nrf2蛋白表達無明顯變化；latifolin高劑量組HO1及NQO1的蛋白表達顯著升高（P<005），中、低劑量組HO1及NQO1蛋白表達的變化不顯著，而普萘洛爾組HO1的蛋白表達無明顯變化但NQO1的蛋白表達具有升高的趨勢；latifolin高劑量組和普萘洛爾組Keap1的蛋白表達顯著降低（P<001，P<005），中、低劑量組Keap1蛋白表達的變化不顯著。結果表明，latifolin可激活Nrf2/ARE通路，促進下游抗氧化基因的蛋白表達從而發揮心肌保護作用，見圖7。endprint

4討論

降香作為一味傳統中藥，常與其他中藥配伍用于治療心腦血管疾病。前期研究發現，latifolin為降香主要活性成分之一，在體外具有明顯的心肌保護作用。進一步量效關系研究表明，latifolin中劑量（50 mg·kg-1）為體內心肌缺血保護作用的最佳劑量。本實驗在前期研究基礎上進一步驗證latifolin的心肌保護作用，并對其發揮心肌保護作用的分子機制做初步探索。

Pit及ISO是復制急性心肌缺血動物模型常用的造模藥物。Pit主要通過引起冠狀動脈痙攣來誘發心肌缺血損傷，可模擬臨床上變異型心絞痛的發病過程[4]，所得模型廣泛用于抗心肌缺血藥物的篩選。ISO為一種非選擇性β受體激動劑，大劑量可導致心肌損傷，其引起的心電圖、心肌代謝及組織病理學改變與人類急性心肌梗死相似[5]。心電圖是一種輔助診斷心肌缺血和心肌梗死的重要技術手段。ST段作為心電圖的一個重要參數，其抬高或壓低可反映心肌細胞膜的完整性[6]。靜息電位主要通過鉀離子外流引起，鉀離子外流是由細胞內外濃度差推動。Pit及ISO引起心肌細胞膜受損，導致大量鉀離子內外流，引起缺血心肌極化程度不足或過度極化，與周圍的正常心肌形成“損傷電流”，在心電圖中表現為ST段抬高或者壓低。本實驗結果顯示，latifolin可顯著抑制Pit及ISO引起ST段抬高或壓低，表明latifolin可保護心肌細胞膜，對急性心肌缺血大鼠具有保護作用。基于latifolin對Pit及ISO誘導的大鼠急性心肌缺血模型心電圖的影響，進一步展開latifolin對ISO致大鼠急性心肌缺血模型保護作用的機制研究。

研究表明ISO引起的心肌損傷與細胞膜通透性改變有關，細胞膜通透性增加可引起細胞內心肌損傷標志物（如AST，LDH及cTnI等）釋放入血。其中，AST，LDH為常見心肌酶，cTnI則為特異性存在于心肌內的小分子蛋白質，當心肌損傷時，心肌中的AST，LDH，cTnI會釋放至血清中，從而引起血清中AST，LDH，cTnI的活力或含量升高。本實驗結果顯示，模型組血清中AST，LDH活力及cTnI含量顯著升高，表明大劑量ISO可引起細胞膜通透性改變，導致心肌損傷標志物釋放入血清。latifolin可降低血清中AST，LDH活力及cTnI含量，同時組織病理學檢查顯示latifolin可減輕ISO引起的心肌壞死、炎細胞浸潤等病理學變化。上述實驗結果進一步表明，latifolin可保護心肌細胞膜，減輕ISO引起的心肌損傷。

超氧化物歧化酶（SOD）是活性氧清除劑，能將體內超氧陰離子轉化為過氧化氫，過氧化氫再經過其他酶作用轉化為水。實驗結果顯示，latifolin升高心肌中SOD活力，表明latifolin可提高體內抗氧化能力。此外，MDA為脂質過氧化反應的重要產物，可反映細胞膜脂質過氧化反應的程度。實驗結果顯示，latifolin降低心肌中MDA含量，表明latifolin可降低細胞膜發生脂質過氧化反應的程度。上述實驗結果表明，latifolin可提高機體抗氧化能力，降低細胞膜發生脂質過氧化反應的程度，從而發揮心肌保護作用。

研究表明，兒茶酚胺類物質（包括ISO）的氧化產物是引起心肌損傷的重要原因[7]。這些氧化產物可促進ROS的大量生成，進一步誘導細胞膜上的磷脂發生脂質過氧化反應，導致心肌細胞膜結構和功能的改變。為了驗證過量的ISO是否在體內產生大量ROS，本實驗應用DCFHDA對心肌組織的冰凍切片進行熒光染色。DCFHDA能自由通過細胞膜并被胞內脂酶水解成DCFH，DCFH不能穿過細胞膜并被胞內的ROS氧化生成具有綠色熒光的DCF，根據DCF的熒光強度可評估心肌細胞中ROS的含量水平。熒光染色結果顯示，latifolin明顯減弱心肌熒光強度，表明latifolin可清除ISO誘導生成的ROS。

Nrf2是重要的核轉錄因子，Nrf2/ARE通路在體內發揮重要的抗氧化作用[8]。正常條件下，Nrf2主要存在于胞漿中并與其抑制蛋白Keap1結合，保持著低活性狀態。在氧化應激條件下，Nrf2從Keap1中釋放并轉移至細胞核，與細胞核內的抗氧化反應元件（ARE）結合，從而上調Ⅱ相解毒酶及抗氧化基因的表達[9]。HO1和NQO1是體內重要的Ⅱ相解毒酶和抗氧化劑，在體內發揮著重要的抗氧化作用。HO1是血紅素生成膽綠素、一氧化碳和鐵離子的限速酶。實驗研究證實，促進Nrf2的核轉移可上調HO1的蛋白表達[10]。NQO1是一種Ⅱ相解毒酶，同時也是輔酶Q（泛醌）和維生素E的還原酶，可通過維持輔酶Q和維生素E的還原狀態來發揮抗氧化應激作用[11]。大量研究結果表明，激活Nrf2/ARE信號通路可以促進NQO1的蛋白表達[12]。本實驗通過檢測胞核Nrf2、胞漿Nrf2，Keap1及Nrf2下游抗氧化基因HO1和NQO1的蛋白表達，來研究latifolin發揮心肌保護作用的機制。實驗結果顯示，latifolin顯著抑制Nrf2結合蛋白Keap1的蛋白表達，顯著促進Nrf2的核轉移，顯著上調Nrf2的下游抗氧化基因HO1及NQO1的蛋白表達。結果表明，latifolin可能通過抑制Keap1的表達，使游離的Nrf2增多，同時促進游離的Nrf2向核內轉移，通過上調Nrf2下游抗氧化基因的蛋白表達來發揮心肌保護作用。

缺血性心臟病的發病機制復雜，其中氧化應激是缺血性心臟病的重要發病機制之一。本研究結果顯示latifolin對Pit及ISO誘導的大鼠急性心肌缺血模型具有保護作用，且高、中劑量的保護作用更為顯著。進一步的機制研究結果顯示，latifolin各劑量可顯著減少ROS生成，同時latifolin高劑量顯著抑制Keap1的表達、促進Nrf2核轉移并促進HO1及NQO1的表達，表明latifolin的心肌保護作用可能與其激活Nrf2信號通路從而發揮抗氧化應激有關。然而也有研究表明latifolin在體外具有顯著的抗炎作用[13]，因此latifolin是否也通過抑制炎癥來發揮其心肌保護作用還不明確，即latifolin的抗氧化及抗炎作用與其心肌保護作用之間的關系還有待于進一步研究。雖然本課題對降香新黃酮latifolin發揮心肌保護作用的機制尚未完全明確，但無論如何，本實驗為降香的進一步開發及抗心肌缺血藥物的研究提供了實驗依據。endprint

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[責任編輯張寧寧]endprint