hBMP2修飾的β-TCP/膠原支架對MC3T3-E1細胞成骨能力的影響

趙剛 曾娟 李德超 丁元圣 朱旭佳 宋天喜

hBMP2修飾的β-TCP/膠原支架對MC3T3-E1細胞成骨能力的影響

趙剛 曾娟 李德超 丁元圣 朱旭佳 宋天喜

目的構建含hBMP2(human bone morphogenetic proteins 2)質粒DNA的β-TCP/膠原(β-tricalcium phosphate/collagen)支架材料，并研究其對MC3T3-E1細胞成骨能力的影響。方法制備納米級多孔β-TCP/膠原支架并負載含hBMP2目的DNA基因及對照質粒形成基因修飾的支架材料。建立MC3T3-E1細胞株與復合支架的體外培養體系。將其分為支架組hBMP2組(Z)對照質粒組(Z0)，平皿hBMP2組(M)和對照質粒組(M0)。復合培養后取樣通過掃描電鏡觀察支架表面形態，成骨誘導1、3、7、14 d檢測不同濃度BMP2支架組和非支架組細胞堿性磷酸酶(ALP)的活性，并在成骨誘導的不同時間點采用實時熒光定量PCR的方法檢測 Runx2、OCN、ALP、OPN等成骨相關標志基因表達。檢測結果進行統計學分析。結果含hBMP2為目的基因的質粒DNA修飾納米β-TCP/I型膠原溶液復合材料表面呈多孔樣結構；支架組和平皿組中加入hBMP2質粒DNA都能提高ALP的活性以及成骨相關標志基因的表達；支架組對MC3T3-E1細胞成骨促進能力優于平皿組。結論負載hBMP2基因修飾的β-TCP/膠原支架材料具有良好的骨誘導性。

BMP2； β-TCP/膠原； 成骨能力； 骨缺損

骨缺損是一種常見、多發又治療相當復雜的先天性、發育性及后天疾患。組織工程支架材料在骨缺損修復中被廣泛應用，β磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate, β-TCP)是最重要的支架材料，它具有良好的生物相容性，但其生物響應性(即受植區組織)對其反應性,遠遠不如自體骨組織，因此解決此類問題成為國內外的研究熱點。越來越多的研究開始使用包裹生物活性因子[1]的緩釋材料(如納米微囊)，或者以生化技術搭載生物活性因子相關基因載體并由種子細胞吞噬后，可大量表達生物活性因子的材料。這種技術雖然已經非常先進，但仍然需要不斷探索。本實驗將具有骨傳導性能的β-TCP/膠原支架與具有成骨活性的因子BMP2載體進行復合，形成的復合支架材料以期其具備更優越的骨傳導性和骨誘導性。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與材料分組

2015-03～2016-01于佳木斯大學基礎實驗室完成；實驗設計：體外細胞觀察性實驗；實驗材料分組：支架組(Z)：根據支架上復合hBMP2質粒的量分為2 組：Z0組(支架含14 μg對照質粒)和Z14組(支架含14 μg hBMP2質粒)。平皿組(M)：根據轉染時在12 孔板中所加hBMP2質粒的量分為2 組：M0組(平皿加1 μg對照質粒)和M1(平皿加1 μg hBMP2質粒)。

主要實驗儀器：層流超聲工作臺、電熱恒溫培養箱(上海博迅實業有限公司)，超低溫冰箱(Thermo，美國)，掃描電鏡(島津，SSX-550，日本)、倒置顯微鏡(Olympus BX5，日本)，輔助電動移液槍、離心管、微量移液器(Brand，德國)，高速Megafuge離心機、NanoDrop 2000c微量分光光度計、渦旋離心機(Thermo Scientific，美國)，LightCycler@480 實時熒光定量 PCR 儀(Roche，瑞士)，PCR儀(Biorad，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 合成帶有hBMP2基因的質粒DNA hBMP2為目的基因的質粒DNA購于大連寶生物工程有限公司，按參考文獻[2]制備出含hBMP2目的基因的真核表達載體，以購自ATCC的hBMP2基因為模板進行PCR擴增，hBMP2基因的序列號為：NM-001200.2，ID：650，PCR的產物通過分離純化后經Xba I、Hind Ⅲ雙酶切，插入相同雙酶切的pcDNA3.1(-)表達載體，再經測序及酶切鑒定后大量擴增并純化，制備液態hBMP2/pcDNA3.1(-)，其濃度為3 μg/μl，-20 ℃保存備用。

1.2.2 負載hBMP2為目的基因質粒DNA修飾納米β-TCP/膠原溶液復合材料 復合材料購于北京奧精醫藥科技有限公司，納米級復合材料按參考文獻[3]制備：將已經制備好的含hBMP2目的基因液體的質粒DNA滴加至支架材料，然后經過低溫凍干處理后，制備成含不同質粒濃度的支架材料，并切割成5 mm×5 mm×2 mm的小長方體，-20 ℃保存備用。

1.2.3 MC3T3-E1細胞培養 MC3T3-E1細胞購于北京協和細胞資源中心。經過復蘇、培養、傳代。

1.2.4 材料與細胞復合培養 細胞接種：所有支架材料經過高壓蒸汽滅菌，再經紫外線光照射3 h，從而達到分組材料滅菌的目的。將支架材料放入24 孔板中，再加入1 ml含10%FBS的α-MEM預先潤濕過夜。采用負壓將支架材料上的液體抽干，將5×104個小鼠前成骨MC3T3-E1細胞細胞滴加到支架上，并在37 ℃，5%CO2濃度的孵箱中孵育3 h，之后加1 ml完全培養基。平皿培養是直接在24 孔板中每孔接種5×104個細胞。

細胞轉染：待24 孔中細胞達到70%匯合率時，進行BMP2轉染。含BMP2的質粒由大連寶生物工程有限公司合成，轉染前先將完成培養基換成無血清α-MEM。分別在2 個1.5 ml EP管中加入50 μl α-MEM，其中一管中加入2.4 μl脂質體(漢恒生物，中國)，另一管中加入1 μg含BMP2的質粒DNA或對照質粒，混勻后孵育5 min，將脂質體滴加到質粒DNA中孵育20 min后，均勻滴加到12 孔內。支架組只加脂質體。6 h后換為正常的完全培養基。

1.3 檢測方法與指標

1.3.1 形態學觀察 體外細胞預處理后，掃描電鏡、光鏡進行細胞形態學觀察。

1.3.2 堿性磷酸酶活性(ALP)檢測 配置成骨誘導液，將平皿與支架上成骨誘導1、3、7、14 d的細胞用預冷的PBS洗2 遍，胰酶消化后離心去上清，加入100 μl 0.1% triton X-100(Amresco,USA)，打散細胞后4 ℃放置6 h離心取上清。根據堿性磷酸酶測試盒說明書(南京建成，中國)對ALP活性進行測定。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測 各組細胞在第1、3、7、14天4 個時間點用TRIzol進行裂解細胞，使用氯仿、異丙醇等提取mRNA，1 μg mRNA逆轉錄為cDNA后，采用LightCycler@480實時熒光定量PCR儀對細胞成骨相關基因Runx2、OCN、ALP、OPN的表達進行檢測。基因引物見表 1。

表 1 RT-PCR引物序列

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 形態學觀察結果

2.1.1 支架電鏡圖 含hBMP2質粒DNA修飾的納米級β-磷酸三鈣/I型膠原復合材料的掃描電鏡下觀察形態(圖 1)。顯示復合材料的表面上有大量大小不一的孔隙。從而判斷復合材料中的微孔都是相互連通的。連通的微孔能夠為成骨細胞在材料內的活動提供有利通道。

2.1.2 hBMP2轉染效率 MC3T3-E1細胞中轉染GFP對照質粒的細胞顯示有綠色熒光超過90%(圖 2A、2B)，說明我們成功將外源基因轉染至細胞中。同時我們對轉染了hBMP2的MC3T3-E1細胞中BMP2的mRNA表達進行Real-time PCR檢測發現BMP2的表達升高(圖 2C)。

圖 1 支架電鏡圖

2.2 堿性磷酸酶ALP活性檢測結果

將MC3T3-E1細胞接種在平皿和支架材料的表面，在誘導后的1、3、7、14 d對成骨細胞中ALP的活性進行檢測，發現在成骨誘導過程中平皿組和支架組ALP表達均呈現升高的趨勢，在成骨細胞接種早期(1、3 d)，平皿組和支架組ALP的活性較低，在各組間差異不是很顯著；隨著誘導時間的增加，接種于支架材料的成骨細胞的ALP活性明顯且高于平皿組；平皿培養的細胞中轉染hBMP2或復合hBMP2質粒的支架組均表現出較高的ALP活性(圖 3)。

2.3 實時熒光定量PCR檢測細胞成骨相關基因表達結果

MC3T3-E1細胞在成骨誘導1、3、7、14 d的過程中, 成骨相關標志基因Runx2，OCN，ALP，OPN表達均呈現升高的趨勢(圖 4)，其中支架組成骨相關標志基因表達升高較平皿組明顯；成骨誘導中后期，復合hBMP2質粒的支架組成骨標志基因表達明顯高于對照支架組。

圖 3 4 組MC3T3-E1細胞轉染后不同時間點ALP的活性

Fig 3 ALP activity of MC3T3-E1 cells at different time points after transfection

3 討 論

近年來人們逐漸認識到細胞載體的重要性并開始不斷探索，Green[4]1977 年就預言有可能在新型生物相容性材料上種植細胞并形成可以被移植的成骨新組織。臨床上大量試驗研究充分證實BMP2具有優良的骨形成誘導能力[5-6]。但是也有研究指出BMP2在體內的半衰期比較短，容易被蛋白酶降解，發揮誘導成骨作用能力低[7]。本課題組體外實驗將編碼具備hBMP2基因的質粒DNA承載到納米級多孔β-TCP/膠原支架材料上，檢測其成骨活性能力。掃描電鏡、光鏡下顯示轉染GFP對照質粒的細胞有超過90%的細胞顯示有綠色熒光(圖 2A、2B)，說明我們已成功將外源基因轉染至細胞中。RT-PCR檢測發現轉染了hBMP2的細胞中hBMP2的表達升高。這表明β-TCP/膠原支架材料具有優良的骨傳導性，以實現臨床上的骨組織的爬行替代過程。ALP活性檢測結果顯示成骨誘導過程中ALP活性呈現逐漸增高的趨勢，第7天開始接種于支架材料的成骨細胞分泌的ALP開始增加明顯且高于平皿組，并且在平皿培養的細胞中轉染hBMP2可促進ALP活性的表達。進一步證實hBMP2基因修飾材料良好的骨誘導活性。

圖 4 轉染后不同時間點4 組MC3T3-E1 細胞中成骨相關標志基因的表達

質粒載體臨床上有較高安全性，廣泛的應用于基因工程中[8]。在成骨誘導分化過程中，ALP是成骨細胞分化的早期標志[9]。本課題組ALP活性和RT-PCR檢測結果分析中發現hBMP2在體外實驗MC3T3-E1細胞中得到了較好的表達，并且檢測因子在14d時hBMP2的表達更加增強，但是對照組單純DNA支架組中的BMP2的表達相對較弱。從而說明了平皿和支架組均能促進成骨細胞的成骨活性有良好的生物相容性，然而實驗結果顯示支架組的成骨活性要優于平皿組。Keeney[10]研究也發現磷酸鈣/膠原復合支架材料可以作為裸DNA的高效載體,與本實驗的研究結果一致。

BMP2是一種具有多功能作用的蛋白，在骨形成過程中的作用已被廣泛研究[11]。BMP2可促進成骨細胞分化成熟，加速骨缺損的修復。其中BMP2用來治療骨缺損取得良好療效[12]。本實驗構建hBMP2真核表達載體并轉染入MC3T3-E1細胞，β-TCP可促進細胞分化，分化后的細胞具有成骨細胞的形態特點和生物學行為。β-TCP具有很好的誘導MC3T3-E1分化成骨的能力，經ALP及RT-PCR鑒定，結果表明MC3T3-E1細胞能夠成功表達目的蛋白。郝偉等[13]基于脂肪干細胞I型膠原凝膠PLGA-β-TCP支架的新型仿生骨組織工程也已經證明復合支架材料的生物性能明顯優于材料復合培養之前分別對成骨細胞成骨能力的影響。本課題組實驗結果證明含hBMP2為目的基因的質粒DNA修飾的納米級β-TCP/膠原溶液的復合材料對MC3T3-E1細胞成骨能力的影響優于3 種材料分別對細胞產生的影響。

綜上所述，負載BMP2基因修飾的β-TCP/膠原支架材料具有良好的生物相容性、優良的骨誘導性和骨傳導性，具有良好的臨床應用前景，是一種理想的骨缺損修復材料。可以應用于口腔種植修復、口腔頜面外科及其與口腔正畸聯合修復骨缺損治療中。

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Theeffectsofβtricalciumphosphate/collagenscaffoldloadedwithhumanbonemorphogeneticprotein2plasmidontheosteogenesisabilityofMC3T3-E1cells

ZHAOGang,ZENGJuan,LIDechao,DINGYuansheng,ZHUXujia,SONGTianxi.

154007,JiamusiUniversitySchoolofStomatology,China

Objective: To study the effects of beta tricalcium phosphate(β-TCP)/collagen scaffold loaded with human bone morphogenetic protein 2(hBMP2) plasmid on the osteogenesis ability of MC3T3-E1 cells.MethodshBMP2 DNA plasmid-modified β-TCP/collagen scaffold and the naked plasmid(control) were constructed. MC3T3-E1 cells were respectivelyinvitrocultured onto the β-TCP/collagen scaffold with hBMP2(Z) and with control plasmid(Z0),on peace dish with the saffold and hBMP2(M) and with the control plasmid(M0). The surface morphology of the samples was observed by SEM. Osteogenesis of the cells was examined by alkaline phosphatase activity(ALP) test, real-time fluorescent quantitative PCR for the detection of Runx2, OCN, ALP and OPN mRNA expression. Data were statistically analyzed.ResultsThe composite sample surface of plasmid DNA containing hBMP2 modified β-TCP/collagen was porous; group Z and M showed highter ALP activity and higher mRNA expression of Runx2, OCN, ALP and OPN than group Z0 and M0; so did group Z than group M.ConclusionPorous β-TCP/collagen scaffold loaded with BMP2 DNA is potential for osteoinduction.

BMP2；β-TCP/collagen；Osteogeneticability；Bonedefect

黑龍江省自然科學基金(編號： H201487)

154007， 佳木斯大學口腔醫學院正畸科

趙剛 E-mail： 13504545575@126.com

R329.24

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.006

(收稿： 2017-01-28 修回： 2017-03-07)