大孔樹脂聯合聚酰胺法純化牛蒡根總黃酮工藝的研究*

李 瑾，王 露，丁茂鵬，彭圓濤

陜西中醫藥大學 (咸陽 712046)

大孔樹脂聯合聚酰胺法純化牛蒡根總黃酮工藝的研究*

李 瑾，王 露，丁茂鵬，彭圓濤

陜西中醫藥大學 (咸陽 712046)

目的：使用大孔樹脂聯合聚酰胺法進行牛蒡根總黃酮的純化工藝研究。方法：將牛蒡根總黃酮的粗提物用大孔樹脂和聚酰胺先后進行純化。結果：用大孔樹脂純化黃酮時：用內徑30 mm的層析柱以徑長比1∶7裝柱。將400 ml的上樣液(濃度為10 mg/ml)，以0.5 BV/h的流速上樣,用30%的乙醇以1.5 BV/h的流速進行洗脫(此時洗脫效果最佳)。聚酰胺純化時用內徑15 mm的層析柱以徑長比1∶8裝柱。用20 ml的上樣液(濃度為1.5 mg/ml,PH為2)，以流速為0.5 BV/h上樣,用70%乙醇以4 BV/h的流速進行洗脫(此時洗脫效果最佳)。結論：牛蒡根粗品總黃酮含量為7%，在最佳工藝條件下，經過大孔樹脂純化后，其總黃酮含量達到55.86%，再經過聚酰胺進一步純化后，其總黃酮含量達到80.75%。

牛蒡根為桔梗目、菊科、牛蒡屬植物牛蒡(Arctium lappa L.)干燥的根,有祛風熱，消腫毒之功。牛蒡根中不僅富含蛋白質，糖類等營養成分[1]，還富含大量藥效成分如有機酸類，多酚類，黃酮類等[2]。黃酮類是大多數中藥都含有的成分，具有多種治療功效，其具體的功效也因藥物的不同而不同[3]。為了研究牛蒡根中黃酮的作用功效，需對牛蒡根的提取物進行分離純化。目前研究牛蒡根有效成分提取工藝的較多，但研究有效成分純化工藝的相對較少。有人[4]通過大孔樹脂對不同條件下甘草總黃酮的靜態與動態吸附與解析情況的研究，確定了大孔樹脂純化槲寄生總黃酮的最佳純化工藝。有人[5]通過聚酰胺在不同條件下對枳實總黃酮的動態與靜態吸附與解析情況的考察，確定了聚酰胺純化枳實總黃酮的最佳工藝條件。

大孔樹脂理化性質穩定是一種極性吸附劑，所以在分離純化領域被廣泛的應用。聚酰胺近年來也被廣泛用于中藥成分的分離純化，尤其對于酚類，黃酮類的純化效果極為顯著[6-8]。聚酰胺分離純化黃酮類成分，主要是利用黃酮類成分中的羥基易于與聚酰胺樹脂結合成氫鍵，從而能有效地吸附黃酮類成分的特點將其分離純化。目前，對與大孔樹脂聯合聚酰胺法純化中藥成分的方法鮮有報道，本實驗采用將大孔樹脂與聚酰胺樹脂聯合的方法對牛蒡根總黃酮進行了純化，得到了相當不錯的收率。該實驗方法對于采用樹脂純化總黃酮類成分的研究具有重要意義，既提高了純化過程中總黃酮的含量，又保證了純化過程的經濟效益，為牛蒡根總黃酮的進一步研究奠定了基礎。

材料與方法

1 實驗原料 牛蒡根:由陜西康盛堂中藥飲片廠提供。

2 實驗試劑 蘆丁標準品(分析純，上海永葉生物科技有限公司);大孔樹脂(LS-46D，臺州市路橋四甲生化塑料廠);聚酰胺樹脂(分析純，臺州市路橋四甲生化塑料廠);無水乙醇(分析純，上海瀚思化工有限公司)。

3 實驗儀器 RE-52A型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);UV2550型紫外可見分光光度儀(深圳市凱銘杰儀器設備有限公司)；FA2104N型電子分析天平(濟南普納儀器設備有限公司)。

4 牛蒡根粗品的制備[9-10]取經粉碎過篩后的牛蒡根粗粉20 g，加入60%乙醇160 ml，浸泡30 min后在85℃下回流提取40 min，重復3次，合并濾液，抽濾，將濾液濃縮至15 ml，石油醚脫脂，干燥。

5 牛蒡根總黃酮含量的測定[11]

5.1 標準曲線的繪制:取超聲溶于60%乙醇中的蘆丁標準品5.0 mg，定容至25 ml。液體配液按下表進行。移入標準品后再分別移入60%乙醇至5 ml。分別移入NaNO20.3 ml，反應6 min后分別移入Al(NO3)30.3 ml,反應6 min后移入氫氧化鈉反應15 min，最后移入60%乙醇0.4 ml，用手搖均勻，然后在波長為510 nm測物質吸光度并繪制其標準曲線。

求得線性回歸方程Y=6.1342X-0.00607，R2=0.99979，線性關系良好。

5.2 總黃酮含量的測定:把純化后的牛蒡根黃酮樣品精密稱取5.0 mg，超聲溶解，然后在25 ml容量瓶中定容,按以上配液方法配液，測出吸光度，用線性回歸曲線求得樣品濃度來計算牛蒡根總黃酮的含量。

6 大孔樹脂的初步純化

6.1 大孔樹脂的選擇[12]：分別稱取大孔樹脂NKA-9、AB-8、D101、LS-46D 各4 g于四個燒杯中，分別加入牛蒡根總黃酮粗品溶液(濃度為10 mg/ml，體積為400 ml)，于溫度恒定的情況下振蕩4 h，每間隔1 h取一樣品并分別測其吸光度值，并算得吸附量。待上述吸附完成后，過濾除去殘留液，加入30%乙醇50 ml，溫度恒定的情況下振蕩4 h，測總黃酮的含量，算得解析率，并在相同的條件下測其在60%，90%乙醇中的解析率。

6.2 純化工藝的優化[13]

6.2.1 徑長比對純化效果的影響:把經過處理過的大孔樹脂濕法裝柱在內徑為3 cm的層析柱中，使其徑長比分別為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，制得6份牛蒡根粗品溶液，體積為400 ml,濃度為10 mg/ml，上樣的流速為0.5 BV/h，洗脫的流速為1.5 BV/h。

在一定范圍內徑長比越大，黃酮含量越高，超過一定范圍黃酮含量下降，實驗表明在徑長比為1∶8時黃酮含量最大，因此裝柱徑長比為1∶8較合適。

表1 大孔吸附樹脂靜態吸附(mg/g)

表2 大孔吸附樹脂靜態解析率

由表1中數據可知LS-46D靜態吸附率最高可達315.37 mg/g，表2數據顯示其靜態解析率最高可達86.87%，在這四種樹脂中均為最高，因此LS-46D為優選樹脂。

6.2.2 上樣量對泄露率的影響:取牛蒡根黃酮粗品放入燒杯中，配成10 mg/ml的上樣液，進行上樣，上樣流速為以0.5 BV/h。每上100 ml上樣液取一次樣測其黃酮含量，并計算泄漏率。

當上樣量越大，泄漏率呈不同程度增長，當超過400 ml時，泄漏率超過10%，并且增長速度加快，因此確定最佳上樣量為400 ml。

6.2.3 上樣流速對泄漏率的影響:配制牛蒡根總黃酮粗品溶液5份，濃度為10 mg/ml，分別控制上樣流速為0.25 BV/h、0.5 BV/h、0.75 BV/h、1.0 BV/h，以0.5 BV/h流速洗脫。

上樣流速和泄露率呈線性關系，當上樣流速超過0.5 BV/h時，泄漏率超過10%。因此以0.5 BV/h流速上樣效果最佳。

6.2.4 洗脫劑濃度和純化效果的影響關系: 用不同濃度的乙醇(15%、30%、45%、60%、75%)洗脫牛蒡根總黃酮粗品溶液(10 mg/ml)5份，以，結果如圖1所示。 由圖可見，洗脫效果最佳點在用30%乙醇洗脫時，此時總黃酮含量最高。

6.2.5 洗脫流速對純化效果的影響:取5份已經配好的牛蒡根總黃酮粗品溶液，流速都控制在0.5 BV/h，上樣，以不同的流速0.5 BV/h、1.0 BV/h、1.5 BV/h、2.0 BV/h、2.5 BV/h洗脫，測其吸光度，算得解析率結果如下圖2所示。

由圖可知，流速控制在1.5 BV/h時比較合適，因為在1.5 BV/h流速洗脫解析率最高。

7 聚酰胺樹脂的二次純化

7.1 聚酰胺的活化及再生：聚酰胺的活化步驟為，取新聚酰胺樹脂用無水乙醇處置后，用水洗到沒有醇味，抽干備用。

聚酰胺的再生：先用5%NaOH將用過的聚酰胺樹脂洗至無色，然后再用5%NaOH浸泡3 d，水洗至PH為7。

7.2 上樣液的配制：取經純化過的，濃度為55.86%的牛蒡根黃酮30 mg,配成20 ml 1.5 mg/ml的溶液，并調節PH為2。

7.3 聚酰胺樹脂精選工藝的優化

7.3.1 泄漏曲線的繪制:取純化過的牛蒡根黃酮適量，配成濃度為1.5 mg/ml的溶液，調節pH=2，以1.5 BV/h流速上樣，從10 ml開始，每5 ml收集一次，測牛蒡根總黃酮的含量，繪制泄露曲線。

當上樣量大于20 ml時，泄漏率超過10%，此時吸附的經初步純化過的黃酮的量為30 mg。相當于每毫升聚酰胺樹脂吸附1.42 mg。

7.3.2 上樣液pH的優化:取經大孔樹脂純化過的牛蒡根黃酮，配成20 ml 1.5 mg/ml的上樣液5份，調節pH使分別為1、2、3、4、5，以1.5 BV/h流速上樣，用70%乙醇以4 BV/h的流速洗脫。洗脫結果如圖3所示。由圖可知，pH最好控制在2，因為當pH=2時洗脫效果最好。

7.3.3 上樣濃度的優化:取純化過的牛蒡根黃酮，配制20 ml成濃度分別為1.0 mg/ml、1.25 mg/ml、1.5 mg/ml、1.75 mg/ml、2.0 mg/ml的上樣液5份，使pH=2，以1.5 BV/h的流速上樣。上樣濃度最好控制為1.5 mg/ml較好，否則會出現堵塞情況。

7.3.4 洗脫劑濃度的優化:取經大孔樹脂純化過的牛蒡根黃酮30 mg，配成8份濃度為1.5 mg/ml，體積為20 ml 的上樣液,調節PH=2，以1.5 BV/h上樣，分別用不同濃度的乙醇以4 BV/h洗脫，控制乙醇濃度梯度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。用70%乙醇洗脫洗脫效果最佳，因為此時總黃酮含量最高。

7.3.5 洗脫流速的優化:取經大孔樹脂純化過的牛蒡根黃酮30 mg配成1.5 mg/ml的上樣液4份，并調節PH為2，以1.5 BV/h流速上樣,分別以3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h、6 BV/h流速進行洗脫，計算解析率并測吸光度，結果如圖4所示。如圖以4 BV/h流速洗脫為宜。

討 論

本實驗先采用大孔樹脂將牛蒡根總黃酮進行了純化，當以最優工藝純化總黃酮含量7%的牛蒡根粗品時可使總黃酮濃度達到55.86%。用大孔樹脂LS-46D以1∶8的徑長比裝住，以0.5 BV/h的流速上樣,用30%乙醇以1.5 BV/h的流速洗脫時純化工藝最優。接下來用聚酰胺對牛蒡根黃酮進行了二次純化。當用最佳工藝條件純化牛蒡根黃酮可使總黃酮純度達到88.75%，純化效果明顯。當以體積，濃度，流速分別為20 ml，1.5 mg/ml,1.5 BV/h上樣，用70%乙醇以4 BV/h流速洗脫時的工藝為最優工藝。

在中藥制藥工業中，大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂聯合純化是有發展前景的實用新技術之一，純化工藝主要采用靜態純化和動態純化結合聚酰胺樹脂純化，相較于單純使用聚酰胺樹脂，具有富集效率高、成本低、實用性強、易操作等特點。

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Purificationoftotalflavonoidsfromburdockrootsbymacroporousresincombinedwiththemethodofpolyamide

Wang Lu,Li Jin,Ding Maopeng,et al.

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Objective:To study the process of the Purification of total flavonoids from burdock roots.Methods: The crude extracts of the total flavonoids of burdock roots were purified by macroporous resin and polyamide.Results: The purification of flavonoids by macroporous resin: the folding layer column having an inner diameter of 30 mm was repleted with a diameter ratio of 1∶7. The effect of elution was optimum when the sample liquid of 400 ml, at the concentration of 10 mg/ml was loaded with flow rate of 0.5 BV/h and elute with a flow rate of 1.5 BV/h with 30% ethanol. The purification of polyamide: the folding layer column of 15mm having an inner diameter was repleted with a diameter ratio of 1∶ 8. The effect of elution was optimum when the 20 ml of the sample liquid, at the concentration of 1.5 mg / ml, PH 2, was loaded at the flow rate of 0.5BV / h and elute with 70% ethanol at the flow rate of 4 BV / h.Conclusion: The content of total flavonoids in burdock roots is 7%. Under the optimum conditions, the content of total flavonoids is 55.86% after purification through macroporous resin, and the total flavonoid content reaches 80.75% after further purification of polyamide.

Arctium lappa Flavones Pharmaceutical technology (TCD)

*陜西省教育廳科研基金資助項目(15JK1208)

牛蒡 黃酮 中藥制藥工藝

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.11.055

(收稿：2017-07-13)