玉米單倍體鑒定方法研究進(jìn)展

張瑞平++周聯(lián)東++王文潔

摘要 玉米單倍體育種技術(shù)以遺傳誘導(dǎo)為基礎(chǔ)，已成為玉米育種的關(guān)鍵技術(shù)，快速、準(zhǔn)確地識(shí)別單倍體對(duì)玉米單倍體育種非常重要。本文就玉米單倍體鑒定方法的研究進(jìn)展做一綜述性探討。

關(guān)鍵詞 玉米；單倍體；鑒定；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）20-0024-02

Research Progress on Identifying Method of Maize Haploid

ZHANG Rui-ping ZHOU Lian-dong WANG Wen-jie

（Xinxiang Academy of Agricultural Sciences in Henan Province，Xinxiang Henan 453002）

Abstract Basing on the genetic introduction，the technology of haploid breeding of maize has become the key way of maize breeding，gradually.It′s very necessary to identify maize haploid fastly and accurately.Now we have had a review discussion on the ways of identification of maize haploid.

Key words maize；haploid；identification；research progress

單倍體技術(shù)是指通過(guò)自然發(fā)生或人工誘導(dǎo)獲得單倍體，然后經(jīng)過(guò)自然或人工染色體加倍恢復(fù)其倍性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇從而獲得所需純系的方法。與傳統(tǒng)育種方法相比，單倍體育種技術(shù)在自交系選育上具有快速、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)，因而越來(lái)越受到育種家的重視[1]。但是玉米單倍體自然產(chǎn)生率極低，一般不超過(guò)0.1%[2]，人工誘導(dǎo)概率也僅有10%[3]。

因此，快速準(zhǔn)確地鑒定玉米單倍體尤為關(guān)鍵。目前，玉米單倍體的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、解剖學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、放射性方法鑒定和遺傳標(biāo)記鑒定及分子標(biāo)記鑒定等[4-6]。近年來(lái)，有學(xué)者研究出其他的玉米單倍體鑒定方法，比如在遺傳標(biāo)記基礎(chǔ)上的可見(jiàn)光光譜以及近紅外漫透射鑒定等方法。

1 玉米單倍體鑒定方法

1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

利用形態(tài)學(xué)方法鑒定單倍體是一種直觀、便捷的鑒定方法。玉米單倍體細(xì)胞染色體是正常二倍體細(xì)胞染色體數(shù)目的1/2，因而，相較于二倍體細(xì)胞，單倍體的細(xì)胞和細(xì)胞核都要小很多，正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的植株也比較細(xì)弱。Chase[7-9]指出，單倍體玉米植株的株高、葉長(zhǎng)、莖粗及各部分葉寬相當(dāng)于二倍體植株的70%，而雄穗分枝數(shù)、苞葉數(shù)、節(jié)間數(shù)、穗行數(shù)和每行小穗數(shù)約為二倍體植株的90%。單倍體玉米植株在幼苗生長(zhǎng)早期主根和芽鞘長(zhǎng)短區(qū)別明顯；在苗期第1片葉較短；在拔節(jié)期生長(zhǎng)緩慢，葉片上沖窄小，株高、穗位高顯著低于二倍體；且發(fā)育較快，開(kāi)花期比二倍體早1～2 d。根據(jù)以上區(qū)別能夠比較容易地區(qū)分出單倍體和二倍體。

1.2 解剖學(xué)鑒定

植株轉(zhuǎn)變成單倍體后會(huì)引起解剖學(xué)上的變化，比如單倍體的體細(xì)胞、細(xì)胞核變小，葉綠體數(shù)目減少等。一般通過(guò)分析氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的大小和數(shù)目來(lái)鑒定單倍體。65 μm是區(qū)分小麥單倍體和二倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞直徑長(zhǎng)度的可靠標(biāo)準(zhǔn)，鑒定準(zhǔn)確率超過(guò)90%[10]。而玉米單倍體的鑒定標(biāo)準(zhǔn)定為氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度≤29 μm[11]。

1.3 細(xì)胞學(xué)鑒定

鑒定植物體細(xì)胞或減數(shù)分裂細(xì)胞中染色體數(shù)目是確定倍性的最基本和最精確的方法。細(xì)胞學(xué)鑒定法通常是進(jìn)行根尖分生組織細(xì)胞或減數(shù)分裂細(xì)胞壓片，通過(guò)觀察細(xì)胞中染色體數(shù)目區(qū)分單倍體和二倍體。流式細(xì)胞儀也是很好地用來(lái)判斷細(xì)胞倍性的方法[12]。流式細(xì)胞儀應(yīng)用于倍性判斷上，通過(guò)對(duì)處于旺盛分裂期的細(xì)胞進(jìn)行DNA含量檢測(cè)，從而檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的總核酸量。

1.4 放射性方法鑒定

隨著成長(zhǎng)的植株、幼苗、種子倍性的增加，其對(duì)輻射的抵抗力提高，這種規(guī)律性同樣表現(xiàn)在葉片上。研究表明，在X射線劑量為54.18 C/kg時(shí)，單倍體玉米輻射2 d后出現(xiàn)壞死，而二倍體要20 d才出現(xiàn)壞死。放射性方法可以在很短的時(shí)間內(nèi)照射成千上萬(wàn)張葉片，鑒定快速。

1.5 遺傳標(biāo)記法鑒定

1.5.1 人工肉眼分選。利用孤雌生殖誘導(dǎo)系為材料，并根據(jù)籽粒Navajo標(biāo)記和ABPI紫色植株顯性雙標(biāo)記系統(tǒng)對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體進(jìn)行鑒定[13]。首先根據(jù)籽粒Navajo標(biāo)記性狀選出可能的單倍體籽粒，再經(jīng)過(guò)有無(wú)苗期葉鞘色素或胚根色素確定單倍體的真?zhèn)巍Ｓ纱丝蓪㈦s交籽粒可分為3類[14]：①胚盾狀體、胚乳糊粉層均著色，為雜合二倍體；②盾狀體、糊粉層均未著色，為花粉污染所致；③盾狀體未著色、糊粉層著色，為擬單倍體籽粒，其具有正常3n胚乳和可能由未受精的雌配子發(fā)育成的胚。種植第③類籽粒，若幼苗葉鞘為綠色即為單倍體或雙單倍體。

1.5.2 基于機(jī)器視覺(jué)玉米單倍體分選。在遺傳標(biāo)記的基礎(chǔ)上，李衛(wèi)軍等[15]根據(jù)玉米籽粒胚面顏色標(biāo)記不同，設(shè)計(jì)了一套單倍體分選系統(tǒng)，包括斜面翻滾部件、傳動(dòng)部件、信號(hào)采集與處理部件、籽粒分選部件。該系統(tǒng)基于機(jī)器視覺(jué)，可以在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中全自動(dòng)、高通量地分選單倍體籽粒，其原理是采集具有胚面的玉米籽粒圖片，并判斷胚部區(qū)域是否有顏色標(biāo)記，以此來(lái)鑒別籽粒是單倍體還是二倍體。當(dāng)玉米籽粒為多倍體時(shí)，控制器向電機(jī)發(fā)送信號(hào)，電機(jī)帶動(dòng)玉米擋板滑動(dòng)，打開(kāi)篩選窗口，籽粒落入收容盒；若為單倍體，則電機(jī)不運(yùn)動(dòng)，籽粒保留。

值得注意的是該系統(tǒng)的斜面翻滾部件，可產(chǎn)生玉米籽粒的多姿態(tài)信息，使獲得含胚面圖片的成功率達(dá)到90%，解決了人工擺設(shè)籽粒的問(wèn)題。endprint

1.5.3 基于可見(jiàn)光光譜高效鑒別玉米單倍體籽粒。近年劉 金等[16]已證明利用可見(jiàn)光光譜分析建立玉米單倍體籽粒鑒別方法，并使模型可鑒別未參與建模材料的單倍體具有可行性，并且基于該方法有望建立玉米單倍體籽粒的自動(dòng)化快速篩選系統(tǒng)。

1.5.4 基于近紅外漫透射光譜鑒別玉米單倍體。覃 鴻等[17]證明基于近紅外的漫透射可實(shí)現(xiàn)分析光程縱深信息全累加，得到樣品內(nèi)部信息，對(duì)胚面朝向不敏感，能有效鑒別隨機(jī)擺放的玉米單倍體和多倍體。近紅外方法為實(shí)現(xiàn)實(shí)用化的自動(dòng)鑒別提供了條件。

1.6 油分標(biāo)記鑒定

陳紹江和宋同明[5]最先提出利用油分的花粉直感效應(yīng)鑒定單倍體。用高油的單倍體誘導(dǎo)系作父本的雜交籽粒油分相對(duì)于母本自交的油分大大提高，而由于單倍性，單倍體籽粒不存在花粉直感，油分較低。再利用近紅外光譜儀或核磁共振測(cè)定籽粒油分，從而分選出擬單倍體。

1.7 其他鑒定方法

另外，也有報(bào)道用除草劑抗性方法、SSR標(biāo)記、SNP標(biāo)記、室內(nèi)發(fā)芽等方法鑒別玉米單倍體。

2 各鑒定方法的優(yōu)缺點(diǎn)

形態(tài)鑒定法鑒定速度快。在生長(zhǎng)發(fā)育上，單倍體與其相應(yīng)的二倍體具有高度相關(guān)性，株高是鑒定單倍體準(zhǔn)確的方法[18]，但形態(tài)鑒定法要求鑒定者經(jīng)驗(yàn)豐富。細(xì)胞學(xué)和解剖學(xué)鑒定準(zhǔn)確，但速度較慢，不適合大批量材料的鑒定。放射法鑒定單倍體速度快，但是工作量大，且會(huì)對(duì)玉米植株造成不可逆的損傷。遺傳標(biāo)記系統(tǒng)是由2個(gè)不同遺傳標(biāo)記性狀組合而成，可靠性和鑒別效率較高，但在不同的雜交組合中，標(biāo)記系統(tǒng)中籽粒標(biāo)記的表現(xiàn)差異很大，并且要花費(fèi)大量的人力、物力。

在遺傳基礎(chǔ)上基于機(jī)器視覺(jué)的玉米單倍體分選、基于可見(jiàn)光光譜以及基于近紅外漫透射光譜鑒別玉米單倍體籽粒是近年來(lái)新興的技術(shù)，這幾種方法辨識(shí)度高、效率高，并且有望實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)鑒別玉米單倍體籽粒，是一個(gè)值得深入探究的方向。

油分標(biāo)記鑒定法，雖然基于核磁共振測(cè)油技術(shù)研發(fā)的單倍體自動(dòng)分選儀已經(jīng)成功，但該技術(shù)只能篩選高油型誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的籽粒，目前常規(guī)誘導(dǎo)系是否能利用油分進(jìn)行分選還在探索中。

3 前景展望

在前人研究成果的基礎(chǔ)上，科研工作者們不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，在不久的將來(lái)有望實(shí)現(xiàn)高效自動(dòng)化玉米單倍體鑒別。特別是利用光譜學(xué)原理對(duì)玉米籽粒胚面的鑒別，給玉米單倍體籽粒鑒別提供了新的方向。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 邢錦豐，張如養(yǎng)，段民孝，等.單倍體技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用及其問(wèn)題探討[J].作物雜志，2012（2）：15-17.

[2] 才卓，徐國(guó)良.玉米單倍體育種研究進(jìn)展[J].玉米科學(xué)，2008，16（1）：1-5.

[3] 才卓，徐國(guó)良，劉向輝，等.玉米高頻率單倍生殖誘導(dǎo)系吉高誘系3號(hào)的選育[J].玉米科學(xué)，2007，15（1）：1-4.

[4] 韓贊平，王彬，張澤民.玉米的單倍體育種[J].種子，2010，29（1）：120-122.HAN Zanping，WANG Bin，ZHANG Zemin.Haploid breeding of maize[J].Seed，2010，29（1）：120-122.

[5] 陳紹江，宋同明.利用高油分的花粉直感效應(yīng)鑒別玉米單倍體[J].作物學(xué)報(bào)，2003，29（4）：587-590.CHEN Shaojiang，SONG Tongming.Identification haploid with high oil xenia effect in maize[J].Acta Agrono-mica Siniea，2003，29（4）：587-590.

[6] 湯飛宇，丁菲，王國(guó)英.利用SSR標(biāo)記檢測(cè)來(lái)源于玉米孤雌生殖的雙單倍體[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26（6）：859-862.TANG Feiyu，DING Fei，WANG Guoying.Identification of doubled haploid plants from maize gynogenesis by SSR molecular marker[J].Acta Agriculturae Unive-rsitatis Jiangxiensis，2004，26（6）：859-862.

[7] CHASE S S.Monoploid frequencies in a commercial double scross hybrid maize，and in its compenent single cross hybrids and inbred lines[J].Genetics，1949，34：328.

[8] CHASE S S.Production of homozygous diploids of maize from monoplloids[J].Agron J，1952，44：263-267.

[9] CHASE S S.Monoploids and monoploid derivatives of maize（Zae mays L.）[J].Bot Review，1969，35：117-167.

[10] 王培，陳玉蓉，方仁，等.用保衛(wèi)細(xì)胞鑒定花粉植株倍性方法的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，15（2）：141-145.

[11] 李春紅，孟祥啟，蔣有繹.玉米花藥培養(yǎng)及再生植株倍性鑒[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1993，8（2）：64-68.

[12] 吳雅琴，常瑞豐，程和禾.流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性分析的原理和方法[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006（4）：407-409.

[13] COE E H.A line of maize with haploid frequency[J].Aner Nat，1959，93：381-382.

[14] 梁文科，戚延香，徐尚忠.單倍體技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用和新進(jìn)展[J].玉米科學(xué)，2004，12（3）：13-15.

[15] 李衛(wèi)軍，劉玉梅，陳紹江，等.基于機(jī)器視覺(jué)的玉米單倍體自動(dòng)分選系統(tǒng)[J].農(nóng)機(jī)化研究，2016，1（1）：81-84.

[16] 劉金，郭婷婷，李浩川，等.基于可見(jiàn)光光譜高效鑒別玉米單倍體籽粒[J].光譜學(xué)與光譜分析，2015，35（11）：3268-3274.

[17] 覃鴻，馬競(jìng)一，陳紹江，等.基于近紅外漫反射與漫透射光譜的玉米單倍體鑒別比較研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2016，36（1）：292-297.

[18] 韓學(xué)莉，唐祈林，曹墨菊，等.用Stock6雜交誘導(dǎo)的單倍體鑒定方法初探[J].玉米科學(xué)，2006（1）：64-66.endprint