混合菌種發酵牛骨粉制備血管緊張素轉換酶抑制肽

劉麗莉，梁嚴予，尹光俊，李　丹，楊陳柳

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

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混合菌種發酵牛骨粉制備血管緊張素轉換酶抑制肽

劉麗莉，梁嚴予，尹光俊，李丹，楊陳柳

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

利用蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)MBL 13-U、植物乳桿菌(Lp)和嗜熱鏈球菌(St)混合發酵牛骨粉，制備牛骨血管緊張素轉換酶(ACE)抑制肽。通過正交試驗，以膠原多肽質量濃度為指標，確定最佳菌種體積比為V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量(質量分數)為2.5%，骨粉添加量(質量分數)為3.5%。在單因素試驗基礎上采用中心組合試驗設計，以ACE抑制率為指標，確定最佳發酵工藝條件：接種量(質量分數)為4%，發酵溫度為37 ℃，發酵時間為42 h，發酵液初始pH值為7.0。經驗證試驗，在最佳發酵條件下，多肽液的ACE抑制率最高為(51.73±0.65)%。針對牛骨ACE抑制肽的特性，得到混合菌種發酵牛骨粉的最佳工藝參數。

混合菌種；發酵；牛骨ACE；膠原多肽

0　引言

近年來，中國已成為世界上高血壓致死率最高的國家，平均每年有400萬的新增高血壓病患者，并向青年化發展[1-2]，但目前市售的降血壓藥物效果均不理想或副作用較大。研究表明：降血壓肽具有降血壓、免疫促進和抗凝血等功能[3]，因此，對天然、高效、預防和治療高血壓的食源性膠原多肽產品的開發逐漸成為研究熱點[4]。文獻[5]綜合比較了多種不同發酵食品的降血壓活性，發現大豆和干酪等食品經發酵后含有較高活性的降血壓肽。文獻[6]通過酶解雞腿骨蛋白制備了降血壓肽，并測定了酶解過程中的pH值、肽質量濃度和水解度。文獻[7]依次采用堿性蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶對豬股骨膠原蛋白進行酶解，以制備降血壓肽。牛骨雖然是膠原蛋白的優良資源，但因得不到合理利用大部分被丟棄，造成了資源浪費和環境污染。因此，充分利用牛骨資源，將膠原蛋白經酶降解為相對分子質量較低的牛骨降血壓肽，具有重大的經濟及現實意義。

目前，對膠原多肽的制備常采用酶解法[8]，此方法條件溫和、操作安全、過程易控制，但缺點是具有一定的不定向性、產品純度不高、酶制劑的成本較高及易產生苦味肽等。文獻[9-10]發現微生物復雜的生理生化機制在降解蛋白的同時，還能使過程中產生的苦味肽物質得到轉化從而達到脫苦的目的，但在實際研究中發現采用單一菌種純種發酵有很大的局限性，發酵液中蛋白酶活力低，從而使產品中多肽質量濃度較低。因此，本文采用產膠原蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，B.cereus)MBL 13-U菌株結合植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,Lp)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus,St)混合發酵牛骨粉制備血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。以發酵時間、發酵溫度和發酵液初始pH值等為單因素，以膠原多肽質量濃度和ACE抑制率為指標，對混合菌種發酵工藝進行了優化，得到混合菌種發酵牛骨粉的最佳工藝參數，為工業化生產提供科學的理論依據。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑

新鮮牛腿骨，購于洛陽市老城區某農貿市場；蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)MBL 13-U由本課題組篩選誘變所得；嗜熱鏈球菌(St)和植物乳桿菌(Lp)，購于上海紀寧試劑有限公司。蔗糖、蛋白胨、牛肉膏、乙酸鈉、骨明膠、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂和瓊脂粉等購于天津德恩有限公司，均為分析純。

1.2儀器與設備

MXX1400-40型萬用電爐，濟南鑫貝西生物有限公司生產；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器有限公司生產；DZKW型電熱恒溫水浴鍋，北京永光明醫療儀器有限公司生產；DHG-9013A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司生產。

1.3主要培養基

B.cereusMBL 13-U種子培養基(100 mL)：含蔗糖1.00 g，骨明膠2.00 g，磷酸氫鈉 0.05 g，磷酸氫鉀 0.25 g，氯化鈣0.05 g。pH值7.0～7.2。

Lp種子培養基(100 mL)：含蛋白胨1.00 g，牛肉膏1.00 g，酵母膏0.50 g，葡萄糖0.50 g，磷酸氫鉀 0.20 g，硫酸鎂 0.05 g，吐溫80 0.10 g，硫酸錳 0.025 g。pH值6.5。

St種子培養基(100 mL)：含胰蛋白胨2.00 g，蔗糖0.50 g，酵母提取物0.50 g，骨明膠0.25 g，乙酸鈉 0.15 g，葡萄糖0.50 g，抗壞血酸0.05 g，乳糖0.50 g，瓊脂1.50 g。pH值6.8。

2　試驗與測定方法

2.1試驗步驟

試驗步驟為：牛腿骨→預處理→牛骨粉(100目過篩)→發酵液→滅菌→接種→發酵→滅菌→離心取上清液→超濾分離純化→真空冷凍干燥→牛骨ACE抑制肽[11]。

表1　單因素試驗因素與水平表

采用固定的發酵培養條件：菌種體積比V(B.cereusMBL13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量(質量分數)為1.5%，牛骨粉添加量(質量分數)為3%，接種量為3%，在37 ℃、pH 7.0、180 r/min搖床振蕩培養48 h。以菌種體積比V(B.cereusMBL13-U)∶

V(Lp)∶V(St)分別為1∶0∶0、1∶1∶0、1∶0∶1、

1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1，蔗糖添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，骨粉添加量分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%為單因素，發酵液中膠原多肽含量為指標，在單因素試驗基礎上通過三因素三水平正交試驗確定最佳發酵培養基組合。單因素試驗因素與水平表見表1。

為提高發酵效率，在優化最佳發酵培養基的基礎上，選擇以接種量、發酵溫度、發酵時間和發酵液初始pH值4個因子為變量，以ACE抑制率為指標，利用中心組合設計(central composite design,CCD)對影響發酵的因素條件進行了優化。

2.2測定方法

發酵液中膠原多肽質量濃度的測定采用雙縮脲法：配制不同濃度梯度的牛血清白蛋白標準溶液，各取 6.0 mL 分別與4.0 mL的雙縮脲試劑充分混勻，靜置30 min后在λ=540 nm處測定吸光度(optical density，OD)值，繪制多肽的標準曲線。加5 mL三氯乙酸溶液至5 mL牛骨粉發酵液中，混合均勻后靜置10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL加入4 mL雙縮脲試劑，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min。取上清液在540 nm處測其OD值，通過標準曲線求得樣品的多肽質量濃度。

ACE抑制率的測定采用紫外比色法：取50 μL、5.0 mmol/L 馬尿酰組胺酰亮氨酸與10 μL發酵上清液混勻，37 ℃水浴預熱5 min，加入10 μL、0.1 U/mL ACE，37 ℃水浴反應1 h，加入75 μL、1.0 mol/L 鹽酸終止反應。加入0.6 mL乙酸乙酯充分混勻后，4 000 r/min離心10 min。取1 mL乙酸乙酯置于試管中放入烘箱，110 ℃揮發60 min后用4 mL蒸餾水溶解，充分混合30 s，在波長228 nm處測定其OD值。 ACE抑制率(%)=(B-A)×100/(B-C)，其中：A為加入ACE抑制劑的樣品OD值；B為不加ACE抑制劑的樣品OD值；C為不加ACE的樣品OD值。

采用Origin 8.5和Design-Expert 8.05軟件進行數據分析，并作響應面及等高線圖。

2.3牛骨ACE抑制肽的結構分析

取少量牛骨ACE抑制肽樣品均勻涂抹于掃描電鏡(scanning electron microscop,SEM)樣盤雙面膠上，進行噴金鍍膜處理后置于掃描電鏡抽真空，調整電壓，放大不同倍數獲取清晰掃描圖像。

室溫條件下，取0.50 g分離干燥的牛骨ACE抑制肽溶于30 mL去離子水，將其置于紫外-可見光掃描儀上200～450 nm進行掃描[12]。

3　結果與分析

3.1正交試驗確定培養基最佳比例

3.1.1單因素試驗

當混合菌種體積比V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1時，測得的發酵液中膠原多肽質量濃度最大為3.67 mg/mL；當蔗糖添加量為2.5%時，發酵液中的膠原多肽質量濃度達到最大值2.81 mg/mL；當骨粉添加量為3.0%時，膠原多肽質量濃度達到最大值3.38 mg/mL。

在上述單因素試驗的基礎上，針對菌種體積配比(A)、蔗糖添加量(B)和骨粉添加量(C)3個因素，以膠原多肽質量濃度為指標，采用L9(34)正交表進行試驗，確定最佳發酵培養基組成。

3.1.2正交試驗

因素主次為A>B>C，即對膠原多肽質量濃度影響最大的因素是混合菌種的體積配比，其次是蔗糖添加量，最后是骨粉添加量，且綜合評價最佳組合為A2B2C2。從而確定最佳菌種體積比為V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量為2.5%，骨粉添加量為3.5%。

3.2接種量對膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響

混合菌種接種量對發酵過程中膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響如圖1所示。由圖1可知：隨著接種量的增加，在接種量為4%時，膠原多肽質量濃度達到最大值3.62 mg/mL；超過4%時，膠原多肽質量濃度和ACE抑制率均顯著降低，這可能是由于隨著活菌數的逐漸增多，水解黏度增大，水解速度降低，對水解反應有抑制作用，且菌種增多的同時需要大量氮源，導致多肽被菌體利用而減少。因此，選擇混合菌種的最佳接種量為4%。

3.3發酵溫度對膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響

發酵溫度對發酵過程中膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響如圖2所示。隨著發酵溫度的升高，膠原多肽質量濃度和ACE抑制率均呈現先上升后下降的趨勢，膠原多肽質量濃度在37 ℃時達到最大值3.36 mg/mL，ACE抑制率在40 ℃時達到最大值34.12%，這與溫度對于菌體生長以及酶活力的影響有關。且40 ℃以上，膠原多肽質量濃度的減少幅度明顯增大，說明發酵溫度對膠原多肽質量濃度影響較大。因此，選擇最佳發酵溫度為37 ℃。

圖1　接種量對膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響

圖2　發酵溫度對膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響

3.4發酵時間對膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響

發酵時間對發酵過程中膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響如圖3所示。由圖3可知：隨著發酵時間的延長，ACE抑制率增加，在42 h時達最大值33.69%，之后呈現下降趨勢。膠原多肽質量濃度也隨發酵時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，在發酵48 h時達到最大值，這可能是由于過長的發酵時間破壞了牛骨粉中的營養成分，從而抑制了酶系統的水解作用，導致ACE抑制肽的減少。綜合考慮膠原多肽質量濃度和ACE抑制率，選擇最佳發酵時間為42 h。

3.5發酵液初始pH值對膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響

發酵液初始pH值對發酵過程中膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響如圖4所示。由圖4可知：當發酵液初始pH值升高，膠原多肽質量濃度和ACE抑制率值均呈現先上升后下降的趨勢。在發酵液初始pH值為6.5時，膠原多肽質量濃度達到最大值3.60 mg/mL；初始pH值升到7.0時，ACE抑制率達到最大值37.36%。綜合考慮，選擇最佳發酵液初始pH值為6.5。

圖3　發酵時間對膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響

圖4　發酵液初始pH值對膠原多肽質量濃度和ACE抑制率的影響

3.6中心組合設計優化發酵工藝條件

在上述單因素試驗的基礎上，對影響牛骨粉發酵的工藝條件進行優化，以菌種接種量(X1)、發酵溫度(X2)、發酵時間(X3)和發酵液初始pH值(X4)4個因子為變量，以ACE抑制率為指標，進行CCD試驗設計。再利用Design-Expert 8.05軟件對試驗數據進行統計分析，得到二次項回歸方程為：

0.099 306X2X3-0.725X2X4-1.683 33X3X4。

對回歸方程進行方差分析，結果見表2。

表2　中心組合設計回歸模型方差分析

圖5　ACE抑制率響應面等高線圖

由圖5及回歸方程得到發酵工藝最優組合為：接種量為4%，發酵溫度為37 ℃，發酵時間為42 h，發酵液初始pH值為7.0，多肽液的ACE抑制率理論最高值為52.07%。由于該組合不在所列試驗中，為了驗證回歸模型的有效性，在利用最優工藝組合情況下，進行3組驗證試驗，求得平均值為(51.73±0.65)%，偏差絕對值小于2%，說明本試驗建立的回歸模型能較好地描述因素與指標的關系。

3.7牛骨ACE抑制肽掃描電鏡和紫外掃描結果

牛骨ACE抑制肽經放大25 000倍的掃描電鏡照片如圖6所示，牛骨ACE抑制肽表面出現了明顯的溝壑痕跡，可能是由于牛骨ACE抑制肽的親水區具有較強的吸濕性，接觸空氣后極易吸水，在掃描過程中的真空環境下失水所造成的。

牛骨ACE抑制肽的紫外(ultraviolet，UV)掃描結果如圖7所示。文獻[13]研究表明：在波長200～230 nm，膠原多肽的羰基及肽鍵有特征吸收峰。牛骨ACE抑制肽的UV掃描在波長214～222 nm出現強吸收峰，在280 nm處無吸收峰出現，這是因為牛骨膠原蛋白水解后得到的ACE抑制肽鏈中含有的CO—NH2、C—O和—COOH都是生色基團，能夠在220 nm左右產生光吸收[14]。因此，所制備的ACE抑制肽符合膠原多肽的吸收特性。

圖6　牛骨ACE抑制肽的SEM照片

圖7　牛骨ACE抑制肽紫外掃描圖

4　結論

(1)分別以蔗糖為碳源、牛骨粉為氮源，以發酵液中膠原多肽質量濃度為指標，采用3因素3水平正交試驗，確定最佳發酵培養基組合為：菌種體積比為V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量為2.5%，骨粉添加量為3.5%。

(2)選擇混合菌種接種量、發酵溫度、發酵時間和發酵液初始pH值為因素，以膠原多肽質量濃度和ACE抑制率為指標，確定各因素最佳值：接種量為4%，發酵溫度為37 ℃，發酵時間為42 h，發酵液初始pH值為6.5。

(3)在單因素試驗基礎上，采用中心組合試驗設計，選擇ACE抑制率為指標，通過響應面和回歸方程得到最佳發酵工藝：接種量為3%，發酵溫度為37 ℃，發酵時間為42 h，發酵液初始pH值為 7.0，此時多肽液的ACE抑制率理論最高值為52.07%。經驗證試驗測得試驗值為(51.73±0.65)%，表明試驗建立的回歸模型能較好地對混合菌種發酵牛骨粉制備ACE抑制肽進行預測。

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國家自然科學基金項目(31401622);河南省重點攻關基金項目(152102110080);河南省教育廳自然科學研究基金項目(13A550255);河南科技大學高級別項目培育基金項目(2013ZCX012);國家農業部公益性行業(農業)科研專項基金項目(201303084)

劉麗莉(1974-),女,河南商丘人，副教授,博士,碩士生導師，主要研究方向為畜產品加工技術.

2016-05-26

1672-6871(2017)01-0067-06

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.01.014

TS253.1

A