RRM2基因過表達卵巢癌細胞株SKOV3的構建及對順鉑敏感性觀察

王中山，張夢，張冬梅，楊新慧

(1徐州醫科大學，江蘇徐州221004；2徐州市中心醫院)

·基礎研究·

RRM2基因過表達卵巢癌細胞株SKOV3的構建及對順鉑敏感性觀察

王中山1，張夢2，張冬梅2，楊新慧2

(1徐州醫科大學，江蘇徐州221004；2徐州市中心醫院)

目的構建核糖核苷酸還原酶亞基M2(RRM2)基因過表達的卵巢癌細胞株SKOV3，并觀察RRM2基因過表達的SKOV3細胞對順鉑的敏感性。方法提取SKOV3細胞總RNA，反轉錄得到cDNA，以其為模版進行PCR反應，獲得RRM2基因。通過酶切(XhoⅠ、BamHⅠ)連接的方法，將RRM2基因插入慢病毒表達載體pLVX-IRES-ZsGreen1中，得到重組質粒pLVX-IRES-RRM2。利用脂質體將重組質粒轉染293FT細胞，包埋病毒。將SKOV3細胞分為實驗組和對照組，實驗組轉染pLVX-IRES-RRM2慢病毒，96 h后測算慢病毒感染效率。對照組不進行轉染。采用Western blotting法檢測兩組細胞中的RRM2蛋白；流式細胞儀檢測兩組凋亡細胞與死亡細胞，反映細胞對順鉑的敏感性。結果重組質粒pLVX-IRES-RRM2經限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切驗證，各片段大小符合預期，測序結果顯示RRM2基因序列正確。實驗組、對照組細胞中RRM2 mRNA相對表達量分別為0.280±0.055、0.102±0.022，RRM2蛋白相對表達量分別為0.582±0.049、0.228±0.032，實驗組高于對照組，說明RRM2基因過表達的SKOV3細胞構建成功。實驗組、對照組凋亡細胞比例分別為0.39%±0.08%、9.60%±1.20%，死亡細胞比例分別為26.65%±2.20%、44.96%±2.80%，實驗組凋亡細胞比例和死亡細胞比例均低于對照組(P均<0.01)。結論成功構建了RRM2基因過表達的SKOV3細胞，RRM2基因過表達的SKOV3細胞對順鉑的敏感性降低。

卵巢癌；卵巢癌細胞株；核糖核苷酸還原酶家族成員2；順鉑；藥物耐受性；藥物敏感性

卵巢癌是常見的婦科腫瘤，病死率位居婦科惡性腫瘤之首[1]，多數(85%)為上皮性卵巢癌(EOC)[2]。卵巢癌主要的治療手段為最大程度的減瘤術繼之以鉑類為主的化療[3,4]。但卵巢癌細胞對順鉑等化療藥物存在耐受性[5]，導致腫瘤復發率高，患者3年生存率較低[6]。順鉑耐藥的一個重要因素是DNA損傷修復。順鉑誘發的DNA損傷以30 nt單鏈的形式被從基因組切除[7，8]，隨后單鏈間隙由聚合酶填補，形成完整無錯的DNA。為了修復損傷的DNA，細胞將通過p53調控核糖核苷酸還原酶(RNR)增加脫氧核糖核苷酸(dNTP)的合成[9,10]。RNR由兩個核糖核苷酸還原酶家族成員(RRM)1大亞基和兩個RRM2小亞基組成，能催化核糖核苷酸轉變為dNTP，為DNA復制和修復提供原料[11,12]。RRM1在不同的細胞周期均穩定表達，且表達量超過RRM2；而RRM2表達量則隨著細胞周期波動較大，并決定了RNR活性[11～16]。因此，RRM2在DNA損傷的修復過程中具有至關重要的作用，其在所有物種中高度保守，表達受到嚴格調控[17,18]。本研究構建了RRM2基因慢病毒過表達載體，包埋病毒，感染卵巢癌細胞SKOV3，觀察RRM2基因過表達的SKOV3細胞對順鉑藥物敏感性的變化，為闡明RRM2參與卵巢癌細胞耐藥的機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料卵巢癌細胞株SKOV3、293FT、大腸桿菌DH5α、pLVX-IRES-ZsGreen1、psPAX2和pMD2.G病毒載體均為本實驗室保持。pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ購自Fermentas公司。RRM2一抗(兔源)和二抗(羊抗兔IgG)、GAPDH一抗和二抗均購自Abcam公司。凋亡檢測試劑盒購于Beyotime公司。引物合成與測序由金唯智(蘇州)公司完成。所用試劑均為分析純。

1.2 RRM2基因過表達慢病毒的制備 RRM2基因上游引物序列為5′-CGTCCTCGAGATGCTCTCCCTCCGTGTCCC-3′，下游引物序列為5′-CGTCGGATCCTTAGAAGTCAGCATCCAAGGTAAAA-3′。TRIzol試劑提取卵巢癌細胞株SKOV3總RNA，反轉錄獲得cDNA，進行PCR反應，得到RRM2基因，并在基因兩端插入XhoI、BamHI酶切位點。通過酶切連接的方法將RRM2基因插入慢病毒表達載體pLVX-IRES-ZsGreen1(Clontech)中，得到重組質粒pLVX-IRES-RRM2。重組子質粒經XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定后送測序。于60 mm細胞培養板接種293FT細胞，在細胞匯合度為80%～90%時進行轉染。用Lipofectamine2000轉染質粒pLVX-IRES-RRM2、psPAX2和pMD2.G，96 h后收集細胞培養液上清，經0.45 μm濾膜過濾，隨后用濃縮管在4 000 g、4 ℃下離心濃縮并進行滴度測定，分裝成小份于-80 ℃保存。

1.3 RRM2基因過表達的SKOV3細胞的構建 人卵巢癌細胞株SKOV3用含有10%小牛血清的RMPI1640培養基在37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養。待細胞長至培養瓶壁的80%～90%，棄去培養瓶中的培養液，PBS沖洗2遍，去除細胞碎片及殘余培養基，加入胰酶。將細胞置于倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓，加入含血清培養液終止胰酶消化。反復輕輕吹打細胞，傳代，分裝。將重懸液轉入離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入PBS重懸細胞、離心，重復3遍，洗凈胰酶及血清。加入PBS重懸細胞，并將懸液移入無菌EP管中，離心棄上清，-80 ℃保存備用。將SKOV3細胞分為實驗組和對照組。實驗組細胞轉染pLVX-IRES-RRM2，并于轉染96 h后，利用表達載體中的報告基因(EGFP)，通過熒光顯微鏡觀察卵巢癌細胞的慢病毒感染效率。對照組不進行轉染。采用RT-PCR法檢測兩組細胞中RRM2 mRNA。RRM2基因上游引物序列為5′-CGCTTTGTCATCTTCCC-3′，下游引物序列為5′-CATAAAGTCAAATGGGTTCT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，下游引物序列為5′-GCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。采用Western blotting法檢測兩組細胞中的RRM2蛋白：使用胰蛋白酶消化、并離心收集細胞，棄上清液，細胞沉淀中加入裂解液重懸，獲得SKOV3細胞總蛋白；通過SDS-PAGE分離不同分子量的蛋白質，然后通過半干轉/濕轉方法轉移到PVDF膜上；將膜用含有5%脫脂奶粉的PBS室溫孵育2 h，加入一抗于4 ℃孵育過夜，隨后PBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h，PBST再次洗膜；加入發光液，X線片曝光、顯影、定影，掃描圖像，采用Image J軟件分析圖像，得出RRM2蛋白相對表達量。

1.4 RRM2基因過表達的SKOV3細胞對順鉑敏感性觀察 將實驗組與對照組細胞分別以3 μg/mL的順鉑處理48 h，按照Annexin V-FITC試劑盒進行操作：將收集的細胞用4 ℃預冷的PBS緩沖液洗2次，再重懸細胞轉移至1.5 mL的EP管內；用400目篩網過濾細胞，除去細胞碎片及成團細胞；1 000 r/min離心5 min，去上清；1×結合緩沖液重懸細胞，調整濃度為2×106個/mL；取300 μL的細胞懸液于流式管中；加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；上機前5 min再加入5 μL的碘化丙錠溶液(PI)染色。上機前，補加200 μL的1×結合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測分析。

2 結果

重組質粒pLVX-IRES-RRM2經限制性內切酶XhoI和BamHI雙酶切驗證，各片段大小符合預期(圖1)，測序結果顯示RRM2基因序列正確。RRM2基因開放閱讀框長1 170 bp，編碼389個氨基酸，其蛋白質分子量為44.8 kD。熒光顯微鏡觀察SKOV3細胞的慢病毒感染效率達到40%，可應用于后續研究。實驗組、對照組細胞中RRM2 mRNA相對表達量分別為0.280±0.055、0.102±0.022，RRM2蛋白相對表達量分別為0.582±0.049、0.228±0.032，兩組相比，P均<0.01。說明RRM2基因過表達的SKOV3細胞構建成功。見圖2。實驗組、對照組凋亡細胞比例分別為0.39%±0.08%、9.60%±1.20%，死亡細胞比例分別為26.65%±2.20%、44.96%±2.80%，實驗組凋亡細胞比例和死亡細胞比例均低于對照組(P均<0.01)。

注：M為Marker；1為pLVX-IRES-RRM2質粒的XhoⅠ單酶切產物；2為pLVX-IRES-RRM2質粒的XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切產物；3為RRM2基因的PCR產物。

圖1RRM2病毒過表達質粒雙酶切驗證情況

注：A為RRM2蛋白檢測結果；B為RRM2 mRNA檢測結果；M為Marker；1為實驗組；2為對照組。

圖2實驗組和對照組細胞中RRM2蛋白、mRNA表達情況

3 討論

多年來，盡管惡性腫瘤相關研究取得了很大的進展，但卵巢癌患者的5年生存率仍保持在30%左右，對順鉑等化療藥物的耐受可能是卵巢癌患者死亡的重要因素。因此，闡明卵巢癌耐藥的分子機制，尋找耐藥相關基因對于卵巢癌的臨床治療具有重要意義。

RRM2基因編碼的蛋白質亞基是DNA合成和修復的限速單位，在RNR催化核糖核苷酸轉變為dNTP過程中必不可少，而dNTP是DNA復制和修復的原料。RRM2表達量則隨著細胞周期波動較大，調控了RNR的催化活性。正因為承載著這種至關重要的功能，RRM2在細胞增殖和DNA損傷的修復過程中具有舉足輕重的作用。

順鉑是腫瘤治療常用的一線化療藥物，其主要是通過結合到DNA的雙分子鏈上，抑制DNA復制、轉錄等功能，從而達到殺傷腫瘤細胞的效果。順鉑損傷DNA后，腫瘤細胞本身將啟動切除修復等機制，剪切掉順鉑結合的DNA區域，消除順鉑對細胞的殺傷作用，而切除后的DNA鏈則亟需dNTP原料進行修復，所以RRM2在順鉑所造成的DNA損傷修復過程中也是必需的。RRM2基因很可能在卵巢癌細胞對順鉑的耐藥過程中扮演著重要角色。

前期研究證實，RRM2在耐藥卵巢癌患者的組織和血液中均高表達[19,20]，而RRM2表達與患者的5年生存率呈負相關，即RRM2表達量越高則患者可能因耐藥等因素導致的死亡發生越早[2]。為了深入研究RRM2在卵巢癌順鉑耐藥機制中的作用，我們構建了RRM2基因慢病毒過表達載體，感染卵巢癌細胞SKOV3，結果顯示，感染慢病毒后SKOV3細胞中RRM2蛋白表達上調，說明慢病毒載體的構建和病毒包埋都是成功的，這也為后續RRM2的功能研究奠定了基礎。

本研究結果還顯示，RRM2基因過表達的SKOV3細胞對順鉑的化療敏感性明顯降低。在同樣濃度的順鉑作用下，實驗組死亡細胞比例和凋亡細胞比例均低于對照組，說明RRM2過表達在卵巢癌細胞對順鉑的耐藥過程中發揮了重要作用。考慮到RRM2的主要功能是參與dNTP的合成，我們推測，RRM2基因過表達能夠提高卵巢癌細胞內dNTP水平，為順鉑所造成的DNA損傷的修復過程提供充足原料；DNA損傷修復以后，卵巢癌細胞的凋亡和死亡趨勢得到緩解，從而降低了順鉑對腫瘤細胞的殺傷作用。

總之，本研究成功構建了RRM2過表達的SKOV3細胞，并初步證實RRM2過表達能夠使卵巢癌細胞對順鉑的敏感性降低。上述研究結果為進一步闡明RRM2基因參與卵巢癌細胞耐藥的機制奠定了基礎。

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