DSC和同步輻射寬角XRD法研究丹皮酚在脂質體疏水尾鏈區的包封位置及對膜流動性的影響

魏田田,郭皓月,周洪偉,鄔瑞光*

(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.清華大學化學系，生命有機磷化學與化學生物學教育部重點實驗室，北京 100084;3.中國中醫科學院，中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700)

中藥研究

DSC和同步輻射寬角XRD法研究丹皮酚在脂質體疏水尾鏈區的包封位置及對膜流動性的影響

魏田田1,郭皓月2,周洪偉3,鄔瑞光1*

(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.清華大學化學系，生命有機磷化學與化學生物學教育部重點實驗室，北京 100084;3.中國中醫科學院，中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700)

目的：研究丹皮酚在脂質體疏水尾鏈區的包封位置及對膜流動性的影響，進而探討其抗氧化作用機制。方法：薄膜分散法制備丹皮酚脂質體，采用差示掃描量熱法(DSC)研究丹皮酚對脂質體膜主相變的影響，進而探討丹皮酚在脂質體疏水尾鏈的包封位置，采用同步輻射寬角X光衍射法(XRD)研究丹皮酚對液晶態的脂質體膜疏水尾鏈間距的影響，進而探討其對膜流動性的影響及與抗氧化作用機制的關聯。結果：DSC結果表明，隨著丹皮酚濃度的增大，脂質體的主相變溫度逐漸降低，半峰寬逐漸增大，同步輻射寬角X光衍射結果表明與液晶態的空白脂質體相比，丹皮酚的包封增大了磷脂分子疏水尾鏈之間的距離。結論：丹皮酚分子主要作用在磷脂分子疏水尾鏈的C1～C9的位置；丹皮酚的包封可以增加液晶態膜尾鏈的無序度，從而提高膜的流動性，這是其發揮抗氧化作用可能的作用機制。

差示掃描量熱；同步輻射寬角X光衍射；丹皮酚；脂質體；包封位置；膜流動性；抗氧化

丹皮酚(結構式見圖1)又稱牡丹酚，是中藥牡丹皮和徐長卿的主要活性成分，其藥理活性廣泛，臨床多用于心、腦血管、腫瘤、炎癥、變態反應和免疫系統等疾病[1]。但丹皮酚在水中溶解度很低且易揮發，見光易氧化分解，在臨床應用中受到制約[2]，將其制成脂質體不僅可以提高丹皮酚的生物利用度，還可以提高其靶向性，增強療效。

脂質體是脂質分子分散在水中自組裝形成的囊泡，主要組成成分是磷脂，脂質體膜中常用的磷脂是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC，結構式見圖1)，磷脂雙分子層構成了細胞膜的基本支架，因此，脂質體可以用作生物膜的模型膜[3]。Nunes[4]等以脂質體模擬細胞膜研究了五種非甾體抗炎藥對細胞膜的擾動作用，揭示了非甾體抗炎藥可能的作用機制。脂質體膜隨著溫度的變化可能呈現晶體相、層狀凝膠相、波動凝膠相和液晶相等不同的相態[5]，外源物質的加入將影響脂質體的相轉變，使膜的流動性發生改變。細胞膜的流動性是細胞膜重要的生物物理特征，膜流動性的改變將影響各種膜功能，如物質轉運、信息傳遞及膜上酶的活性等[6]。

課題組前期已經用差示掃描量熱(DSC)法及同步輻射小角X光衍射法研究了丹皮酚和DPPC的相互作用[3]以及丹皮酚、膽固醇與DPPC之間的競爭性相互作用[7]。藥物在脂質體中可能包封于DPPC分子的膽堿部位、甘油骨架部位及疏水尾鏈部位，疏水尾鏈區又分為C1～C9區和C10～C16區[8]。包封于磷脂分子的不同位置對膜流動性的影響也不同。本文采用差示掃描量熱(DSC)法結合同步輻射寬角X光衍射方法研究丹皮酚在脂質體疏水尾鏈區中的包封部位及對液晶態膜流動性的影響，并探討其與丹皮酚抗氧化作用的關聯性。

圖1 丹皮酚和DPPC的結構式

1 儀器與試藥

1.1 儀器

821e型差示掃描量熱儀 (瑞士梅特勒-托利多公司);同步輻射X光衍射實驗裝置(北京同步輻射國家實驗室1W2A站);XSE105DU型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);EHEIM型變溫附件(英國Linkam公司);RE-52AA型旋轉蒸發儀(上海亞榮);DZF6050型真空干燥設備(上海一恒)。

1.2 試藥

二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC，美國Sigma公司，純度>99%);丹皮酚(美國Sigma公司，純度>99%);其他國產試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 丹皮酚脂質體的制備

參照文獻[9]的方法制備脂質體：按計量比例稱取DPPC和丹皮酚，溶解于氯仿中，通過旋轉蒸發以除去氯仿至燒瓶內壁形成薄膜，真空干燥箱中過夜以除去殘留的有機溶劑；加入過量的Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液，置于60℃水浴1 h，旋渦混合1 min，室溫20 min，旋渦混合1 min，如此反復3次，至體系均勻分散。

2.2 差示掃描量熱實驗

采用高靈敏度傳感器HSS7，實驗氣氛為 N2，以空白坩堝做參比。為了保證樣品在升溫過程中處于相平衡的狀態，選擇較低的升溫速率1 ℃/min。實驗結果見圖2與表1。

圖2 含不同摩爾百分比丹皮酚的脂質體的DSC曲線

丹皮酚摩爾百分比主相變相變溫度(℃)半峰寬(℃)相變焓(J/g)042．80．642．181040．71．342．722040．41．945．242539．82．143．90

圖2所示為空白DPPC和丹皮酚含量不同的DPPC脂質體膜的DSC曲線。空白DPPC脂質體膜的DSC曲線顯示兩個峰，第一個峰峰形平緩且峰面積小，相變溫度為36.6℃，對應預相變(Lβ′to Pβ′)；第二個峰峰形尖銳且峰面積較大，相變溫度為42.8℃，對應主相變(Pβ′to Lα)。這一結果與文獻報導的空白DPPC脂質體的相變溫度一致[10-11]。由表1可知，與空白脂質體相比，隨著丹皮酚濃度的增大，含藥脂質體主相變溫度逐漸減小，半峰寬ΔT1/2逐漸增大，相變焓先增大后減小。

2.3 同步輻射寬角XRD實驗

在實驗過程中使用可以程序控溫的Linkam變溫附件(英國Linkam公司)對樣品進行溫度控制。衍射波長為1.54 ?，樣品與檢測器的距離為246 mm，曝光時間為120 s。衍射圖像用Fit2D軟件(http://www.esrf.eu/computing/scientific/FIT2D/)處理以得到衍射強度與倒置距離s之間的二維衍射曲線，由倒置間距s可求得反映磷脂分子尾鏈有序度的尾鏈間距d(d=1/s)。

脂質體可以用作細胞膜的模型膜。細胞膜適當的流動性是保證細胞功能的關鍵。生理溫度下的細胞膜是液晶態的，因此在模擬細胞膜時應使脂質體處于液晶態。根據圖2和表1所示，空白脂質體和各含藥脂質體在45℃時都處于液晶相。因此本實驗進行了45℃下各樣品的同步輻射寬角X光衍射實驗。 結果見圖3及表2。

圖3 45℃含不同摩爾百分比丹皮酚的脂質體的同步輻射寬角衍射曲線

丹皮酚摩爾百分比倒置間距(nm-1)尾鏈間距(nm)02．28180．438102．20230．454202．20230．454252．20230．454

由表2的數據可知，與空白脂質體相比，各含藥脂質體的磷脂分子尾鏈間距都有明顯增加，說明丹皮酚的包封可以增加處于液晶相的脂質體膜中磷脂分子尾鏈排列的無序度，磷脂分子尾鏈排列無序度的提高將使其流動性增加。

3 討論

在空白DPPC脂質體的DSC曲線上通常可以看到兩個吸熱峰，峰形平緩且峰面積較小的是預相變，反映了層狀凝膠相到波動凝膠相(Lβ′to Pβ′)的轉變，來源于磷脂分子中極性端的熱運動；峰形尖銳且峰面積較大的是主相變，反映了波動凝膠相到液晶相(Pβ′to Lα)的轉變，來源于磷脂分子中碳氫鏈的熔融[12]。DSC曲線的主相變溫度、相變焓、半峰寬的增減變化可以用于推測脂質體膜結構性質的改變及藥物在脂質體中的包封位置。

同步輻射寬角X光衍射實驗可以得到脂質體中磷脂分子疏水尾鏈之間的距離，而疏水尾鏈距離的增大可以表征磷脂分子尾鏈無序度的增大，從而反映脂質體膜流動性的增大。

3.1 丹皮酚對脂質體膜主相變的影響及藥物的包封位置

主相變來源于磷脂分子中碳氫鏈的熔融[12]，表1表明丹皮酚脂質體主相變溫度隨丹皮酚濃度的增大整體呈下降的趨勢，說明丹皮酚進入脂質體膜的疏水區。脂質體的DSC曲線是外源物質對磷脂影響的宏觀表現，Jain等研究了多種脂溶性添加物對DPPC脂質體的DSC曲線的影響，總結了根據加入添加物后脂質體主相變的DSC吸熱峰的變化來推測添加物在脂質體中包封位置的規律[8]：若半峰寬增大，峰尖移動，則添加物主要作用于DPPC分子的C1～C9位置；若峰形上出現小臺階，且小臺階下的面積隨添加物濃度的增加而增加(但總面積不變)，則添加物主要作用于DPPC分子的甘油骨架位置；若峰尖不發生移動，但峰的起始溫度和終止溫度發生變化，則添加物主要作用于DPPC分子的C10～C16位置；若加入添加物后DSC曲線出現新的峰，且新峰的面積隨添加物濃度的增加而增加，則添加物主要作用于DPPC分子的膽堿位置。在本實驗中，隨著脂質體中丹皮酚濃度增加，DSC曲線中主相變的峰形變寬，峰尖位置發生了移動，根據Jain探索的規律，丹皮酚應主要作用在DPPC尾鏈的C1～C9的位置，如圖4所示。

圖4 丹皮酚分子在脂質體疏水尾鏈中的包封位置示意圖

3.2 丹皮酚對膜流動性的影響與其抗氧化性的關聯

在脂質過氧化過程中，自由基氧化多不飽和脂肪酸為飽和脂肪酸，降低了細胞膜的流動性。Wassall等的研究表明，脂質過氧化作用更容易發生在流動性較低(有序度較大)的模型膜[13]。磷脂膜的流動性的增加將使之不易被氧化[14]。本實驗同步輻射寬角X光衍射結果表明丹皮酚的包封可以增加處于液晶相的脂質體膜中磷脂分子尾鏈的流動性，據此推測丹皮酚可能通過提高細胞膜的流動性發揮抗氧化作用。

包封率是脂質體制劑的關鍵指標之一。搞清楚藥物與脂質分子的相互作用機制及藥物在脂質體中的作用位置對于開發具有高包封率的脂質體意義重大。本研究對于進一步深入探索藥物在脂質體中與輔料分子的作用位點、對于設計具有高包封率的含藥脂質體具有重要的意義。

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EncapsulatingLocationofPaeonolinHydrophobicTailChainofLiposomesandItsEffectontheMembraneFluidity:StudywithDSCandSynchrotronWide-angleXRDMethods

WEI Tian-tian1, GUO Hao-yue2, ZHOU Hong-wei3, WU Rui-guang1*

(1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2.KeyLaboratoryofBio-organicPhosphorousChemistryandChemicalBiology(MinistryofEducation),TsinghuaUniversity,Beijing100084,China; 3.InstituteofBasicResearchinClinicalMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective: To study the encapsulating location of paeonol in hydrophobic tail chain of liposomes and its effect on membrane fluidity to disclose the mechanism of the antioxidant effect of paeonol. Methods: Liposomes were prepared by film dispersion method. Differential scanning calorimetry(DSC) was employed to investigate the effect of paeonol on the main transition of liposomes and to disclose the encapsulating location of paeonol in liposomes. Synchrotron wide-angle X-ray diffraction(XRD) technique was employed to investigate the effect of paeonol on the distance between hydrophobic tail chain and its effect on the membrane fluidity of liposomes existing as liquid-crystalline phase. Furthermore, the relationship between XRD results and the mechanism of the antioxidant effect of paeonol was investigated. Results: The DSC results showed that the temperature of main transition decreases and the half-height width of DSC peaks increased with increased concentration of paeonol. The wide-angle X-ray diffraction results showed that the distance between hydrophobic chains of phospholipid molecules of paeonol encapsulated liposomes was larger than that of blank liposome. Conclusion: The location site of paeonol at the tail chains of DPPC was C1～C9. The incorporation of paeonol into liposomes can increase the disorder of the tail chains of DPPC and improve the fluidity of the membrane, which may be one of the mechanisms of the antioxidant effect of paeonol.

DSC; Synchrotron wide-angle XRD; Paeonol; Liposomes; Encapsulating location; Membrane fluidity; Antioxidant effect

R28

A

1002-2406(2017)06-0001-04

國家自然科學基金項目(No.81773916)；北京市自然科學基金項目(No.7153171)；北京中醫藥大學基本科研業務費資助項目(No.2017-JYB-JS-155，2017-JYB-XS-093)

魏田田(1991-)，女，北京中醫藥大學2015級碩士研究生。

鄔瑞光*(1975-)，男，博士，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：中藥制劑新技術與新劑型。

2017-09-13

修回日期：2017-10-01