Box-Behnken設計-效應面法優化紫檀茋納米混懸劑處方

陳哲，路娟，彭紀銘，2，柴瑞平，趙穎，王曉靜，2，陳曦*

(1.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

質量工藝

Box-Behnken設計-效應面法優化紫檀茋納米混懸劑處方

陳哲1，路娟1，彭紀銘1，2，柴瑞平1，趙穎1，王曉靜1，2，陳曦1*

(1.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

目的：對紫檀茋納米混懸劑的處方及制備工藝進行優化。方法：采用反溶劑沉淀法制備紫檀茋納米混懸劑，以粒徑、多分散系數(PDI)作為評價指標，采用Box-Behnken效應面法優化紫檀茋納米混懸劑的處方，并對處方加以驗證。 結果：通過軟件對實驗數據進行模型擬合，用響應面法預測最佳處方,所得處方為：紫檀茋的濃度為36 g/L，pluronic F68濃度 為2.2 g/L,牛磺膽酸鈉的濃度為3.0 g/L。驗證實驗得到的紫檀茋納米混懸劑粒徑為(134.6±2.5)nm，PDI為(0.097±0.006)。體外溶出結果表明，紫檀茋的納米化促進了其溶出速度。掃描電鏡觀察紫檀茋原料藥及紫檀茋納米混懸劑形態，可見紫檀茋納米混懸劑呈類球狀，且分布均勻。結論：Box-Behnken效應面法能夠有效地優化紫檀茋納米混懸劑處方，方法具有可行性。

Box-Behnken；效應面法；紫檀茋；納米混懸劑

紫檀茋(Pterostilbene)是一種天然的非黃酮類多酚化合物，最早是在藍莓中發現的，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抗缺血再灌注損傷的作用[1-3]。紫檀茋與白藜蘆醇分子結構極其相似，互為同系衍生物，生物活性強于白藜蘆醇[1]。但紫檀茋為脂溶性化合物，其水溶性差這一問題限制了其在臨床上的應用。納米技術是藥物制劑領域一種比較成熟的技術[4],納米混懸劑是純的藥物納米粒子的膠態分散體系,該劑型不需要載體材料，通過表面活性劑穩定體系，使用簡單的工藝和處方改善難溶性藥物的生物利用度。Box-Behnken效應面法是一種優化試驗條件的數學統計方法，傳統的優化方法未考慮到試驗的隨機誤差，而此方法對試驗的隨機誤差也進行了考察。同時Box-Behnken效應面法建立了連續變量曲面模型，預測最佳方案，該方法科學合理，已被應用于各個領域[5-6]。本研究采用反溶劑沉淀法將紫檀茋制成納米混懸劑，通過Box-Behnken效應面法對處方進行優化預測最佳處方。

1 試藥和儀器

1.1 試藥

紫檀茋購于上海畢得醫藥科技有限公司(批號0149449-131218000)；pluronic F68(綠葉生物，批號H25J7C9432)；牛磺膽酸鈉(Beijing Biotopped Science & Technology，批號20160517)；無水乙醇(北京化工廠)；SDS(Japan，批號20140105506)；蒸餾水(屈臣氏)。

1.2 儀器

Nano-ZS納米粒度及zeta電位分析儀(英國Malvern儀器公司)；Waters UPLC H-Class系統(含四元溶劑泵，自動進樣裝置，在線真空脫氣裝置，PDA檢測器，Empower2色譜工作站)；JSM-6510掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；磁力攪拌器(Barnstead Thermolyne)；FJ300-SH型數顯高速分散均質機(上海標本模型廠)；FD-1-50冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 制備方法

精密稱定紫檀茋溶于5 ml無水乙醇，pluronic F68和牛磺膽酸鈉溶于50 ml蒸餾水中，在3 000 r/min攪拌下緩慢滴加紫檀茋乙醇溶液，使其均勻分散在水相中，攪拌除去乙醇，制備得紫檀茋粗混懸劑。將粗混懸劑置于0℃冰水浴中，高速均質，即得納米混懸液。

將得到的納米混懸液加入8%的甘露醇做凍干保護劑，溶解攪拌均勻，放入-80℃冰箱預凍24 h后，取出放置預冷0.5 h的冷凍干燥機中，凍干48 h，取出，即得納米混懸劑凍干粉。

2.2 單因素考察

2.2.1 均質剪切速度對粒徑的影響

按“2.1”項下制備方法制備紫檀茋粗混懸劑，所得粗混懸劑分別在5 000 r/min，8 000 r/min，10 000 r/min，15 000 r/min，18 000 r/min均質2 min，用Nano-ZS納米粒度及zeta電位分析儀測定平均粒徑。根據實驗結果顯示選用18 000 r/min的剪切速度制備納米混懸劑。結果見圖1。

圖1 均質速度對粒徑的影響(n=3)

2.2.2 均質時間對粒徑的影響

按“2.1”項下納米混懸劑制備方法制備粗混懸劑，分別于18 000 r/min下均質,在1 min，2 min，3 min，4 min，5 min取樣，用激光粒度分布儀測定平均粒徑。由表1所示，可見均質2 min較均質1 min所得的納米混懸劑粒徑有明顯減小，2 min后，納米混懸劑的粒徑變化較小，同時考慮到儀器使用注意事項要求實驗室均質機連續工作時間要小于等于5 min，故選用均質時間為2 min。

表1 均質時間對粒徑的影響(n=3)

2.2.3 乙醇用量對粒徑的影響

分別將紫檀茋溶于1 ml，5 ml，10 ml無水乙醇中按“2.1”項下納米混懸劑制備方法制備粗混懸劑，在18 000 r/min下均質2 min，得紫檀茋納米混懸劑，用激光粒度分布儀測定平均粒徑。由表2可知，乙醇用量越大，所得納米混懸劑的粒徑越小，綜合各因素折中后選擇5 ml無水乙醇溶解紫檀茋。

表2 乙醇用量對粒徑的影響(n=3)

2.3 Box-Behnken效應面法處方優化

在預實驗的基礎上,以紫檀茋的濃度(X1)，pluronic F68濃度(X2)和牛磺膽酸鈉的濃度(X3)為考察因素，以粒徑、多分散系數為評價指標。采用Box-Behnken效應面法對以上3個影響因素進行進一步優化，Box-Behnken實驗設計表及水平值見表3，實驗結果見表4。

表3 Box-Behnken實驗設計表及水平值

表4 Box-Behnken實驗設計表及響應值

2.4 二次回歸方程的建立

2.5 方差分析和顯著性差異

表5 回歸方程中系數的顯著性檢驗

2.6 效應面分析與優化

使用Design-Expert8.05b軟件，根據回歸方程結果，選擇X2設為中心點值，考察X1、X3對評價指標的影響，并做出曲面圖(圖2)。根據Box-Behnken響應面實驗設計結果，對評價指標進行適當范圍的限定，得到優化后的處方為X1=36 g/L，X2=2.2 g/L，X3=3.0 g/L。

圖2 各因素對響應值影響的三維效應曲面圖

2.7 驗證實驗

依據優化后處方制備3個平行紫檀茋納米混懸劑，測定PDI(R1)和粒徑(R2),結果見表6及圖3。

表6 紫檀茋納米混懸劑的實際值和預測值

圖3 紫檀茋納米混懸劑粒徑分布圖

2.8 HPLC 測定紫檀茋方法的建立

2.8.1 色譜條件

XSelect HSS T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相：乙腈-水梯度洗脫0～8 min，45%等度；8～9 min，45%～70%；9～15 min，70%乙腈等度；15～16 min，70%～45%乙腈；16～20 min，45%等度；流速:0.8 ml/min；檢測波長：306 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μl。

2.8.2 對照品溶液的制備

精密稱取紫檀茋對照品10.24 mg置于10 ml容量瓶中，甲醇溶解，定容至10 ml，混勻，即得紫檀茋對照品母液。

2.8.3 供試品溶液的制備

取紫檀茋納米混懸劑凍干粉用蒸餾水溶解，精密量取1 ml加入透析袋中，以1%SDS磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)500 ml作為溶出介質，轉速為100 rmp，溫度為37℃。在45 min取1 ml溶出介質過0.22 μm的微孔濾膜，取續濾液即得供試品溶液。

2.8.4 專屬性考察

按處方比例制備空白制劑，按供試品溶液制備方法制備空白溶液，取1 ml過0.22 μm的微孔濾膜，取續濾液進行高效液相色譜儀測定(色譜圖見圖4)。空白溶液與紫檀茋對照品未在同一保留時間出現色譜峰，可知空白輔料對紫檀茋的測定無干擾。

圖4 對照品(A)、空白對照(B)和供試品(C)HPLC色譜圖

2.8.5 線性關系考察

取“2.8.2”項下紫檀茋對照品母液，甲醇稀釋成0.17，0.25，0.51，1.02，2.56，5.12，10.24，15.36，20.48，25.60，35.84，46.08 μg/ml的系列濃度梯度的對照品溶液，按“2.8.1”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(Y)，紫檀茋的質量濃度為橫坐標(X)線性回歸，得回歸方程：Y=100 765X-41 146，r=0.999 6，結果表明紫檀茋在0.17～46.08 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.9 體外溶出測定

取紫檀茋納米混懸劑凍干粉、紫檀茋與輔料的物理混合物、紫檀茋原料藥適量用蒸餾水溶解(含紫檀茋約2 mg/ml)，精密量取1 ml加入透析袋中，以1%SDS磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)500 ml作為溶出介質，轉速為100 rmp，溫度為37℃。分別在5 min，10 min，15 min，30 min，45 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h取1 ml溶出介質，同時補加相同體積的新鮮的溶出介質。將取出的溶出介質過0.22 μm的微孔濾膜，采用高效液相儀測定紫檀茋的濃度，計算累計溶出率。溶出曲線見圖5。

圖5 紫檀茋納米混懸劑，紫檀茋原料藥和物理混合物溶出曲線圖

實驗結果顯示，納米混懸劑的在2 h時累計溶出率已達到68%，而物理混合物和原料藥均不到6%，8 h時納米混懸劑的累計溶出率達到平臺期。納米混懸劑粒徑較小，增大了藥物的表面積，故溶出速率得到較大提高，溶出速率的提高也有利于藥物在體內吸收，提高藥物的生物利用度。

2.10 物理穩定性考察

采用“2.1”項下制備工藝制備納米混懸液3個平行樣品，每個樣品分成兩份分別放置于室溫(25℃)和4℃保存7 d，觀察并測定納米混懸劑的粒徑變化，見表7。

表7 紫檀茋納米混懸劑物理穩定性考察表

結果顯示，納米混懸劑在4℃條件下較在室溫放置下粒徑變化較小，PDI值均有所增大，但依舊小于0.200，說明體系中的粒子有少量聚集現象。

2.11 形態觀察

2.11.1 紫檀茋原料藥形態觀察

稱取適量紫檀茋原料藥，用蒸餾水分散后，滴一滴溶液至硅片上，使其均勻平鋪，用濾紙吸取多余的液體，烘箱中30℃烘干后在掃面電鏡下觀察(圖6a)。

圖6 紫檀茋原料藥(a)和紫檀茋納米混懸劑(b)掃描電鏡圖

2.11.2 紫檀茋納米混懸劑形態觀察

取適量紫檀茋納米混懸劑，將其稀釋至適當濃度，滴一滴至硅片上，使其均勻平鋪，用濾紙吸取多余液體，在烘箱中30℃烘干后在掃描電鏡下觀察(圖6b)。

通過對比紫檀茋原料藥與紫檀茋納米混懸劑掃描電鏡圖看出，紫檀茋納米混懸劑呈類球狀粒子，表面較光滑，分布均勻，大小均一。

3 討論

目前，難溶性藥物的溶解度低的問題是藥物在臨床應用過程中的一個瓶頸，如何通過改良劑型提高難溶性的生物利用度是藥劑學研究的關鍵點所在。納米混懸劑是一種通過表面活性劑的穩定作用，將納米級的藥物顆粒均勻的分散在水中的穩定的膠態分散體系。由于其藥物顆粒粒徑小，且分布均勻大大增加了藥物的溶解度，解決了難溶性藥物在水中溶解度差的問題[7-9]。納米混懸劑的制備最重要的是表面活性劑的選擇和處方工藝的優化。

納米混懸劑提高生物利用度的方式主要是由于納米混懸劑粒子粒徑小，比表面積大，這些特點使其對胃腸黏膜有更高的黏附性，促使藥物在胃腸道中滯留時間增長，從而提高藥物的生物利用度。另外，納米混懸劑還可以通過改變粒子的粒徑大小或者對其表面進行修飾起到靶向作用，目前腦靶向和肺靶向的藥物已經比較成熟，達拉根納米混懸劑用吐溫-80和聚異丁基氰丙烯酸鹽進行表面修飾，實現了腦靶向，用PEG對藥物離子進行表面修飾后，可使在體內的循環時間延長，并在炎性部位富集[10]。

該實驗首先考察了均質剪切速度，剪切時間，以及乙醇用量單因素對納米混懸劑的粒徑和PDI的影響，結果為剪切速度為18 000 r/min，剪切時間為2 min，乙醇用量為5 ml。紫檀茋的濃度(X1)，pluronic F68濃度(X2)和牛磺膽酸鈉的濃度(X3)則采用Box-Behnken進行實驗設計，結果用Box-Behnken實驗軟件進行分析，該試驗方法與正交實驗相比，更加全面地對處方進行優化，同時其可預測未做過的實驗結果，這是Box-Behnken效應面法在藥劑學中廣泛應用的一個重要原因[11]。本實驗通過該方法篩選出最佳處方及工藝，并加以驗證，為進一步進行體內藥代動力學的研究提供了研究基礎。

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OptimizedtheFormulationofPterostilbeneNanosuspensionbyBox-BehnkenDesign-ResponseSurfaceMethodology

CHEN Zhe1, LU Juan1, PENG Ji-ming1,2, CHAI Rui-ping1, ZHAO Ying1, WANG Xiao-jing1,2, CHEN Xi1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100193,China;2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

Objective:To optimize the formulation and preparation technique of Pterostilbene nanosuspension. Methods:Pterostilbene nanosuspension was prepared by anti-solvent precipitation. Its formulation was testified and optimized by Box-Behnken design-response surface methodology, with average particle size and polydispersion index(PDI) as the indexes. Results:The model was fitted to the experimental data by software, and the best formulation was predicted by response surface method. The optimal formulation was as follows: the concentration of Pterostilbene, pluronic F68 and sodium cholytaurine were 36 g/L, 2.2 g/L, and 3.0 g/L respectively. The average particle size was(134.6±2.5)nm and PDI was(0.097±0.006). It showed that nanosuspension of Pterostilbene could improve its dissolution rate notably. Scanning electron microscope was used to observe the morphology of crude Pterostilbene and Pterostilbene nanosuspension, and Pterostilbene nanosuspension showed a near-spherical shape and evenly distributed. Conclusion:Box-Behnken design-response surface methodology can optimize the formulation of Pterostilbene nanosuspension effectively. The results proved the feasibility of this method.

Box-Behnken; Response surface methodology; Pterostilbene; Nanosuspension

R28

A

1002-2406(2017)06-0014-05

國家自然科學基金面上項目(No.81673667)；國家重大科技專項(No.2014ZX09201022-006)；云南省中青年學術帶頭人后備人才項目(No.2013HB099)；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程經費資助(No.2016-I2M-015)

陳哲(1991-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向：中藥藥理。

陳曦*(1973-)，男，副研究員，主要研究方向：中藥藥理與毒理。

2016-12-29

修回日期：2017-01-15