清瘟敗毒飲清熱瀉火組干預急性肺損傷的譜效關系研究

丁楠，高菁，陳丹陽，張旗，王晴，聶靜，陳素娟，韓晶晶，張艷秋，馮超，李強

(北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488)

清瘟敗毒飲清熱瀉火組干預急性肺損傷的譜效關系研究

丁楠，高菁，陳丹陽，張旗，王晴，聶靜，陳素娟，韓晶晶，張艷秋，馮超，李強*

(北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488)

目的：明確清熱瀉火組干預大鼠急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的功效成分。方法：通過拆方配伍分析及多指標平行比較，選出清熱瀉火組進行功效成分研究。運用偏最小二乘回歸法，將各提取物的HPLC圖譜信息與其對應的藥效學數據進行譜-效相關性分析，計算藥效貢獻率，篩選出貢獻最大的功效成分。結果：各組提取物對ALI大鼠均有一定的干預作用，以50%乙醇提取物對蛋白濃度和肺濕干比干預作用最強。譜-效分析西紅花苷-1藥效貢獻率最大。結論：西紅花苷-1可能是清瘟敗毒飲干預內毒素性ALI大鼠的功效成分。

清瘟敗毒飲；西紅花苷-1；急性肺損傷；譜效分析

中醫學認為，ALI辨證屬“溫熱癖毒”之證，應根據衛氣營血階段的不同進行治療，早期應運用清熱解毒方藥急挫熱勢[1-4]。研究表明，清瘟敗毒飲對LPS誘導的大鼠ALI有保護作用[5-8]，但中醫復方成分復雜且藥理作用具有多向性，究其干預ALI的藥效成分及作用機理尚不清楚。本課題組前期已對清瘟敗毒飲進行了拆方配伍分析，經多指標平行比較，本實驗選擇清瘟敗毒飲的“最佳”拆方組-清熱瀉火組，并運用偏最小二乘回歸分析法探究其液相圖譜與藥效之間的關系，以期篩選出清瘟敗毒飲干預ALI的功效成分。

1 材料

北京同仁堂藥店購買所需藥材，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定；梔子苷對照品(純度≥98%，批號110749-201316)、芒果苷對照品(純度≥98%，批號111607-201503)、蘆丁對照品(純度≥98%，批號100080-201409)和西紅花苷-1對照品(純度≥98%，批號111588-201303)(中國食品藥品檢定研究院)；大腸桿菌內毒素(L2880，Sigma)；牛血清白蛋白(A7030，PH-7，Sigma)；地塞米松注射液(批號1507111)；考馬斯亮藍G-250(北京拜爾迪生物科技有限公司)。

清潔級雄性SD大鼠，體質量約200 g，合格證號為11400700036742，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

MK3型酶標儀(賽默飛儀器有限公司)；Effendorf5810R離心機(德國)；血液分析儀；Bx40F4型光學顯微鏡(OLYMPUS，日本)；AxioCam ERC5s成像系統(德國蔡司數碼成像系統)；十萬分之一電子分析天平(CAP225D Sartorius)；Waters 2698 高效液相色譜儀，2998/2489檢測器。

流動相:乙腈和甲酸為色譜純(美國Thermo Fisher)、水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取物制備

清熱瀉火組(生石膏30 g、知母15 g、竹葉15 g、梔子12 g)2份，分別用10倍量水、10%、30%、50%、70%、90% 乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮依次得到6組提取物(b1組、b2組、b3組、b4組、b5組、b6組)，含生藥量約為0.72 g/ml。

2.2 HPLC圖譜建立

2.2.1 條件

色譜柱Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫25℃；流速0.8 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長246 nm；流動相A為0.1%甲酸水、B為乙腈，梯度洗脫: 0～5 min(5%～7% B),5～10 min(7%～7% B),10～20 min(7%～10.6% B), 20～36 min(10.6%～14.7% B), 36～43 min(14.7%～16% B),43～44 min(16%～20% B),44～79 min(20%～56% B),79～82 min(56%～60.6% B)。

2.2.2 供試品制備

精密量取各組提取物用不同濃度甲醇水稀釋12.5倍，超聲處理10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 對照品制備

分別精密稱取梔子苷、芒果苷、西紅花苷-1、蘆丁對照品適量，分別用甲醇溶解定容，并過0.22 μm 微孔濾膜，即得對照品溶液。

2.2.4 樣品測定

取各供試品10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄82 min色譜圖，見圖1，其中13、15、17和19號峰經標準品指認分別為梔子苷、芒果苷、蘆丁和西紅花苷-1，結果見圖2。

圖1 各組提取物的HPLC圖

圖2 提取物b4組的HPLC圖及對照品HPLC圖注:A.提取物b4組的HPLC圖;B.蘆丁對照品HPLC圖;C.芒果苷對照品HPLC圖;D.西紅花苷-1對照品HPLC圖;E.梔子苷對照品HPLC圖。

2.3 藥效實驗

2.3.1 造模

大鼠適應性飼養5天，隨機分9組：空白對照組(空白組)、模型組、地塞米松陽性組(陽性組)、給藥組(分別為b1組、b2組、b3組、b4組、b5組、b6組)，每組9只。給藥組：b1～b6組分別給予“2.1”項下提取的各組藥液，每日1次，每次10 ml/kg，共計5天。造模前1 h，給藥組再灌胃一次，陽性組注射地塞米松注射液2 mg/kg。

用水合氯醛(4 mg/kg)將大鼠麻醉，給藥組、陽性組、模型組氣管內滴注LPS(5 mg/kg)復制ALI模型, 空白組在相同條件下，氣管內滴注等體積的生理鹽水。造模12 h后，各組動物均取材。

2.3.2 指標檢測

各組按造模時間，腹主動脈取血處死，剪開頸、胸部皮膚，行氣管插管。右支氣管結扎，用磷酸鹽緩沖液(PBS)6 mL 分 3 次左肺充分灌洗，收集肺泡灌洗液(BALF)4.5 ml，離心(4℃,1 300 r,10 min)。取右肺上葉，計算濕干比(W/D)；取右肺下葉，蘇木精-伊紅(Hematoxylinand Eosin,HE)染色，光鏡下觀察病理組織，如圖3；考馬斯亮藍法測定BALF中蛋白含量，結果見表2。

抑制率(%)=(1-各給藥組/LPS組)×100%

與空白組相比，模型組中蛋白濃度及肺濕干比均顯著升高(P<0.01)，造模成功。與模型組相比，各給藥組及陽性組蛋白濃度及肺濕干比均明顯下降(P<0.05)，以b4組蛋白濃度及肺濕干比抑制率最高。

2.3.3 病理形態學變化

2.3.3.1 肺部形態

空白組大鼠肺臟呈粉紅色，表面光滑，體積正常，肺表面無暗紅色出血點。模型組大鼠肺臟體積明顯增大，伴暗紅色出血點。陽性組及給藥組大鼠肺臟體積增大情況及出血點情況較模型組均明顯減輕，顏色偏暗或接近粉紅色。

2.3.3.2 肺組織病理切片

空白組肺泡結構清晰，大小均勻，肺泡腔清晰，肺泡間隔正常，少量炎性細胞浸潤。模型組部分肺泡腔內炎性細胞浸潤，部分視野肺組織呈實變，肺泡間隔明顯增厚，肺間質充血、水腫，表現特征性病理現象。給藥組及陽性組LPS誘導的病理變化均有改善，說明該清熱瀉火組對LPS誘導的ALI有一定的干預作用，結果見圖3。

圖3 各組肺組織病理形態學觀察( HE染色，×100)注：A.空白組;B.模型組;C.b1組;D. b2組;E. b3組;F. b4組;G.b5組;H.b6組;I.陽性組。

2.4 統計學處理

2.5 譜效相關性分析

本實驗藥效數據和液相圖譜數據有著不同的度量標準，即量綱不同，所以采用標準差標準化，以消除變量量綱差異。經過標準化處理的特征圖譜中代表化學成分各峰的峰面積積分值為自變量，標準化處理后的藥效抑制率指標作為因變量，利用METALAB7.4.0統計軟件，運用偏最小二乘回歸法進行譜-效相關性分析，計算出各自變量對應因變量的回歸系數?；貧w系數代表各自變量對因變量的貢獻大小，以回歸系數進行建模，即得回歸方程。

以各提取物對蛋白的抑制率作為因變量得到回歸方程：

Y1=(-0.174 2)X1+(-0.108 1)X2+0.172 4X3+0.061 4X4+0.057 4X5+(-0.058 2)X6+0.064 1X7+0.158 8X8+0.057 9X9+0.210 7X10+0.004 2X11+(-0.243 2)X12+0.098 8X13+0.003 9X14+

(-0.013 9)X15+(-0.158 4)X16+(-0.145)X17+(-0.030 7)X18+0.209 1X19、+0.086 7X20+0.005 8X21

以各提取物對肺濕干比的抑制率作為因變量得到回歸方程：

Y2=(-0.148 5)X1+(-0.169)X2+0.094 4X3+(-0.11)X4+(-0.020 1)X5+(-0.325 2)X6+0.142 1X7+0.140 5X8+(-0.089 7)X9+0.144 4X10+0.142 1X11+(-0.156 1)X12+0.051 9X13+0.080 4X14+0.063 5X15+(-0.094 2)X16+(-0.178 9)X17+0.112 3X18+0.277 3X19+0.057 6X20+0.143 5X21

由上可知，回歸方程是系i×Xi之和組成，由此看出X對藥效Y 的貢獻率取決于系數和峰面積兩個因素，所以選取與Y 正相關(系數為正值) 的峰，并以所有(+)系i×Xi之和作為分母，以各個(+)系數i×Xi作為分子，得到自變量X 對藥效Y 的貢獻率。由藥效指標可看出b4組對蛋白濃度和肺濕干比干預作用最強，對其各組分進行貢獻率計算，結果見表3。

由貢獻率可知，組分3，8，10，13，19對Y1的累積貢獻率達71.34%，以組分10，19貢獻最大，分別為17.69%，17.55%；組分7，8，10，11，19，21對Y2的累積貢獻率達68.27%，以組分19貢獻最大達19.12%。由“2.2.4” 項下的結果可知，峰13，19分別為梔子苷和西紅花苷-1。結果提示，梔子苷和西紅花苷-1可能具有抗內毒素性急性肺損傷活性。

表1 各提取物HPLC色譜峰的峰面積

表2 BALF中蛋白濃度及肺濕干比

表3 各提取物中各組分的藥效貢獻率

3 討論

本實驗首先采用全波長掃描檢測，考察了238、246、258、300、440 nm 5個波長，發現246 nm下，樣品各色譜峰分離較好，峰相對較多且響應值較高，故以246 nm為各樣品的特征圖譜檢測波長。之后采用更為靈敏的雙波長檢測，分別對色譜柱、柱溫、流速、進樣量、流動相及洗脫條件進行了考察，并進行方法學考察，最終確定為“2.2.1”項下的色譜條件。

“清熱瀉火”組包括梔子、知母、石膏、竹葉4味藥，梔子為清熱瀉火要藥，且已有研究報道梔子苷對ALI具有干預作用[9]，但其余3味藥及其相關化學成分還未見有關ALI的報道。故本實驗通過多指標平行比較，選擇了在各指標下表現均良好的“清熱瀉火”組。

本實驗通過PLSR法，將復方干預大鼠ALI的藥效與其特征圖譜進行多元統計分析，獲得可實現“藥效還原”(與原中藥效果相當)的功效成分組，并量化各成分對藥效的貢獻大小。除此之外，還采用多指標平行比較，將不同指標的藥效與其特征圖譜進行多元統計分析，可實現針對不同指標的功效成分組。PLSR法在最終模型中包含了原有所有自變量，既使數據信息得到最大限度地應用，又實現了回歸建模(多元線性回歸)、數據結構簡化(主成分分析)以及兩組變量之間的相關性分析(典型相關分析)[10]。該方法不僅闡明了中藥可能的活性成分及各成分之間的協同、拮抗作用，通過藥效量化，還能直觀地反映出各活性成分與藥效的關系。

本研究結果顯示，“清熱瀉火”組不同提取物的藥效作用有所不同，以50%乙醇提取物對ALI大鼠蛋白濃度和肺濕干比干預作用最強。譜-效相關性分析結果顯示，“清熱瀉火”組中有15個成分與藥效正相關，初步證明這些成分對ALI起協同作用。分析各正相關成分貢獻率大小，可知西紅花苷-1對蛋白濃度以及肺濕干比抑制作用均較強；由HPLC圖譜信息可知，西紅花苷-1在50%乙醇提取物中峰的響應值也相對其他組較高。由此可推測，西紅花苷-1可能是清瘟敗毒飲干預內毒素性ALI大鼠的功效成分。目前，西紅花苷的藥效作用研究主要集中在抗腫瘤、抗心腦血管疾病方面[11-12]，對其抗急性肺損傷的藥理研究，值得進一步探究、開發。

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R285.5

A

1002-2406(2017)06-0023-04

“重大新藥創制”科技重大專項-雙黃連粉針劑技術改造(No.2011ZX09201-201-15)；北京中醫藥大學在讀研究生自主選題項目(No.2016-JYB-XS119)

丁楠(1993-)，女，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質基礎及功效成分組研究工作。

李強*(1972-)，男，研究員，碩士研究生導師，主要從事中藥藥效物質基礎及功效成分組研究工作。

2017-08-15

修回日期：2017-09-01