梔子苷對糖尿病模型大鼠認知功能障礙的改善作用研究Δ

陳曉燕，劉歡，房春娟，劉燕玲（江西科技學院護理學院，南昌330098）

梔子苷對糖尿病模型大鼠認知功能障礙的改善作用研究Δ

陳曉燕＊，劉歡，房春娟，劉燕玲（江西科技學院護理學院，南昌330098）

目的：研究梔子苷對糖尿病模型大鼠認知功能障礙的改善作用。方法：將50只大鼠隨機分為空白對照組（蒸餾水）、模型組（蒸餾水）和梔子苷低、中、高劑量組（5、10、20 g/kg），每組10只。除空白對照組外，其余4組大鼠均飼以高糖高脂飼料+注射鏈脲佐菌素復制糖尿病模型。成模后，各組大鼠ig相應藥物，每日1次，連續(xù)8周。末次給藥后檢測各組大鼠空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）水平，并檢測Morris水迷宮實驗的逃避潛伏期和Y迷宮實驗的行為正確率。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組大鼠FPG、HbA1c水平明顯升高，逃避潛伏期明顯延長，Y迷宮行為正確率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，梔子苷各劑量組大鼠上述指標均明顯改善（P＜0.05），且與劑量呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：梔子苷可有效降低糖尿病模型大鼠血糖水平，改善其認知功能障礙。

梔子苷；糖尿病；大鼠；認知功能障礙

長期高血糖狀態(tài)可損害患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成認知功能障礙。已有報道顯示，糖尿病患者發(fā)生癡呆的幾率明顯高于普通人群，甚至將阿爾茨海默病稱為“3型糖尿病”[1]。目前醫(yī)學界普遍認為糖尿病與認知功能障礙的關(guān)系在于：長期高血糖可對血管結(jié)構(gòu)與功能造成損害，并導致腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子水平與神經(jīng)遞質(zhì)水平降低、血脂代謝失調(diào)，引起阿爾茨海默病樣改變，在神經(jīng)細胞凋亡、氧化應激反應、炎癥反應等諸多因素共同作用下，造成認知功能障礙[2-3]。中醫(yī)學認為，糖尿病致認知功能障礙屬“消渴”范疇，并伴有“健忘”“呆病”，由先天虧損、氣血虧虛、氣陰兩虛引起腦絡(luò)阻滯、神經(jīng)營養(yǎng)不足所致[4]。現(xiàn)代藥學研究顯示，中藥及其提取物（如梔子、黃芪、紅景天苷、姜黃素等）均可治療該病，其中梔子味苦、性寒，歸心、肝、胃、三焦經(jīng)，其常見功效為清熱利濕、瀉火除煩、涼血解毒、消腫止痛。已有研究表明，梔子果實中主要的活性成分梔子苷具有降糖作用[5]，但其對糖尿病患者的認知功能障礙是否有影響尚不明確。本研究主要考察梔子苷對糖尿病模型大鼠認知功能障礙的改善作用。

1 材料

1.1 儀器

YD-588B便攜式電子血糖儀（廣州瑪奈特醫(yī)療器械有限公司）；5417離心機（德國Eppendorf公司）；Y迷宮與Morris水迷宮（中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供）。

1.2 藥品與試劑

梔子苷原料藥（上海紀寧實業(yè)有限公司，批號：110749-201611，白色粉末，規(guī)格：20 mg/包，經(jīng)高效液相色譜法測定其純度為97.122%，用藥時以純凈水配制）；鏈脲佐菌素（STZ）原料藥（美國Sigma公司，批號：20160618，純度：99.89%）；檸檬酸、檸檬酸鈉（常州市海拓實驗儀器有限公司，批號：20160729、20160802，均為分析純）；水合氯醛（江西德成制藥有限公司，批號：20160915，純度：≥99%）；血糖試劑盒（北京中生生物工程高技術(shù)公司）；糖化血紅蛋白（HbA1c）試劑盒（南京建成科技有限公司）。

1.3 動物

健康SPF級SD大鼠50只，♂，鼠齡6～8周，體質(zhì)量160～200 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2012-0001。大鼠購入后飼養(yǎng)于溫度為20～23℃、濕度為45%～60%的環(huán)境中，采用過氧乙酸對籠具進行消毒，每籠5只，自由飲食、飲水。動物房內(nèi)實施人工光照，采取12 h/12 h明暗周期。本實驗已通過本院動物研究委員會同意。

2 方法

2.1 緩沖液的制備

取檸檬酸2.101 g、檸檬酸鈉2.941 g，分別加入至100 mL蒸餾水中，制成檸檬酸溶液與檸檬酸鈉溶液；再按1∶1.32的比例混合檸檬酸溶液與檸檬酸鈉溶液，制成0.1 mol/L的緩沖液，pH為4.5。

2.2 分組與造模

將50只大鼠隨機分為空白對照組、模型組和梔子苷低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組外，其余4組大鼠均復制糖尿病模型：待大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，禁食14 h，飼養(yǎng)高糖高脂飼料（常規(guī)飼料66.5%、膽固醇2.5%、膽酸鹽1%、豬油10%、蔗糖20%），4周后，ip STZ 60 mg/kg；空白對照組大鼠喂養(yǎng)常規(guī)飼料，4周后，ip等量的緩沖液。每日給藥1次，連續(xù)給藥3 d。3 d后，取大鼠尾部血檢測血糖，若空腹血糖（FPG）＞7.7 mmol/L則視為造模成功[1]。

2.3 給藥

梔子苷低、中、高劑量組大鼠造模成功后分別ig給予5、10、20 g/kg的梔子苷溶液[6]。空白對照組與模型組大鼠均ig等體積的蒸餾水。每日給藥1次，連續(xù)給藥8周。

2.4 血糖相關(guān)指標檢測

末次給藥后各組取5只大鼠禁食、不禁水，于次日凌晨用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血。血樣低溫狀態(tài)下離心，分離血清，按試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠的FPG與HbA1c水平。

2.5 Morris水迷宮實驗

末次給藥后，將各組剩余5只大鼠實施水迷宮適應性訓練，每次120 s，每天1次，連續(xù)訓練5 d。120 s內(nèi)找到平臺的大鼠，找到平臺時自動停止記錄時間，讓大鼠停留在平臺上20 s；120 s內(nèi)仍未找到平臺的大鼠，將其置于平臺上停留20 s。完成適應性訓練后，正式進行Morris水迷宮實驗。水迷宮由黑色水池組成，呈圓柱形，直徑1.5 m，池內(nèi)放有直徑10 cm的可移動實心平臺。將清水注入水池內(nèi)，直至水面高出平臺2 cm，保持19～21℃的水溫。加入黑色墨水，達到白鼠與黑水形成對比的效果。實心平臺置入第一象限中間，在該象限的對側(cè)象限1/2弧度處將大鼠以背頭式的方式投入水內(nèi)。于水池上空放置監(jiān)控探頭，由計算機控制監(jiān)控系統(tǒng)。若大鼠爬至平臺上或達到預先設(shè)置的訓練時長，則計算機停止跟蹤，同時計算大鼠尋找平臺耗費的時間（即逃避潛伏期）；若最終大鼠仍未找到平臺，則視逃避潛伏期為60 s。

2.6 Y迷宮實驗

Y迷宮制作材質(zhì)為聚氯乙烯板，呈“Y”形，將黑色膠紙貼于迷宮內(nèi)外壁。迷宮包括3個臂，分別為Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)、Ⅲ區(qū)3個工作區(qū)，三臂相交區(qū)域為隔離區(qū)，各臂之間保持120°的夾角，臂尺寸：長30 cm、寬8 cm、高15 cm。實驗期間，隨機選定1個Y迷宮臂作為起始臂，整個過程中，采用黑色隔板將3個臂末端擋住，觀察大鼠在8 min內(nèi)進入各臂的情況。每次檢測均記錄大鼠3次進入工作區(qū)的情況，若連續(xù)3次均進入不同的工作區(qū)，則視為正確，記正確1次，否則視為錯誤。按公式計算各組大鼠Y迷宮實驗的行為正確率，行為正確率（%）＝正確次數(shù)/總檢測次數(shù)×100%。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 FPG和HbA1c水平

與空白對照組比較，模型組大鼠FPG、HbA1c水平均明顯升高（P＜0.05），提示糖尿病模型大鼠造模成功。與模型組比較，梔子苷各劑量組大鼠FPG、HbA1c水平均明顯降低（P＜0.05），提示梔子苷具有顯著的降糖作用。與梔子苷低、中劑量組比較，梔子苷高劑量組大鼠FPG、HbA1c水平均明顯降低（P＜0.05），表明高劑量梔子苷降糖作用更為明顯。各組大鼠FPG、HbA1c水平測定結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠FPG、HbA1c水平測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab1 Determination results of FPG，HbA1c levels of rats in each group（±s，n＝5）

表1 各組大鼠FPG、HbA1c水平測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab1 Determination results of FPG，HbA1c levels of rats in each group（±s，n＝5）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，ΔP＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，▲P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.geniposide low-dose group，ΔP＜0.05；vs.geniposide middledose group，▲P＜0.05

HbA1c，%3.47±0.76 7.65±1.95＊7.02±1.16#6.79±1.33#Δ 6.45±1.28#Δ▲236.770 0.000組別空白對照組模型組梔子苷低劑量組梔子苷中劑量組梔子苷高劑量組FP FPG，mmol/L 4.27±0.63 12.91±1.20＊9.68±0.66#8.22±0.41#7.83±0.26#Δ▲175.495 0.000

3.2 逃避潛伏期和行為正確率

與空白對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏明顯延長、行為正確率明顯降低（P＜0.05），表明糖尿病模型大鼠出現(xiàn)認知功能障礙。與模型組比較，梔子苷各劑量組大鼠逃避潛伏期均明顯縮短、行為正確率均明顯升高（P＜0.05），表明梔子苷可明顯改善糖尿病模型大鼠認知功能障礙。與梔子苷低、中劑量組比較，梔子苷高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短、行為正確率明顯升高（P＜0.05），表明高劑量梔子苷改善糖尿病模型大鼠認知功能障礙的效果更明顯。各組大鼠逃避潛伏期、行為正確率的測定結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期、行為正確率的測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab2 Determination results of escape latency period and correct rate of behaviors of rats in each group（±s，n＝5）

表2 各組大鼠逃避潛伏期、行為正確率的測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab2 Determination results of escape latency period and correct rate of behaviors of rats in each group（±s，n＝5）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與梔子苷低劑量組比較，ΔP＜0.05；與梔子苷中劑量組比較，▲P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.geniposide low-dose group，ΔP＜0.05；vs.geniposide middledose group，▲P＜0.05

70.36±12.33 51.20±4.75＊58.87±5.94#63.79±8.07#68.44±7.18#Δ▲6.961＜0.001空白對照組模型組梔子苷低劑量組梔子苷中劑量組梔子苷高劑量組FP 24.15±4.94 45.66±9.34＊38.05±7.26#32.23±5.45#26.34±4.59#Δ▲14.727＜0.001

4 討論

中醫(yī)最早以消渴描述糖尿病癥狀，根據(jù)其病機與主證的不同，謂之“消癉”“消渴”“鬲消”等。中醫(yī)醫(yī)學認為，陰虛燥熱、淤血阻絡(luò)為糖尿病及其并發(fā)癥主要的病理基礎(chǔ)，其本為陰虛、表為燥熱，兩者互為因果，陰虛可增加燥熱，燥熱亦可使陰虛加重[6-7]。糖尿病初期對人體無明顯危害，但隨著病情的發(fā)展，可導致腦血管、神經(jīng)等系統(tǒng)明顯損傷，誘發(fā)多種并發(fā)癥，其中認知功能障礙是重要的并發(fā)癥之一，嚴重影響患者生活質(zhì)量。

針對糖尿病認知功能障礙的治療首先應考慮降低、控制血糖水平，減輕高血糖給血管、神經(jīng)造成的損傷。中藥梔子始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，可清熱利濕、瀉火去煩、涼血解毒。《本草綱目》中關(guān)于梔子功效的描述為解消渴、通小便、利五淋。而消渴為現(xiàn)代醫(yī)學意義上的糖尿病，因而不少醫(yī)師對梔子的活性成分梔子苷在降血糖方面的作用予以高度重視[8-9]。本研究中，與模型組比較，梔子苷低、中、高劑量組大鼠FPG、HbA1c水平較模型組均明顯降低，其中高劑量組降低幅度最大，再次驗證了梔子苷具有明顯的降血糖作用。梔子苷的降糖機制主要體現(xiàn)在以下幾方面：（1）擬膽囊收縮素作用。膽囊收縮素是早期發(fā)現(xiàn)的一種胃腸道激素，主要起到收縮膽囊、促進膽汁與胰腺分泌的作用，餐后飽腹感正是由膽囊收縮素的作用所致。由于膽囊收縮素屬于八肽激素，其性質(zhì)不穩(wěn)定，因而無法直接作為藥用。而梔子注射劑與其他利膽中藥相比，攝食抑制作用更強，進而可有效調(diào)節(jié)血糖。另外，膽囊收縮素自身是胰島素分泌刺激劑，故推測梔子苷可能通過擬膽囊收縮素作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖作用[10]。（2）保護胰島β細胞。胰島β細胞功能衰退是引發(fā)糖尿病的主要原因，如四氧嘧啶模型即是通過破壞胰島β細胞而制成。急性胰腺炎發(fā)作時，胰島β細胞膜上Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著下降，機體代謝功能失調(diào)，胰島β細胞膜通透性顯著增加。梔子可有效維持正常的Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，保持胰島β細胞膜穩(wěn)定性。（3）激活胰高血糖素樣肽1（Glucagonlike peptidel，GLP-1）受體信號通路。梔子苷可激活GLP-1信號通路，進而增加胰島素的分泌。GLP-1的生理作用主要是增加葡萄糖依賴性胰島素分泌，抑制胰島血糖素，最終達到良好的降糖作用[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期明顯延長、Y迷宮行為正確率明顯降低；而給予梔子苷溶液后，其逃避潛伏期明顯縮短、行為正確率明顯升高，且與劑量呈正相關(guān)（P＜0.05）。Morris水迷宮與Y迷宮是糖尿病模型大鼠空間與學習記憶能力重要的檢測工具，定位航行實驗是最常用的檢測方式，充分利用大鼠畏水但天生會水的生理特性，迫使其找到并爬上水中的平臺，經(jīng)過一定訓練，幫助大鼠借助平臺周圍環(huán)境標志與平臺的關(guān)系尋找到平臺，進而于大腦內(nèi)形成相對穩(wěn)定的空間認知[12-13]。定位航行屬于操作式條件反射，形成空間參考記憶，其過程屬于程序性記憶，涉及海馬區(qū)、紋狀體、基底前腦等腦區(qū)。對于認知功能障礙患者而言，受損最早且相對突出的即為程序性記憶。本研究中，模型組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期明顯長于空白對照組，而梔子苷低、中、高劑量組大鼠的逃避潛伏期均明顯短于模型組，且高劑量組與空白對照組逃避潛伏期相近。這提示糖尿病可降低大鼠空間學習能力、損傷海馬區(qū)，而梔子苷有助于減輕血糖對海馬區(qū)的損傷程度、改善大鼠學習能力。Y迷宮主要檢測大鼠空間參考記憶與工作記憶的功能，涉及前額葉皮層[14]。Y迷宮可利用大鼠天然探索的習性與對新環(huán)境的好奇，具有簡單、實用的優(yōu)點。

綜上所述，中藥梔子苷在糖尿病大鼠中可發(fā)揮顯著的降糖功能，同時可有效改善大鼠認知功能，提示中藥梔子苷在糖尿病治療中應用價值顯著。

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Study on the Improvement Effect of Geniposide on Cognitive Dysfunction in Model Rats with Diabetes

CHEN Xiaoyan，LIU Huan，F(xiàn)ANG Chunjuan，LIU Yanling（School of Nursing，Jiangxi University of Technology，Nanchang 330098，China）

OBJECTIVE：To study the improvement effect of geniposide on cognitive dysfunction in model rats with diabetes.METHODS：50 rats were randomly divided into blank control group（distilled water），model group（distilled water）and geniposide low-dose，medium-dose，high-dose groups（5，10，20 g/kg），10 in each group.Except for blank control group，rats in other 4 groups were fed with high-sugar and high-fat diet and injected streptozotocin to induce diabetes model.After modeling，rats in eachgroup intragastrically administrated relevant medicines，once a day，for 8 weeks.After last administration，fasting blood glucose（FPG），glycosylated hemoglobin（HbA1c）levels，escape latency period in Morris water maze test，and correct rate of behaviors in Y maze test of rats in each group were detected.RESULTS：Compared with blank control group，F(xiàn)PG，HbA1c levels of rats in model group were obviously increased，escape latency period was obviously prolonged，correct rate of behaviors in Y maze test was obviously decreased，with statistical significances（P＜0.05）.Compared with model group，above-mentioned indexes in geniposide groups were obviously improved（P＜0.05），which were positively correlated with dose（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Geniposide can effectively reduce blood glucose level of model rats with diabetes and improve their cognitive dysfunction.

Geniposide；Diabetes；Rats；Cognitive dysfunction

R285；R781.6+4

A

1001-0408（2017）31-4365-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.12

江西省教育廳科學技術(shù)研究課題（No.GJJ161137）；江西科技學院自然科學研究項目（No.16ZRYB03）

＊講師，碩士。研究方向：中藥學。電話：0791-88136684。E-mail：cxydzy111@163.com

2017-05-03

2017-08-21）

（編輯：鄒麗娟）