植物乳桿菌YI-Y 2013凍干保護劑配方優化

樊振南 - 佟立濤 - 周素梅 - 易翠平 -

(1. 長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114；2. 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193) (1. School of Chemistry and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha, Hunan 410114, China; 2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

植物乳桿菌YI-Y 2013凍干保護劑配方優化

樊振南1FANZhen-nan1佟立濤2TONGLi-tao2周素梅2ZHOUSu-mei2易翠平1YICui-ping1

(1. 長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114；2. 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193) (1.SchoolofChemistryandBiologicalEngineering,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China; 2.InstituteofAgro-productsProcessingScienceandTechnology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

為制備鮮濕米粉發酵劑，以分離自米粉自然發酵液的植物乳桿菌YI-Y 2013的菌體存活率為目標，在單因素試驗基礎上，經過Plackett-Burman試驗篩選出有顯著效果的3種保護劑：山梨醇、麥芽糊精和甘油，進一步通過中心組合試驗設計和響應面分析得到顯著性的擬合回歸方程。結果表明，最佳保護劑配方為：山梨醇濃度1.1 g/100 g，麥芽糊精濃度24.8 g/100 g，甘油濃度2.4 g/100 g，該條件下菌體存活率為(76.08±2.68)%，與預測值較為接近。

植物乳桿菌YI-Y 2013；保護劑；存活率

直投式發酵劑是一種活菌含量高、應用簡單、可提升產品品質的發酵劑[1]。直投式發酵劑的常用干燥方法有噴霧干燥[2]、流化床干燥[3]、空氣對流干燥[4]和真空冷凍干燥[5]等，其中真空冷凍干燥是植物乳桿菌最常用的干燥方法。真空冷凍干燥具有適用范圍廣、存活率高、運輸方便等特點。但由于凍干過程中微生物體內的游離水會形成較大冰晶對微生物造成不可恢復的損傷，從而導致菌體死亡，因此通常需要添加合適的凍干保護劑來提高菌體的存活率[6-7]。植物乳桿菌種類繁多，在肉類[8]、奶類[9]、泡菜[10]及酸面團[11]等發酵食品中均有應用。隨著研究人員[12-13]對鮮濕米粉發酵過程的不斷研究，發現植物乳桿菌對鮮濕米粉的品質有重要的影響，但米粉直投式發酵劑的制備至今鮮見報道。由于植物乳桿菌來源不同，其形狀和結構都有差異，因此對植物乳桿菌凍干保護劑進行優化具有十分重要的意義。

本研究擬通過對比不同保護劑在植物乳桿菌凍干過程中的作用效果，并優化復合保護劑的配比，為鮮濕米粉直投式發酵劑的制備提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，L.plantarum) YI-Y 2013：由本實驗室從鮮濕米粉自然發酵液中采用純培養的方法劃線分離，并對其技術特征進行分析、基因測序鑒定后保存備用[14](原名稱為CSL 23)，現已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC M 2017533；

MRS肉湯和MRS培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；

山梨醇，葡萄糖、麥芽糖、海藻糖和甘油：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

麥芽糊精：山東西王食品有限公司。

1.2 主要儀器與設備

雙人單面凈化工作臺：SW-CT-2FD型，蘇州凈化設備有限公司；

離心機：TG16型，長沙東旺實驗儀器有限公司；

冷凍干燥機：FFD-1A型，北京醫博康實驗儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101-2A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：YXQ-LS-18SI型，上海博實業有限公司醫療設備廠；

恒溫水浴鍋：DJK-2000-L型，天津市泰斯特儀器有限公司；

恒溫振蕩培養箱：THTZ-C型，蘇州培英實驗設備責任有限公司；

電熱恒溫培養箱：DHH5000II型，天津市泰斯特儀器有限公司；

超低溫冰箱：MDF-382E型，日本三洋電器生物醫藥公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

活化菌種→純培養→液體培養→離心過濾收集菌泥→加入保護劑→分裝→預凍→真空冷凍干燥→凍干菌粉→活菌計數

1.3.2 操作要點

(1) 純培養：將活化好的菌種經過2次劃線培養，挑選出單個菌落作為液體培養菌種。

(2) 液體培養及收集菌泥：將菌種接種至含有MRS肉湯的三角瓶中，在37 ℃條件下，培養18 h后收集菌體；將菌液移入250 mL無菌帶蓋離心杯中，4 500 r/min離心25 min，棄上清液，用0.85 g/100 mL無菌生理鹽水洗滌沉淀菌體，4 500 r/min離心25 min，棄上清液即得菌泥。

(3) 保護劑處理及添加：將葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、麥芽糊精、海藻糖、甘油等保護劑配制成所需濃度后，進行滅菌處理(121 ℃，15 min)；混合保護劑以同樣的方式滅菌。將取1.0 g菌泥與5 mL 0.85 g/100 mL無菌生理鹽水混合制備成菌液(20 g/100 mL)，以菌懸液∶保護劑=1∶3比例混合均勻，制成細胞懸液。

(4) 冷凍干燥條件：在-68 ℃條件下冷凍3 h，取出后放入真空冷凍干燥機中，在壓力<25 Pa，-52 ℃的條件下干燥16 h，然后放置于4 ℃冰箱中保存備用。

(5) 活菌計數：將凍干粉從冰箱中取出，加入1 mL 0.85 g/100 mL 無菌生理鹽水混勻，使其與凍干前菌懸液的體積相等，放置在30 ℃水浴鍋中水浴10 min，備用。

1.3.3 菌體存活率的測定 參考GB 4789.2—2016方法稍作修改：采用MRS培養基進行平板計數，37 ℃條件下培養(48±2) h，測定凍干前后活菌總數，并按式(1)計算存活率。

預應力技術在橋梁公路作業中的應用，已有較長時間，但我國在這方面起步晚，技術發展仍有較大的進步空間，在實際操作施工過程中也沒有明確規范步驟，因此，施工要求標準較低，施工不嚴格，在通常情況下，很多施工單位采取的方法都是采用1.5級的油壓表作為施工計量工具，但是在實際施工過程中，由于施工技術人員的素質水平較低，沒有控制好張拉幅度，使最終得出的數值與實際需要的數值相差甚遠，而且由于張拉力在不同階段出現較大差異，因此導致混凝土環境整體下降，結構強度較低。所以，在張拉力控制方面，需要不斷明確操作規范，提高攻克技術難題的能力，不斷提升設備的質量。

(1)

式中：

c——菌體存活率，%；

A——1 mL菌懸液凍干后菌落總數，CFU；

B——1 mL菌懸液凍干前菌落總數，CFU。

1.4 試驗設計

1.4.1 單因素設計 以菌體存活率為評價指標，選取了葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、麥芽糊精、海藻糖、甘油作為保護劑[15-18]，并比較它們對植物乳桿菌YI-Y 2013在真空冷凍干燥過程中的保護效果。

(1) 甘油保護效果：甘油添加量為1，2，3，4，5 g/100 g，不添加其他保護劑，測定甘油對植物乳桿菌YI-Y 2013的保護效果。

(2) 麥芽糖保護效果：麥芽糖添加量為2，4，6，8，10 g/100 g，不添加其他保護劑，測定麥芽糖對植物乳桿菌YI-Y 2013的保護效果。

(4) 海藻糖保護效果：海藻糖添加量為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/100 g，不添加其他保護劑，測定海藻糖對植物乳桿菌YI-Y 2013的保護效果。

(5) 山梨醇保護效果：山梨醇添加量為1，2，3，4，5 g/100 g，不添加其他保護劑，測定山梨醇對植物乳桿菌YI-Y 2013的保護效果。

(6) 麥芽糊精保護效果：麥芽糊精添加量為10，15，20，25，30 g/100 g，不添加其他保護劑，測定麥芽糊精對植物乳桿菌YI-Y 2013的保護效果。

1.4.2 優化設計 以菌體存活率為評價指標，選定葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、麥芽糊精、海藻糖、甘油作為保護劑進行Plackett-Burman試驗設計和分析，從中篩選出3種保護效果較好的山梨醇、甘油和麥芽糊精為因素，并以菌體存活率為響應變量進行中心組合試驗及響應面分析。

1.5 數據處理

試驗設計、數據分析以及模型建立分別采用Excel 2003、Minitab 16和Design-Expert.V8.0.6軟件進行方差分析和模型分析。

2 結果與討論

2.1 單因素分析

2.1.1 甘油濃度的選擇 由圖1可知，在一定范圍內，隨著甘油濃度的增加，菌體存活率呈現上升趨勢，當甘油濃度為3 g/100 g時，存活率達到(29.21±2.64)%，之后菌體存活率無顯著變化(P<0.05)。因此，選擇甘油濃度為3 g/100 g進行后續試驗。這與許多研究結果基本一致，許女等[17]添加含0.5%甘油的復合保護劑，使得凍干后植物乳桿菌MA2的存活率達到61%；方義川等[1]添加含1%甘油、2.5%脫脂奶粉、2.5%葡萄糖、1%蔗糖和2.5% VC的混合保護劑，使得嗜酸乳桿菌的存活數達到1.27×1012CFU/g。甘油在乳酸菌凍干保護劑中較為常用，研究發現，甘油可以滲透到菌體內部，增強菌體與水的結合能力[19]，減少游離水含量，并增加溶液粘性，從而減緩晶核的生長，使形成的冰晶較細小，以達到保護菌體的目的[18]。但甘油濃度過高，會延長凍干時間，浪費能源[20]。

2.1.2 葡萄糖和麥芽糖濃度的選擇 由圖2可知，當麥芽糖的濃度低于6 g/100 g時，隨著濃度的增大菌體存活率呈上升趨勢，但高于6 g/100 g時，隨著濃度的繼續增大，菌體存活率無顯著變化(P<0.05)。因此，選擇麥芽糖濃度為6 g/100 g 進行后續試驗。隨著葡萄糖濃度不斷地增大菌體存活率呈上升趨勢，濃度高于8 g/100 g以后，存活率無顯著變化(P<0.05)，因而選擇葡萄糖濃度為8 g/100 g進行后續試驗。韓德權等[15]發現，葡萄糖添加量為10%時，植物乳桿菌凍干后存活率可以達到30%以上；Chen等[21]發現，麥芽糖添加量為3%時，嗜酸乳桿菌凍干后存活率為2.47%，而空白對照組約為0.8%。這些研究表明，葡萄糖和麥芽糖在菌種凍干過程中均有較好的保護效果。而麥芽糖保護效果優于葡萄糖，可能與凍干樣品玻璃化溫度有關[22]。

圖1 甘油濃度對菌體存活率的影響Figure 1 Effect of glycerol concentrationon the survival rate of L. plantarum YI-Y 2013

圖2 葡萄糖和麥芽糖濃度對菌體存活率的影響

Figure 2 Effect of glycerol and maltose concentrationon the survival rate ofL.plantarumYI-Y 2013

2.1.3 海藻糖和山梨醇濃度的選擇 由圖3可知，山梨醇質量濃度低于1.5 g/100 g時，菌體存活率不斷增加，當其濃度高于1.5 g/100 g時，菌體存活無顯著變化(P<0.05)。因此，山梨醇的濃度應取1.5 g/100 g最為合適。海藻糖的濃度低于2 g/100 g時，菌體存活率隨海藻糖濃度的增大而增大，高于2 g/100 g時，菌體存活率無顯著變化(P<0.05)。當海藻糖和山梨醇濃度均為在0.75 g/100 g時，菌體存活率一致。Nahr等[23]添加含20.5%海藻糖的復合保護劑，使得凍干后植物乳桿菌菌種存活量為1.93×109CFU/mL；Lee等[24]添加10%山梨醇和10%脫脂乳粉，使得植物乳桿菌JH 287凍干存活率達到86.37%。表明海藻糖和山梨醇作為植物乳桿菌的凍干保護劑有顯著的效果。研究表明，海藻糖具有多個羥基，能與菌體表面的自由基結合，避免菌體暴露在介質中，同時可與蛋白質形成氫鍵取代水[25]，穩定細胞膜和蛋白質結構[26];山梨醇具有多個羥基，在凍干過程中可與菌體蛋白質極性基團結合形成氫鍵[17]，穩定蛋白質的結構和功能。海藻糖與山梨醇的結構相似，但對此菌種的凍干保護效果有顯著差異(P<0.05)，可能與菌種自身的特點有關。

圖3 海藻糖和山梨醇濃度對菌體存活率的影響

Figure 3 Effect of trehalose and sorbitor concentration on the survival rate ofL.plantarumYI-Y 2013

2.1.4 麥芽糊精質量濃度的選擇 由圖4可知，當麥芽糊精濃度低于25 g/100 g時，隨著濃度的增加菌體存活率呈上升趨勢，當濃度>25 g/100 g時，菌體存活率無顯著變化(P<0.05)。趙靜等[18]研究顯示，添加脫脂乳粉15.0 g/L，蔗糖20.0 g/L，麥芽糊精25.0 g/L和甘油3.0 mL/L可以使高產γ-氨基丁酸植物乳桿菌存活率達到75.3%。麥芽糊精是大分子保護劑[17]，通過“包裹”的形式避免菌體暴露在介質中，維持菌體的穩定性[18]。

圖4 麥芽糊精濃度對菌體存活率的影響

Figure 4 Effect of maltodextrin concentrationon the survival rate ofL.plantarumYI-Y 2013

2.2 Plackett-Burman 設計及結果分析

選用N=12的Plackett-Burman試驗設計，試驗設計和結果見表1、2，試驗結果分析見表3。由表3可知，山梨醇、甘油、麥芽糊精和葡萄糖對菌體保護有促進作用，海藻糖和麥芽糖有抑制作用。根據回歸方程系數可知，與其他3種保護劑相比，葡萄糖的促進效果不顯著(P<005)。有研究[27]表明，在保護劑的選擇過程中大分子和小分子保護劑的配合使用可增強保護效果。因此，選擇山梨醇、麥芽糊精和甘油作為中心組合試驗的研究對象。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test design g/100 g

表2 Plackett-Burman 試驗設計及結果Table 2 Plackett-Burman test design and results

2.3 中心組合試驗及響應面分析

根據Plackett-Burman試驗結果選擇3種效果較好的保護劑進行中心組合試驗，因素水平及結果見表4、5。

以存活率(Y)為因變量，因素A、B、C為自變量的回歸方程為：

Y=7 832.5.14-2.83A+0.99B-1.05C-1.32AB+4.34BC-6.25A2-10.46B2-9.81C2。

(2)

表3 Plackett-Burman 試驗結果分析Table 3 Plackett-Burman test results analysis

表4 中心組合試驗因素及水平Table 4 Factors and levels of central composite experiment g/100 g

用F值檢驗評估方程，得到的概率水平在95%的條件下回歸方程有顯著性(P<0.05)。方程(2)的確定系數R2=0.964 7，說明96.47%的試驗數據可以用于方程解釋。圖5是響應面三維圖，證實了擬合面含有真實的最大值。通過軟件計算得到最優方案為：山梨醇濃度1.13 g/100 g、麥芽糊精濃度24.8 g/100 g、甘油濃度2.45 g/100 g，此時菌體存活率76.68%。為了檢驗預測值，取山梨醇濃度1.1 g/100 g，麥芽糊精濃度24.8 g/100 g，甘油濃度2.4 g/100 g，進行3次重復實驗，得到的平均菌體存活率(76.08±2.68)%，此時干粉中的菌體含量為8.6×1011CFU/g。基本上與數學模型得到的最大菌體存活率符合，說明響應面法優化得到的數學模型與試驗數據擬合較好。

Figure 5 Response surface plots of the effect of sorbitor, maltodextrin and glycerol on the survival rate ofL.plantarumYI-Y 2013

表5中心組合試驗設計及結果

Table 5 Central composite experimental design and result of the survival rate ofL.plantarumYI-Y 2013

序號ABC存活率/%1-1-1061.58±4.5421-1054.21±3.883-11065.26±2.87411052.63±4.745-10-160.00±4.50610-161.05±4.497-10159.47±3.35810155.79±5.0290-1-158.42±4.261001-152.63±3.74110-1148.42±4.361201160.76±3.411300075.89±5.831400074.58±4.711500073.12±5.581600076.68±6.091700075.42±3.79

3 結論

在單因素試驗確定各因素最適濃度的基礎上，經過Plackett-Burman試驗篩選出有顯著效果的3種保護劑：山梨醇、麥芽糊精和甘油，通過中心組合試驗設計和響應面分析擬合出一個三元二次方程，并得到最佳值。最佳保護劑配方為：山梨醇濃度1.1 g/100 g，麥芽糊精濃度24.8 g/100 g，甘油濃度2.4 g/100 g，此時菌體存活率為(76.08±2.68)%，干粉中菌體含量為8.6×1011CFU/g。雖然植物乳桿菌YI-Y 2013在該法中菌體存活率仍然低于報道[28]中植物乳桿菌NCU 116的(91.76±1.82)%，但相比不加保護劑時YI-Y 2013菌體存活率的9.48%已有極顯著提高(P<0.01)，可能除菌種之間的差異外，配方的優化還有進一步提升的空間。可為植物乳桿菌YI-Y 2013制備直投式發酵劑應用于鮮濕米粉的控制發酵提供理論依據。

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Optimizationoffreeze-dryingprotectantforLactobacillusplantarumYI-Y2013

In order to prepare fresh rice noodle through starter, the survival rate ofL.plantarumYI-Y 2013 isolated from natural fermentation liquid was used as target. 3 kinds of protective agent through single factor experiment and Plackett-Burman test were screened, i.e., sorbitol, maltodextrin and glycerin. Moreover, the response surface analysis and fit the regression equations were carried out, and the results indicated that the best protection formula was: sorbitol 1.1 g / 100 g, maltodextrin 24.8 g / 100 g, and glycerol 2.4 g / 100 g. The bacteria survival rate was found arriving to (76.08±2.68)%, close to the prediction model.

L.plantarumYI-Y 2013; protectant; survival rate

公益性行業(農業)科研專項經費(編號：201303070)；國家自然科學基金(編號：31771899)

樊振南，男，長沙理工大學在讀碩士研究生。

易翠平(1973—)，女，長沙理工大學教授，博士。

E-mail: yicp963@163.com

2017—03—07

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.027