鰱魚魚精蛋白超聲波輔助提取工藝優化及其抗菌活性研究

劉光憲 - 祝水蘭 - 何家林 - 周巾英 - 馮健雄 n-

(1. 江西省農業科學院，江西 南昌 330200；2. 江西師范大學，江西 南昌 330022) (1. Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang, Jiangxi 330200, China; 2. Jiangxi Normal University, Nanchang, Jiangxi 330022, China)

鰱魚魚精蛋白超聲波輔助提取工藝優化及其抗菌活性研究

劉光憲1,2LIUGuang-xian1,2祝水蘭1ZHUShui-lan1何家林1HEJia-lin1周巾英1ZHOUJin-ying1馮健雄1FENGJian-xiong1

(1. 江西省農業科學院，江西 南昌 330200；2. 江西師范大學，江西 南昌 330022) (1.JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang,Jiangxi330200,China; 2.JiangxiNormalUniversity,Nanchang,Jiangxi330022,China)

為了實現鰱魚加工副產物的高效綜合利用，以鰱魚精巢為原料，研究檸檬酸濃度、提取溫度、超聲功率、提取時間、固液比、提取次數對魚精蛋白得率的影響。在單因素試驗基礎上，通過正交試驗獲得最佳提取工藝為：檸檬酸濃度0.45 mol/L，溫度55 ℃，超聲時間20 min，超聲功率400 W，固液比1∶30 (g/mL)，提取3次。在最佳工藝條件下，魚精蛋白得率為3.25%；魚精粗蛋白經Sepharose Fast Flow離子交換層析分離得到4個組分，對4個組分進行抗菌性分析可知，除魚精蛋白的前體蛋白外，其他組分對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較好的抑制活性，其中組分II、III的抑菌活性較好。

鰱魚；超聲波輔助提取；魚精蛋白；離子交換純化；抑菌

魚精蛋白是一種魚類成熟精巢組織中的多聚陽離子肽，一般與核酸結合在一起，以核精蛋白的形式存在，分子量約為4.0～4.5 kDa[1-2]。研究[3-5]表明，魚精蛋白具廣譜抑菌性、抗凝血性、抑制II型糖尿病以及促進消化道脂肪的消化等功能。魚精蛋白的活性和魚類精巢組織成熟度有關，從前體蛋白到成熟的魚精蛋白，其抑菌性相應增加[6-7]。由于魚精蛋白具有較好的生物活性，其提取及加工利用備受關注。劉燕妮等[8]從蛙魚和鯉魚中提取魚精蛋白，研究顯示提取的魚精蛋白具有良好的抑菌活性；胡曉璐等[9]采用硫酸法從魷魚精巢中提取魚精蛋白，研究顯示魚精蛋白得率為3.42%。目前，魚精蛋白相關產品已被廣泛地作為天然防腐劑和藥物中間體應用于食品和藥品生產中，市場需求量大。

鰱魚是中國四大家魚之一，其肉質鮮嫩，蛋白質豐富，但由于刺多，肉質土腥味重，導致其不受市場歡迎，鮮銷量和價格均處于低水平，亟待進行精深加工以提高其附加值，近年來，魚鱗、魚皮、魚精巢等加工副產物的綜合高效利用已成為鰱魚加工升值的熱點研究課題。

超聲波具有頻率高、穿透能力強等特點，能產生空化效應和局部熱點效果，多用于物料中有效成分的提取，其中在蛋白質[10]、油脂[11]、多酚[12]、多糖[13]、色素[14]的提取中均有應用。魚精蛋白的提取方法主要是硫酸法[9]，而采用檸檬酸提取的研究較少。為了提高鰱魚加工副產物(精巢)綜合利用效益，本研究采用超聲波輔助檸檬酸法提取魚精蛋白，并對產物進行了分離純化及抗菌性研究，旨在為鰱魚精巢的加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮鰱魚精巢：購買自南昌市青山湖社區菜市場；

考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、CM Sepharose FF：生化級，北京索萊寶科技有限公司；

胰蛋白胨、牛肉膏、瓊脂等：生化級，北京奧博星生物技術公司；

檸檬酸、氯化鈉、無水乙醇等：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌：南昌大學生命科學學院微生物研究室；

牛津杯(內徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm)：上海精密儀器有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：T6 新世紀型，北京普析通用儀器有限責任公司；

電熱鼓風干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒儀器廠；

超聲波破碎儀：JY92-Ⅱ型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

循環水浴鍋：HH-50型，金壇市天竟實驗儀器廠；

自動液相色譜分離層析儀：MC99-3型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

分析天平：TP-214型，北京賽多利斯儀器系統有限公司；

高速臺式離心機：TGL-10C型，上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 魚精蛋白提取 以新鮮鰱魚精巢為原料，參照文獻[15]的提取方法修改如下：以0.15 mol/L NaCl 溶液提取、干燥得到的脫氧核糖核蛋白(DNP)為原料，研究不同檸檬酸濃度、提取溫度、提取時間、超聲波功率、固液比、提取次數對魚精蛋白得率的影響。其中超聲波提取采用6 mm探頭，脈沖工作3 s，間隙8 s，其間為減小超聲過程中產生的熱量對提取溫度的影響，采用對應提取溫度的循環水浴連接水浴控溫杯進行相對控溫。各組提取液離心取上清液，用3倍體積的無水乙醇沉淀，沉淀用丙酮洗滌2次，真空干燥得到魚精蛋白粗品。在單因素試驗基礎上，選取對得率影響較大的4個因素，開展3水平正交試驗確定最佳提取工藝。

1.2.2 魚精蛋白純化 根據文獻[16]的研究方法修改如下：將粗魚精蛋白使用Sepharose Fast Flow離子交換層析柱分離純化，以CM Sepharose FF作為柱填料，將樣品溶液以柱體積的10%上樣，并采用0～1 mol/L NaCl溶液作為洗脫溶劑，對蛋白進行梯度洗脫，洗脫流速為0.3 mL/min，洗脫液使用10 mL的試管接100管進行后續分析。

1.2.3 基本成分及得率測定

(1) 水分含量測定：按GB 5009.3—2016執行。

(2) 蛋白質含量測定：采用考馬斯亮藍法[17]。

(3) 核酸含量測定：采用定磷法。

(4) 脂肪含量測定：按GB 5009.6—2016執行。

(5) 灰分含量測定：按GB 5009.4—2016執行。

(6) 魚精蛋白得率按式(1)計算：

(1)

式中：

C——魚精蛋白得率，%；

m1——蛋白含量，g；

m2——鰱魚精巢總質量，g。

1.2.4 抗菌活性的測定 根據文獻[18]的方法修改如下：胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉15 g，并將pH調至中性，用去離子水定容至1 L，將配置好的培養基用牛皮紙封口，高溫滅菌，在超凈臺內倒入直徑為 90 mm的培養皿中，每板10 mL，待培養基凝固之后，用濃度為10-6CFU的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌各5 μL進行涂板，并使用刮板器將菌液涂抹均勻后，將培養皿劃線分為3個扇形區域，在每個區域中心放置牛津杯，并在每個牛津杯孔中加入20 μL經過純化后的魚精蛋白溶液(1 mg/mL)，以添加生理鹽水作為空白。在室溫下，待樣品完全擴散后，置于37 ℃恒溫箱中培養 72 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 成分分析

鰱魚精巢的基本成分見表1，其蛋白質含量為(11.89±0.42)%，占精巢干重的52.22%，蛋白質含量介于蛙魚、鯉魚之間[8]，鰱魚精巢脂肪和灰分含量少，由此可見其是一種優質的低脂高蛋白產品。

表1 鰱魚精巢基本成分Table 1 Basic composition analysis of silver carp spermary %

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 檸檬酸濃度對魚精蛋白得率的影響 由圖1可知，檸檬酸濃度在0.05～0.65 mol/L時，魚精蛋白的得率隨著檸檬酸濃度的增大先顯著升高后降低(P<0.05)，在0.45 mol/L時得率達到最高(3.22%)。

2.2.2 提取溫度對魚精蛋白得率的影響 由圖2可知，溫度對魚精蛋白得率的影響較大，魚精蛋白的得率隨提取溫度的升高顯著升高(P<0.05)，當溫度達到50 ℃時，魚精蛋白的得率為3.18%，當溫度繼續升高至55，60 ℃時，得率無顯著性變化(P>0.05)，且提取的魚精蛋白溶液顏色發黃，因此，選擇50 ℃較為合適。

不同字母表示在0.05水平差異顯著圖1 檸檬酸濃度對魚精蛋白得率的影響Figure 1 Effects of concentration of citric acid on the yield of protamine

不同字母表示在0.05水平差異顯著圖2 提取溫度對魚精蛋白得率的影響Figure 2 Effects of concentration of extraction temperature on the yield of protamine

2.2.3 超聲時間對魚精蛋白得率的影響 由圖3可知，超聲時間在10～60 min時，魚精蛋白的得率先升高后降低，在30 min時得率達到最高，隨后顯著降低(P<0.05)。

2.2.4 超聲功率對魚精蛋白得率的影響 由圖4可知，隨著超聲波功率增大，魚精蛋白的得率先顯著升高后降低(P<0.05)，在400 W時得率達3.22%。當超聲功率>400 W，超聲波產生的局部熱點可能導致蛋白質的碳化或水解，使其得率顯著降低(P<0.05)。因此，超聲波功率選擇400 W較為合適。

不同字母表示在0.05水平差異顯著圖3 超聲時間對魚精蛋白得率的影響Figure 3 Effects of ultrasonic time on the yield of protamine

不同字母表示在0.05水平差異顯著圖4 超聲功率對魚精蛋白得率的影響Figure 4 Effects of ultrasonic power on the yield of protamine

2.2.5 固液比對魚精蛋白得率的影響 由圖5可知，固液比在1∶10～1∶30 (g/mL)時，魚精蛋白的得率顯著增加(P<0.05)，固液比為1∶30 (g/mL)時，得率達到最大。固液比為1∶30 (g/mL)之后，得率無顯著性變化(P>0.05)，可能是底物濃度過大導致底物黏度增大而影響提取效率。

2.2.6 提取次數對魚精蛋白得率的影響 由圖6可知，隨著提取次數增加，魚精蛋白的提取得率增加，提取3次時，得率最大，提取次數超過3次，魚精蛋白的得率無顯著變化(P>0.05)。

2.3 正交試驗

綜合單因素試驗結果發現，檸檬酸濃度、提取溫度、超聲時間和超聲功率4個因素對魚精蛋白提取得率的影響較大，因此選擇這4個因素，進行3水平正交試驗。試驗因素水平取值見表2，正交試驗中每組開展3次平行試驗，得率取平均值，結果見表3。

不同字母表示在0.05水平差異顯著圖5 固液比對魚精蛋白得率的影響Figure 5 Effects of solid-liquid rate on the yield of protamine

不同字母表示在0.05水平差異顯著圖6 提取次數對魚精蛋白得率的影響Figure 6 Effects of extraction time on the yield of protamine

表2 L9(34)正交因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(34) orthogonal design

表3 魚精蛋白提取工藝的L9(34)正交試驗結果Table 3 L9(34) orthogonal design and result of the extraction of protamine

由表3可知，影響魚精蛋白得率的因素主次為：A>D>B>C，最優提取工藝組合為A2B3C1D2，恰為表3得分最高組。故魚精蛋白的最優提取工藝為檸檬酸濃度0.45 mol/L，提取溫度55 ℃，超聲時間20 min，超聲功率400 W，固液比1∶30 (g/mL)，提取3次。

2.4 魚精蛋白的純化及其抗菌活性研究

2.4.1 分離純化 魚精蛋白是一種堿性蛋白，因此選擇CM Sepharose FF為離子交換層析柱填料，提取得到的魚精蛋白經Sepharose Fast Flow離子交換層析柱分離純化后，得到4個主要組分(見圖7)。

由圖7可知，10～20管是用未含鹽的溶液洗脫，吸收峰較小，為沒有被填料吸附的前體蛋白；32～100管是用含有NaCl 0.3～1.0 mol/L的緩沖液進行線性洗脫，有I、II、III 3個峰出現，分別收集、透析脫鹽、減壓濃縮后進行抗菌試驗。

2.4.2 抑菌活性研究 對分離得到的4個組分進行抑菌研究，抑菌圈研究結果見圖8和表4。結果表明，當蛋白質濃度為1 mg/mL時，在pH為7的中性環境下，除前體蛋白外，魚精蛋白各組分對沙門氏菌(圖8A和B)、金黃色葡萄球菌(圖8C和D)和大腸桿菌(圖8E和F)均具有抑制活性，其中組分II和組分III的抑菌活性較好。

圖7 魚精蛋白離子交換層析圖譜Figure 7 Analysis atlas of protamine treated by ion-exchange chromatography

圖8 魚精蛋白各組分對沙門氏菌、金黃色球菌和 大腸桿菌的抑制

Figure 8 Inhibitory effect of protamine components onsalmonella,staphylococcusaureusandescherichiacoli

表4魚精蛋白各組分對沙門氏菌、金黃色球菌和大腸桿菌的抑制效果

Table 4 Inhibitory effect of protamine components onSalmonella,StaphylococcusaureusandEscherichiacolicm

由表4可知，組分II的抑菌效果明顯要強于組分I和組分III，組分III的抑制效果要好于組分I。

3 結論

超聲波輔助檸檬酸法提取魚精蛋白的最佳提取工藝為：檸檬酸濃度0.45 mol/L，提取溫度55 ℃，超聲時間20 min，超聲功率400 W，固液比1∶30 (g/mL)，提取3次，在此工藝條件下提取魚精蛋白得率可達到3.25%；對提取之后的粗魚精蛋白進行分離純化獲得4個組分，除前體蛋白外，其他3個組分對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制活性，其中組分II 和組分III的抑菌活性較好。為了揭示不同種類魚的魚精蛋白活性差異，今后可開展鰱魚魚精蛋白與其他魚類魚精蛋白的活性比較研究。

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Optimizationofextractionprocessassistedbyultrasonicandantibacterialactivityevaluationontheprotaminefromsilvercarp

To realize the high comprehensive utilization on the byproduct of silver carp, taking the testis sacs of silver carp as the raw material, the effects were studied, including the concentration of citric acid, the temperature, ultrasonic power, ultrasonic time, solid-liquid rate and extraction times on the efficacy extraction of silver carp spermary. On the base of single-factor experiments, and through the orthogonal test, the optimization experiment conditions were as followed: concentration of citric acid 0.45 mol/L, extraction temperature 55 ℃, the ultrasonic time 20 min , ultrasonic power 400 W, ratio of solid-liquid 1∶30, and the extraction times 3 times. The extraction ratio of chub protamine was 3.25% at the optimized conditions. Four groups chub protamine were purified and separated through sepharose fast flow ion-exchanged chromatography. By studying the antibacterial activities of the four group, excepting the precursor protein, the other groups had a good inhibition on thesalmonella,staphylococcusaureusandescherichiacoli, especially the group II and III.

silver carp; ultrasonic assisted extraction; protamine; ion-exchange chromatography; anti-bacteria

江西省農業科學院青年基金(編號：2015CQN002)；江西省科技計劃(編號：20161BBF60134)

劉光憲，男，江西省農業科學院助理研究員，江西師范大學在讀博士研究生。

馮健雄(1963—)，男，江西省農業科學院研究員，學士。

E-mail: fjx630320@163.com

2017—04—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.032