異常黑膽質成熟劑對異常黑膽質型肝癌病證模型大鼠Id4和p21 mRNA表達水平的影響

祖力皮喀爾·阿卜杜熱合曼　王延蛟+++娜孜拉木·玉蘇甫江　古麗尼格爾·雪合拉提　斯坎德爾·白克力

[摘要] 目的 探討維藥異常黑膽質成熟劑在異常黑膽質型肝癌病證大鼠模型中的抗肝癌作用。 方法 90只清潔級雄性Wistar大鼠按隨機數字表法分成正常組、對照肝癌組、異黑肝癌組和成熟劑高、中、低劑量組6組，每組各15只。正常組正常飼養，對照肝癌組正常飼養21 d后給予二乙基亞硝胺（DEN）20周誘導肝癌。異黑肝癌組和成熟劑高、中、低劑量組大鼠通過干寒屬性飼料、干寒氣候環境、足底電刺激，夾尾以及強迫游泳等多因素復合作用21 d建立異常黑膽質證載體動物模型，再加用DEN20周誘導建立異常黑膽質型肝癌病證模型；DEN誘導的同時，成熟劑高、中、低劑量組用異常黑膽質成熟劑按高、中、低（6.0、3.0、1.5 g/kg）劑量進行干預。提取肝組織中mRNA，利用基因芯片技術篩選出的大鼠肝臟差異表達的Id4和p21候選基因并用RT-qPCR法驗證。 結果 與正常組比較，對照肝癌組肝組織Id4基因表達下調（P < 0.01）；與對照肝癌組比較，異黑肝癌組肝組織Id4基因表達下調（P < 0.01）；與異黑肝癌組相比，成熟劑高、中、低劑量肝組織Id4基因表達均上調，其中成熟劑高、中劑量組升高顯著（P < 0.01）。與正常組相比，對照肝癌組肝組織p21基因表達上調（P < 0.01）；與對照肝癌組比較，異黑肝癌組肝組織p21基因表達上調（P < 0.05）；與異黑肝癌組相比，成熟劑高、中、低劑量肝組織p21基因表達均下調，其中成熟劑中、低劑量組下降明顯（P < 0.01）。 結論 異常黑膽質成熟劑可影響異常黑膽質型肝癌病證模型大鼠肝臟Id4和p21基因的mRNA表達水平。

[關鍵詞] 異常黑膽質型肝癌；異常黑膽質成熟劑；Id4；p21

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（c）-0009-05

The influence of Abnormal Savda Munziq on mRNA expressions of Id4 and p21 genes in abnormal savda hepatocellular carcinoma rat models

Zulipikaer·Abudureheman WANG Yanjiao Nazilamu·Yusufujiang Gulinigeer·Xuehelati Sikandeer·Baikeli

Department of Molecular Biology， Basic Medical College， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] Objective To investigate the anticancer role of Uyghur medicine Abnormal Savda Munziq （ASM） in abnormal savda hepatocellular carcinoma rat models. Methods 90 male Wistar rats were divided into 6 groups， including normal group， control hepatic carcinoma group， abnormal savda hepatocellular carcinoma group and ASM high， middle and low dosage group by random number table， with 15 cases in each group. The normal group rats were placed in normative feeding environment. After 21 days of feeding in laboratory environment， the control hepatic carcinoma group rats were induced by diethylnitrosamine （DEN） 20 weeks to establish the liver cancer rat model. The rats in the abnormal savda hepatocellular carcinoma group， ASM high， middle and low dosage group were established abnormal black bile models， through dry cold property feed， dry cold climate environment， plantar electrical stimulation， tail and forced swimming， etc； after 21 days they were induced by DEN for 20 weeks to establish the abnormal savda hepatocellular carcinoma models. At the same time， the rats in the ASM high， middle and low dosage group were intervened by 6.0， 3.0， 1.5 g/kg of ASM. The mRNA was extracted from liver tissue and Id4， p21 gene were verified by RT-qPCR after screened by gene chip technology. Results The Id4 gene expression in liver tissue was down-regulated in control hepatic carcinoma group ，compared with the normal control group （P < 0.01）. The Id4 gene expression in liver tissue was down-regulated in abnormal savda syndromeliver cancer group， compared with the control hepatic carcinoma group （P < 0.01）. Compared with the abnormal savda hepatocellular carcinoma group， the expression of Id4 gene in liver tissue was up-regulated all in ASM high， middle and low dosage group， the high and middle dosage groups were obviously up-regulated （P < 0.01）. Compared with the normal group， the liver tissue p21 gene expression was up-regulated in control hepatic carcinoma group （P < 0.01）. The p21 gene expression in liver tissue wasup-regulated in abnormal savda syndromeliver cancer group， compared with the control hepatic carcinoma group （P < 0.05）. Compared with the abnormal savda hepatocellular carcinoma group， the expressions of p21 gene were down-regulated all in ASM high， middle and low dosage group， the middle and low dosages group were dramatic decline （P < 0.01）. Conclusion The ASM could have an impact on mRNA expressions of Id4 and p21 gene in abnormal savda hepatocellular carcinoma rat models.endprint

[Key words] Abnormal savda hepatocellular carcinoma； Abnormal Savda Munziq； Id4； p21

肝癌是危害人類健康的惡性腫瘤，在各類惡性腫瘤的發病率與死亡率中分別排在第四與第二位，我國肝癌的發病率和死亡率在全球處于高水平[1]。維吾爾醫學是中華傳統醫學的重要組成部分，具有豐富的臨床實踐和傳統的理論體系，是傳統維醫藥學理論的核心。在維吾爾醫學臨床治療方劑中，異常黑膽質成熟劑經常用于治療和預防異常黑膽質型腫瘤、哮喘等疑難性復雜疾病，但其分子機制尚未清楚[2]。本研究在前期建立的異常黑膽質型肝癌病證動物模型[3-4]的基礎上，通過基因芯片技術篩選出差異表達的DNA結合抑制因子4（inhibitor of DNA binding 4，Id4）和細胞周期依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，p21）等候選基因，通過RT-qPCR法進行驗證，對維藥異常黑膽質成熟劑的抗肝癌作用進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物

選取清潔級雄性90只Wistar大鼠（提供單位：新疆醫科大學動物實驗中心），體質量為130～160 g，動物合格證號：65000700000538。

1.2 主要試劑與儀器

小鼠跳臺儀（型號：JXDT-1，上海精宏實驗設備有限公司）、人工氣候箱（RQH-350型，上海精宏實驗設備有限公司）、電子天平（BS-110型，北京賽多科斯天平有限公司）、光學顯微鏡（Leica Microsystems，DMI 6000B）、RT-PCR儀（BIO-RAD，MyCyclerTM Thermal Cycler，580BR）、RT-qPCR儀（BIO-RAD，iCyclerTM Thermal Cycler，582BR）、異常黑膽質成熟劑（批號：121011，提供單位：疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院）、cDNA合成試劑盒（產品號：#K1622，Thermo Scientific，）、RT-qPCR熒光定量試劑盒（產品號：#RR820A，TAKARA Bio）、二乙基亞硝胺（DEN）（Sigma公司產品）。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物 異常黑膽質成熟劑由甘草、黑種草子、蜀葵子、芹菜根、菊苣根、駱駝蓬子、茴芹果、羅勒子、茴香根皮、菊苣子、香青蘭子、香茅和洋甘菊等十幾種天然草藥組成，根據國家發明專利《能夠使異常黑膽質型體液成熟和清除的藥物及其制備方法》[5]（專利號：ZL02130082.8），用旋轉蒸發儀濃縮成膏稠狀之后，60℃真空干燥備用，每克藥粉含3.4 g生藥，使用時用雙蒸水充分溶解使用。

1.3.2 動物分組 選取清潔級雄性Wistar大鼠90只室溫（25±3）℃環境下穩定飼養3 d，隨機分成實驗組（60只）和對照組（30只）。實驗組大鼠按隨機數字表法分為異常黑膽質型肝癌病證模型組（異黑肝癌組）和異常黑膽質型肝癌病證3個不同劑量異常黑膽質成熟劑給藥組（成熟劑高、中和低劑量組），每組各15只。根據相關文獻[3-4]，實驗組通過基礎飼料、芫荽子和大麥以7∶1.5∶1.5的比例混合，制成干寒屬性飼料，把動物置于干寒氣候環境[溫度（6±1）℃，相對濕度30%，6 h/d]，間斷電刺激大鼠足底（第1周刺激電壓是25 V，每次20 min，1次/d；第2周的刺激電壓是30 V，每次25 min，1次/d；第3周刺激電壓是35 V，每次30 min，1次/d），短暫夾住大鼠尾部尖端1cm處（3～5次/個，1次/d），強迫游泳[每次5 min，1次/d，水溫（25±3）℃]等多種復合因素作用下21 d建立異常黑膽質證載體大鼠模型。隨后每天用滅菌水配制濃度為0.1 mg/mL的DEN溶液，自由飲用直到20周。給予DEN誘導的同時，成熟劑高、中、低劑量組每天對大鼠灌胃成熟劑高、中和低劑量的異常黑膽質成熟劑，相當于臨床應用的等效劑量（6.0、3.0和1.5 g/kg）。并且給實驗組大鼠持續進行異常黑膽質證造模多種復合因素，直到實驗結束。對照組按隨機數字表法分成對照肝癌組和正常對照組（正常組）。正常組大鼠在正常飼養環境下[室溫（25±3）℃]，用普通飼料飼養，飲食和飲水不受限制，也不受任何刺激。21 d時，對照肝癌組僅把飲用水改為用滅菌水配制的0.1 mg/mL的DEN溶液，自由飲用。20周時處死動物，肝組織-80℃冰箱保存備用。

1.3.3 樣品處理 第20周時處死大鼠切出肝臟組織，切成若小塊，用10%的甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察。

1.3.4 基因芯片分析 基因芯片委托北京博奧生物技術有限公司完成。

1.3.5 RT-PCR 大鼠肝臟利用Trizol法進行總RNA抽提，逆轉錄合成cDNA ；委托上海生工生物工程技術服務有限公司北京分公司合成Id4和p21基因引物。GAPDH，F：5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGT-3′，R：5′-TGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′；Id4，F：5′-AA？鄄AGCCACCAGAGGAAAGGAA-3′，R：5′-CATGTAACA？鄄CAACGTCGCCAA-3′；p21，F：5′-CGAGAACGGTGGAACTTTGA-3′，R：5′-GAAATCTGTTAGGCTGGTCTGC-3′。

采用SYBR Green I*嵌合熒光試劑盒進行 RT- PCR實驗。反應條件：預變性：95℃ 30 s，1個循環；擴增：95℃ 5 s，TM（Id4：57℃；p21：59.2℃）30 s，72℃ 1 min，40個循環；溶解曲線：55～95℃ 1個循環/0.5℃。RT-qPCR結果以2-ΔΔct法進行計算。endprint

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織學觀察結果

除了正常組，實驗后期其余各組動物均因為肝癌出現不同數量的死亡情況，對照肝癌組死亡率為40%（6/15），異黑肝癌組為40.0%（6/15），成熟劑高劑量組為13.3%（2/15），中劑量組為0%（15/15），低劑量組為26.7%（4/15）。

肝臟大體觀察結果發現，正常組動物肝組織柔軟，紅潤，表面光滑。對照肝癌組瘤結節大小及分散不均，灰白色質較軟，突出明顯，與周圍組織界限清楚。異黑肝癌組肝臟高度水腫，瘤結節呈球狀嚴重，大小不均，分散于肝臟各處，瘤結節向表面隆起明顯，黃疸較多，肝臟腫大及表面凹凸不平。成熟劑高劑量組和中劑量組動物肝臟表面較為平整，水腫程度有所緩解，少有結節；與上述兩個劑量組相比，成熟劑低劑量組動物肝臟瘤結節相對較多及大小不均，肝臟水腫程度較明顯，肝組織表面凹凸較明顯。見圖1，封三。

2.2 肝臟病理觀察結果

正常組大鼠肝組織細胞結構完善，清晰，肝小葉結構正常，肝細胞排列規則，呈索狀，肝細胞呈多邊形，胞漿均勻，細胞核形態正常，無異常變化。對照肝癌組肝細胞成團塊狀或排列成條索狀，細胞不典型增生明顯，并向周圍正常肝細胞浸潤生長。異黑肝癌組肝細胞異型性明顯，胞核增大，胞質少，可見較多畸形的單核和多核瘤巨細胞。成熟劑高、中、低劑量組肝臟部分肝細胞異常改變，核大，顏色深，癌變程度有所緩解，其中高劑量組與正常組較為接近。見圖2，封三。

2.3 基因芯片結果

通過MAS系統軟件分析選出差異表達2倍以上的候選基因，用TreeView軟件制作聚類分析圖。紅色為表達上調的基因，綠色為表達下調的基因。橫列：不同肝組織標本；縱排：差異表達基因（圖3，封四）。根據SAM軟件分析所得數據，選擇了成熟劑高、中、低劑量組與異黑肝癌組均有差異表達的候選基因Id4和p21。

2.4 RT-qPCR結果

與正常組比較，對照肝癌組肝組織Id4基因表達下調（P < 0.01）；與對照肝癌組比較，異黑肝癌組肝組織Id4基因表達下調（P < 0.01）；與異黑肝癌組比較，成熟劑高、中、低劑量組肝組織Id4基因表達均上調，其中成熟劑高、中劑量組差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與正常組相比，對照肝癌組肝組織p21基因表達水平上調（P < 0.01），異黑肝癌組與對照肝癌組相比p21基因表達水平上調（P < 0.05），成熟劑高、中、低劑量組與異黑肝癌組相比均下調表達，其中成熟劑中、低劑量組差異有高度統計學意義（P < 0.01）。

3 討論

本研究通過檢測異常黑膽質型肝癌病證大鼠肝組織中差異表達候選基因Id4、p21的mRNA表達水平，探討異常黑膽質成熟劑對異常黑膽質型肝癌大鼠模型中Id4、p21基因表達的影響。結果發現，與正常組相比，對照肝癌組Id4基因mRNA表達水平下調，p21基因mRNA表達水平上調（P < 0.01）。Id4是螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉錄因子家族成員[6]，通過與bHLH蛋白形成異二聚體，導致bHLH蛋白結構發生變化并抑制其與DNA結合，從而抑制轉錄調控，是轉錄因子bHLH的負調控因子[7]。此外，Id4調控p53、p21等轉錄因子和細胞周期相關基因[8-9]和轉化生長因子（TGF-β1）等細胞生長因子[10]，參與細胞周期調控、誘導細胞凋亡，促進細胞增殖、腫瘤形成以及腫瘤血管形成等過程[11]。因此，Id4基因既可作為抑癌基因，也可作為癌基因，與腫瘤的發生和發展關系密切而復雜。有報道稱，由于啟動子甲基化導致表達沉默、缺失及失活，在淋巴瘤[12]、骨髓增生綜合征[13]、乳腺癌[14]、前列腺癌[15]等若干種人類腫瘤中起抑癌基因的作用。也有報道稱Id4基因在肺癌[16]、肝細胞癌[17]等腫瘤組織中因促進細胞增殖起促癌基因作用。本實驗結果顯示，對照肝癌組Id4基因的mRNA表達水平下調，因此認為Id4基因可能在此動物模型肝組織中起抑癌基因的作用，這與文獻[17]描述的Id4基因功能不一致，但與部分文獻結果一致[14-15]，可能是因為Id4基因在不同物種或不同腫瘤組織中的表達有所不同，Id4基因在肝癌中的作用需進一步研究。

在細胞周期G1期過渡到S期過程中，p21能與細胞周期依賴性激酶結合并抑制其活性，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡，與細胞周期關系密切[18]。研究者發現DNA損傷信號是p53、p21基因轉錄激活的重要原因之一[19]。通過DNA損傷應激活化的細胞周期檢查點機制，延遲或阻斷細胞周期進程，損傷無法修復時則誘導細胞凋亡[20]。臨床研究顯示，p21基因mRNA表達水平腫瘤患者高于非腫瘤患者，提出p21基因的高表達可能與肝細胞肝癌有一定關系，可為篩檢肝細胞肝癌高危人群提供參考依據[21]。因此認為本研究中p21基因在肝組織中的表達上調與肝癌的發生和發展有著密切的關系。本研究組前期的免疫組織化學結果也顯示，對照肝癌組及異黑肝癌組p21基因表達水平顯著高于正常組，與異黑肝癌組相比成熟劑不同劑量給藥組p21基因的表達均下調，且提出異常黑膽質成熟劑可能通過影響p21基因的表達起抗肝癌作用的結論[22]，與本次試驗結果一致。

維吾爾醫學體液論是維吾爾醫學認識人體結構、生理功能、病理現象以及進行診斷和治療的理論基礎。維吾爾醫學體液論認為異常黑膽質證是慢性病理生理狀態，是腫瘤等疑難復雜性疾病的共同特點[23]。根據維醫臨床治療經驗，異常黑膽質型腫瘤、哮喘等復雜性疾病常用異常黑膽質成熟劑進行治療。在前期異常黑膽質型肝癌病證動物模型的研究中發現，異常黑膽質證能促進肝硬化的發生和發展，并且在造模20周時，異常黑膽質型肝癌病證動物模型組和對照肝癌組大鼠肝臟均發生癌變，且成癌率前者明顯高于后者[4]；研究還發現在該動物模型中異常黑膽質成熟劑防止肝硬化和肝癌的發生發展[24]，但其作用的分子機制尚不清楚。因此，本研究在前期研究的基礎上[3-4，24]建立了異常黑膽質型肝癌模型并用基因芯片技術篩選出肝組織差異表達的候選基因，用RT-qPCR法進行驗證結果顯示，異常黑膽質型肝癌病證大鼠模型肝組織Id4和p21基因表達水平與對照肝癌組相比存在差異，說明異常黑膽質證能促進肝癌的發生和發展，而異常黑膽質成熟劑可能通過調控Id4和p21基因的mRNA表達水平起抗肝癌作用。endprint

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（收稿日期：2017-07-17 本文編輯：李岳澤）endprint